Protokolla, jossa käytetään Hielscherin moninäyteisiä sonikaattoreita biofilmi- ja proteomiikka-analyysissä

Moninäytteisten sonikaattoreiden, kuten VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja UIP400MTP Microplate Sonicator, käyttö virtaviivaistaa laboratorion työnkulkuja korkean suorituskyvyn sovelluksissa. Molemmat laitteet mahdollistavat tarkan ja yhtenäisen ultraäänikäsittelyn useissa näytteissä, minimoimalla vaihtelun ja parantamalla toistettavuutta. Tämä on erityisen hyödyllistä kokeissa, jotka edellyttävät jatkuvaa näytteen analysointia, biofilmin irtoamista, proteiinien uuttamista tai proteolyyttistä pilkkomista, kun manuaaliset tai yhden näytteen menetelmät ovat vähemmän tehokkaita ja alttiita epäjohdonmukaisuudelle.

Virtaviivaista työnkulkuja moninäytteisillä sonikaattoreilla

Esimerkiksi UIP400MTP mahdollistaa mikrolevykaivojen samanaikaisen ultraäänikäsittelyn, mikä varmistaa biofilmien tai solumateriaalin tasaisen irtoamisen. Samaan aikaan VialTweeter tarjoaa useiden putkinäytteiden tarkan lyysin ja homogenoinnin ilman ristikontaminaatiota. Nämä sonikaattorit lyhentävät merkittävästi käsittelyaikoja, parantavat kokeellista toistettavuutta ja ylläpitävät korkeaa näytteen eheyttä, mikä tekee niistä välttämättömiä työkaluja mikrobiologian, proteomiikan ja molekyylibiologian tutkimuksessa.
Alla on yksityiskohtainen protokolla, joka on esimerkki Hielscherin moninäytteisten sonicator-mallien, VialTweeter Multi-Tube Sonicatorin ja Microplate Sonicator UIP400MTP: n käytöstä tutkimuksessa, johon liittyy E. coli -biofilmin muodostuminen ja sitä seuraava proteomiikka-analyysi.

Protokolla: Biofilmin muodostuminen, irtoaminen ja proteomiikka-analyysi Hielscherin moninäytesonikaattoreilla

1. Bakteeriviljelmän valmistelu

• Viljellään E. coli -bakteereja (kanta W3110) 30 °C:ssa, E. coli -biofilmin muodostumiselle suotuisassa lämpötilassa, tryptoniliemessä (TB) liemessä, joka sisältää:
  – 10 g/l tryptoni
  – 5 g/l NaCl
• Täydennä antibiooteilla tarpeen mukaan plasmidin pidätyksen varmistamiseksi.
• Mikroskopia- ja promoottoriaktiivisuustutkimuksissa käytetään W3110 E. coli -kantaa genomisella tehostetun GFP:n (eGFP) raportoijalla rplL-promoottorin valvonnassa.
• Käytä GFP-reportteriplasmideita eri promoottorien käyttöön (esim. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) hankkeen toteuttajien toimien mittaamiseksi.

2. Biofilmin viljely ja irtoaminen

• Kylvä 1,5 ml laimennettua bakteeriviljelmää kuoppaa kohti 12-kuoppaiseen levyyn (CellStar 12-kuoppalevyt, Greiner Bio-One).
• Inkuboidaan biofilmin muodostumisen mahdollistamiseksi.
• Poista planktoninen (tarttumaton) viljelmä varovasti.

– Jokainen kuoppa pestään 500 μl:lla PBS:ää.
– Irrota kiinnitetyt solut sonikoimalla 12-kuoppainen levy UIP400MTP mikrolevyn sonikaattorissa. UIP400MTP varmistaa tasaisen irtoamisen tuottamalla johdonmukaista ultraäänienergiaa kaikissa kaivoissa.
– Sonikaatioasetukset: 60% amplitudi, syklitila: 60 sekuntia päälle / 30 sekuntia pois.

3. Solujen kerääminen ja hajoaminen

• Sentrifugoidaan irronneita biofilmisoluja 4 500 g:ssa 5 minuutin ajan.
• Pestään pelletoidut kennot PBS:llä.
• Solut suspendoidaan uudelleen 100 μl:aan 2-prosenttista natriumlauroyylisarkosinaattia (SLS) ja inkuboidaan 95 °C:ssa 15 minuutin ajan.
• Sonikoidaan käyttämällä VialTweeter Multi-Tube Sonicator -laitetta täydellisen solulyysin varmistamiseksi.
  – Sonikaatioasetukset: 100% amplitudi, 50 s ON / 10 s OFF 10 minuutin kokonaiskäyttöajaksi; Pidä näytteet jäällä.

4. Pelkistys ja alkylointi

• Lisätään 5 mM Tris(2-karboksietyyli)fosfiinia (TCEP) disulfidisidosten vähentämiseksi ja inkuboidaan 95 °C:ssa 15 minuuttia.
• Alkylaattiproteiinit 10 mM jodoasetamidilla 30 minuutin ajan 25 °C:ssa.

5. Proteiinien kvantifiointi ja pilkkominen

• Sentrifugoi lysaatit roskien poistamiseksi.
• Määritä proteiinin kokonaispitoisuus käyttämällä Pierce BCA Protein Assay Kit -sarjaa.
• Pilkotaan 50 μg proteiinia yhteensä 1 μg:lla trypsiiniä liuoksessa, joka sisältää 2 % SLS:ää ja 100 mM ammoniumbikarbonaattia.
• Inkuboidaan mädätysreaktiota yön yli 30 °C:ssa.

6. Peptidien puhdistus

• Saostetaan SLS lisäämällä 1,5 % trifluorietikkahappoa (TFA) ja sentrifugoimalla.
• Puhdista peptidit C18-mikrospin-kolonneilla.
• Kuivaa puhdistetut peptidit ja suspendoi uudelleen 0,1% TFA: han.

7. Nestekromatografia-massaspektrometria (LC-MS/MS)

• Analysoi peptidit Q-Exactive Plus -massaspektrometrillä yhdistettynä Ultimate 3000 RSLC -nanojärjestelmään.
• Peptidit erotetaan käänteisfaasisella HPLC-kolonnilla (75 μm × 42 cm), joka on pakattu C18-hartsilla (2,4 μm).
• Levitä gradientti 2% - 35% liuotin B (asetonitriili 0,15% muurahaishapolla) 140 minuutin ajan.
• Hanki tietoja käyttämällä korkean resoluution MS-skannauksia, joita seuraa tandem MS / MS-skannaukset 10 voimakkaimmasta ionista.

8. Tietojen analysointi

• Käsittele käsittelemätöntä LC-MS-dataa Progenesis-ohjelmistolla.
• Vie .mgf-tiedostoja ja analysoi niitä MASCOTilla.
• Suorita peptidikvantifiointi SafeQuantilla laadunvalvontaa ja väärän löydön säätöä varten.
• Suorita kaikki kokeet kahtena tai kolmena kappaleena toistettavuuden varmistamiseksi.

Moninäytteiset sonikaattorit korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen

Moninäytteiset sonikaattorimallit VialTweeter ja UIP400MTP parantavat merkittävästi kokeellisten työnkulkujen tarkkuutta ja tehokkuutta, erityisesti biofilmitutkimuksessa ja proteomiikassa. Niiden kyky käsitellä useita näytteitä yhdenmukaisesti takaa suuren läpimenokapasiteetin tietojen laadusta tinkimättä. Nämä edut yhdistettynä edellä kuvattuihin virtaviivaistettuihin työnkulkuihin tekevät Hielscherin moninäytteisistä sonikaattoreista välttämättömiä työkaluja nykyaikaiseen biologiseen tutkimukseen.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa

Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.