Menetelmä Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitteiden käyttöön biofilmi- ja proteomiikka-analyyseissä

Usean näytteen ultraäänilaitteiden, kuten VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja UIP400MTP Microplate Sonicator, käyttö sujuvoittaa laboratorion työnkulkuja suurta näytteenkäsittelykapasiteettia vaativissa sovelluksissa. Molemmat laitteet mahdollistavat useiden näytteiden tarkan ja tasaisen ultraäänikäsittelyn, mikä minimoi vaihtelun ja parantaa toistettavuutta. Tämä on erityisen hyödyllistä kokeissa, joissa tarvitaan yhdenmukaista näytteiden lyysiä, biofilmin irrotusta, proteiinien uuttoa tai proteolyyttistä pilkkomista ja joissa manuaaliset tai yhden näytteen menetelmät ovat tehottomampia ja alttiita epäjohdonmukaisuudelle.

Sujuvoita työnkulkuja usean näytteen ultraäänilaitteilla

Esimerkiksi UIP400MTP mahdollistaa mikrolevyn kuoppien samanaikaisen ultraäänikäsittelyn ja varmistaa biofilmien tai solumateriaalin tasaisen irtoamisen. VialTweeter puolestaan mahdollistaa useiden putkinäytteiden tarkan lyysin ja homogenisoinnin ilman ristikontaminaatiota. Nämä ultraäänilaitteet lyhentävät käsittelyaikoja merkittävästi, parantavat kokeiden toistettavuutta ja säilyttävät näytteiden eheyden korkealla tasolla, joten ne ovat korvaamattomia työkaluja mikrobiologian, proteomiikan ja molekyylibiologian tutkimuksessa.
Alla on yksityiskohtainen menetelmä, joka havainnollistaa Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitemallien VialTweeter Multi-Tube Sonicator ja Microplate Sonicator UIP400MTP käyttöä tutkimuksessa, jossa tarkastellaan E. coli -biofilmin muodostumista ja tehdään sen jälkeen proteomiikka-analyysi.

Menetelmä: biofilmin muodostuminen, irrotus ja proteomiikka-analyysi Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitteilla

1. Bakteeriviljelmän valmistelu

• Viljele E. coli -bakteereja (kanta W3110) 30°C:ssa, joka on E. coli -biofilmin muodostumiselle suotuisa lämpötila, tryptoniliemi (TB) -kasvatusalustassa, joka sisältää:
  – 10 g/L tryptonia
  – 5 g/L NaCl
• Lisää tarvittaessa antibiootteja plasmidin säilymisen varmistamiseksi.
• Käytä mikroskopia- ja promoottoriaktiivisuustutkimuksissa E. coli -kantaa W3110, jossa on rplL-promoottorin säätelemä genomiin sijoitettu tehostetun GFP:n (eGFP) reportteri.
• Käytä eri promoottorien GFP-reportteriplasmideja (esim. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) promoottorien aktiivisuuden mittaamiseen.

2. Biofilmin kasvatus ja irrotus

• Siirrosta 12-kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan 1,5 mL laimennettua bakteeriviljelmää (CellStar 12-kuoppalevyt, Greiner Bio-One).
• Inkuboi, jotta biofilmi voi muodostua.
• Poista planktoninen (kiinnittymätön) viljelmä varovasti.

– Pese jokainen kuoppa 500 µL:lla PBS:ää.
– Irrota kiinnittyneet solut käsittelemällä 12-kuoppalevy ultraäänellä mikrolevyultraäänilaitteessa UIP400MTP. UIP400MTP varmistaa tasaisen irtoamisen välittämällä kaikkiin kuoppiin yhdenmukaisesti ultraäänienergiaa.
– Ultraäänikäsittelyn asetukset: amplitudi 60%, jaksotila: 60 sec PÄÄLLÄ / 30 sec POIS.

3. Solujen keräys ja lyysi

• Sentrifugoi irrotettuja biofilmisoluja 4 500 g:n voimalla 5 minuutin ajan.
• Pese solupelletti PBS:llä.
• Suspendoi solut uudelleen 100 µL:aan 2%:sta natriumlauroyylisarkosinaattia (SLS) ja inkuboi 95°C:ssa 15 minuutin ajan.
• Käsittele ultraäänellä käyttäen laitetta VialTweeter Multi-Tube Sonicator solujen täydellisen lyysin varmistamiseksi.
  – Ultraäänikäsittelyn asetukset: amplitudi 100%, 50 s PÄÄLLÄ / 10 s POIS, kokonaiskäyttöaika 10 min; pidä näytteet jäillä.

4. Pelkistys ja alkylointi

• Lisää 5 mM tris(2-karboksietyyli)fosfiinia (TCEP) disulfidisidosten pelkistämiseksi ja inkuboi 95°C:ssa 15 minuutin ajan.
• Alkyloi proteiineja 10 mM jodiasetamidilla 30 minuutin ajan 25°C:ssa.

5. Proteiinien määritys ja pilkkominen

• Sentrifugoi lysaatit solujätteiden poistamiseksi.
• Määritä kokonaisproteiinipitoisuus Pierce BCA Protein Assay Kit -määrityspakkauksella.
• Pilko 50 µg kokonaisproteiinia 1 µg:lla trypsiiniä liuoksessa, joka sisältää 2% SLS:ää ja 100 mM ammoniumbikarbonaattia.
• Inkuboi pilkkomisreaktiota yön yli 30°C:ssa.

6. Peptidien puhdistus

• Saosta SLS lisäämällä 1,5% trifluorietikkahappoa (TFA) ja sentrifugoi sitten.
• Puhdista peptidit C18-mikrosentrifugipylväillä.
• Kuivaa puhdistetut peptidit ja suspendoi ne uudelleen 0,1%:seen TFA:han.

7. Nestekromatografia–massaspektrometria (LC-MS/MS)

• Analysoi peptidit Q-Exactive Plus -massaspektrometrillä, joka on kytketty Ultimate 3000 RSLC nano -järjestelmään.
• Erottele peptidit käänteisfaasi-HPLC-pylväällä (75 µm × 42 cm), joka on pakattu C18-hartsilla (2,4 µm).
• Käytä 140 minuutin gradienttia, jossa liuottimen B (asetonitriili, jossa on 0,15% muurahaishappoa) osuus kasvaa 2%:sta 35%:iin.
• Kerää dataa korkean erotuskyvyn skannauksilla (MS), joita seuraavat 10 intensiteetiltään voimakkaimman ionin tandemskannaukset (MS/MS).

8. Data-analyysi

• Käsittele LC-MS -raakadata käyttämällä ohjelmistoa Progenesis.
• Vie .mgf-tiedostot ja analysoi ne MASCOTilla.
• Tee peptidien kvantifiointi SafeQuantilla laadunvalvontaa ja väärien löydösten korjausta varten.
• Tee kaikki kokeet kahtena tai kolmena rinnakkaisena toistettavuuden varmistamiseksi.

Usean näytteen ultraäänilaitteet suuren näytteenkäsittelykapasiteetin näytteenvalmisteluun

Usean näytteen ultraäänilaitemallit VialTweeter ja UIP400MTP parantavat merkittävästi kokeellisten työnkulkujen tarkkuutta ja tehokkuutta erityisesti biofilmitutkimuksessa ja proteomiikassa. Niiden kyky käsitellä useita näytteitä tasaisesti varmistaa suuren näytteenkäsittelykapasiteetin datan laadusta tinkimättä. Nämä edut yhdessä edellä kuvattujen sujuvoitettujen työnkulkujen kanssa tekevät Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitteista välttämättömiä työkaluja nykyaikaisessa biologisessa tutkimuksessa.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscherin ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscherin ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät uusin teknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscherin ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL:n, CSA:n ja RoHs:n vaatimukset.