Bakteerinäytteiden solujen hajottaminen ultraäänellä
Bakteerinäytteet saapuvat harvoin todellisina yksisoluisten solujen suspensioina. Viljelmät kasvavat ketjuina ja flokkeina, ympäristöstä eristetyt bakteerit muodostavat aggregaatteja, joita sitovat solunulkoiset polymeeriset aineet, ja sentrifugoidut pelletit eivät usein liukene uudelleen huolellisesta vortex-sekoituksesta huolimatta. Elävien solujen laskennassa, optisessa tiheydessä, virtaussytometriassa ja mikrobiomiprofilointissa oletetaan, että yksi hiukkanen vastaa yhtä solua. Ultraäänikäsittely ratkaisee tämän ristiriidan: lyhyet, hallitut ultraäänipurskeet hajottavat aggregaatit yksittäisiksi soluiksi niitä hajottamatta.
Miksi solujen kasautuminen vääristää tuloksia
Aggregaatio on biologinen ilmiö, ei valmistusvirhe. Stafylokokit, streptokokit, laktobasillit, aktinomykeetit ja monet ympäristöstä peräisin olevat lajit kasvavat ketjuina, ryppäinä tai biofilmin palasina, ja solunulkoinen DNA sekä polysakkaridit sitovat solut yhteen pelleteiksi ja pyyhkäisynäytteiden eluaateiksi. Tällä on systemaattisia vaikutuksia analyysin tuloksiin:
- Pesäluvut ovat aliarvioituja, koska yksi rypäs muodostaa yhden pesän riippumatta siitä, kuinka monta solua se sisältää.
- Optinen tiheys ja hiukkaslaskurit mittaavat aggregaatteja solujen sijaan, mikä vääristää kasvukäyriä.
- Virtaussytometria ja solujen lajittelu laskevat kasautuneet tapahtumat väärin ja jättävät ne pois analyysistä.
- DNA:n ja proteiinien eristyksissä otetaan huomioon vain aggregaatin pinnalla olevat solut, mikä vääristää mikrobiomi- ja omiikka-aineistoja.
Perinteiset menetelmät ovat hitaita, epätäydellisiä tai muuttavat aineen kemiallista koostumusta. Voimakas pipetointi ja vortex-sekoitus jättävät jälkeensä mikroaggregaatteja. Entsymaattinen tai kelatoijapohjainen dispergointi muuttaa solun pintaa, jota mahdollisesti aiot analysoida. Hallitun kavitaation avulla tapahtuva mekaaninen hajottaminen toimii sekunneissa eikä vaadi lisäaineita.
Yksi aggregaatti vastaa yhtä pesää – ja yksi virheellinen tulos. Katso, kuinka ultraäänipuhdistus tuottaa aitoja yksisolu-suspensioita ilman solujen hajoamista, aerosolien muodostumista tai anturin käsittelyä. Pyydä lisätietoja!
Multi-Tube Sonicator VialTweeteri kosketuksettomaan näytteenvalmistukseen: Hajota solupalat suljetuissa putkissa
Miten ultraäänikäsittely hajottaa soluja niitä tuhoamatta
Ultraäänipohjaisessa solujen hajottamisessa hyödynnetään mekaanisen lujuuden eroa. Bakteerikertymiä pitävät yhdessä suhteellisen heikot solujen väliset sidokset ja solunulkoinen matriisi, kun taas ehjä solukalvo kestää huomattavasti suurempaa leikkausvoimaa. Kun kalibroitu ultraääni kohdistuu suspensioon, akustinen kavitaatio synnyttää mikrovirtauksia, painepulsseja ja leikkausvoimia, jotka vaikuttavat ensisijaisesti aggregaattien rajapintoihin. Kokkareet, ketjut ja biofilmin fragmentit leikkautuvat irti toisistaan (deagglomeraatio) ennen kuin saavutetaan energiataso, jolla solukalvot repeävät (lyysi).
Bakteerisolukertymien hajottaminen ultraäänellä
Hajottaminen tai hajoaminen – Miten ultraäänikäsittelyn parametrit vaikuttavat
Käytännön seurauksena on, että hajottaminen ja solujen hajottaminen ovat samaa laitetta, jota käytetään eri parametreilla. Kohtuullisella amplitudilla, lyhyillä pulssisykleillä ja säädetyllä lämpötilalla saadaan elinkelpoinen yksisoluinen suspensio. Amplitudin, altistusaikojen tai näytteen lämpötilan nostaminen siirtää prosessia kohti solujen täydellistä hajoamista solunsisäisten kohteiden saavuttamiseksi. Hielscher-generaattoreilla voit asettaa amplitudin, tehon, pulssin ja energian syötön tarkasti sekä tallentaa menetelmän, jolloin hajotusvaihe on toistettavissa eri näytteiden, käyttäjien ja ajojen välillä.
Tehokas kosketukseton ultraäänikäsittely
Kylpyultraäänikäsittely ei pysty vastaamaan tähän tarkkuuteen. Ultraäänipesualtaat ja -säiliöt tuottavat vain vähäistä ultraäänienergiaa, mikä johtaa epätäydelliseen esikäsittelyyn, ja kavitaatio tapahtuu epätasaisesti, joten jokainen putki käsitellään sen sijainnin mukaan altaassa. VialTweeter välittää voimakkaita, kohdennettuja ultraäänivoimia suoraan astian seinämän läpi jopa 10 suljettuun näytteeseen samanaikaisesti. Käsittelyt, jotka vaativat pitkää, vaihtelevaa altistumista kylvyssä, suoritetaan standardoidulla pulssikuvioinnilla.
Hielscherin kosketuksettomat ultraäänilaitteet tuottavat voimakasta, kohdennettua ultraääntä suljettujen pullojen seinämien läpi. VialTweeter käsittelee jopa 10 pulloa samanaikaisesti samalla voimakkuudella ilman, että näytteeseen joudutaan upottamaan anturia, ilman ristikontaminaatiota ja ilman aerosolipäästöjä. Kun käsittelykapasiteetti sitä vaatii, UIP400MTP- ja UIP550MTP-mikrolevyultraäänilaitteet laajentavat saman hallitun energiansiirron monikuoppalevyihin.
The VialTweeter sonikoi jopa 10 pienempää injektiopulloa ja jopa 5 suurempaa koeputkea samanaikaisesti.
Kosketuksettoman ultraäänipuhdistuksen edut
- Ei lainkaan ristikontaminaatiota: Koska näytepullot pysyvät pysyvästi suljettuina eikä näytteeseen upoteta mitään mittausanturia, ristikontaminaatio ja näytteen hävikki vältetään kokonaan. Näytteiden välillä ei tarvitse steriloida mitään, eikä yksi mittauskerta vaikuta seuraavaan.
- Aerosolisuojaus: Avoimella ultraäänikäsittelyllä syntyy tarttuvia aerosoleja ja laitteiden pinnat saastuvat. Suljetussa pullossa tapahtuvassa ultraäänikäsittelyssä näyte pysyy oman putkensa sisällä, mikä on tärkeää käsiteltäessä patogeenisiä bakteereja, kuten Mycobacterium tuberculosis -bakteeria, sekä muita BSL-2- tai BSL-3-luokan taudinaiheuttajia.
- Ei tippien menetystä: Titaanikärjet voivat vapauttaa näytteeseen pienen määrän mikrohiukkasia käytön aikana. Nämä hiukkaset vaikuttavat optiseen tiheyteen ja hiukkasmääriin prosessin loppupäässä. Epäsuora ultraäänikäsittely astian seinämän läpi poistaa tämän kiintoaineiden lähteen kokonaan.
- Tasainen läpimenonopeus: VialTweeter tuottaa saman ultraäänitehon jopa 10 pulloon, joten ultraäänikäsittelyn tulokset ovat tasaisia ja toistettavissa. Kylpyissä ja yksittäisten näytteiden ultraäänikäsittelyssä esiintyvät sijaintivaikutukset häviävät, ja perusviivat pysyvät vertailukelpoisina toistojen välillä.
- Näytteen eheys: Putket pysyvät suljettuina koko käsittelyn ajan, joten näyte ei voi saastua, pilaantua tai haihtua. Pieniä näytemääriä voidaan käsitellä ilman laimentamista, mukaan lukien arvokkaat kliiniset pelletit, joiden kohdalla ylimääräistä siirtovaihetta ei voida sallia.
- Prosessinohjaus: Amplitudia voidaan säätää välillä 20–100 %, pulssitilaa välillä 0–100 %, ja järjestelmät tukevat lämpötilan seurantaa, jotta lämpöherkät kannat ja proteiinit pysyvät vahinkoa aiheuttavien raja-arvojen alapuolella.
Tyypilliset sovellukset
- Mikrobiomin ja suoliston sisällön analysointi: Lactobacillus- ja Bifidobacterium-bakteerien sekä ulostenäytteiden hajottaminen ennen viljelyä tai sekvensointia, jotta tiheyslukemat eivät alene klusterien vuoksi.
- Elintarvikkeiden ja veden mikrobiologia: flokkien hajottaminen näytteistä, huuhteluvedestä ja rikastusliemistä pesäkkeiden ja elinkelpoisuuden tarkan määrittämisen varmistamiseksi.
- Biofilmitutkimus: solujen eristäminen kantajista ja pinnoilta yksisoluisten suspensioiden muodossa ilman entsymaattista käsittelyä, joka poistaisi pintaproteiinit.
- Kliininen diagnostiikka: ysköksen, mädän ja pyyhkäisynäytteiden liuottaminen suojatiloissa.
- Soluviljely: nisäkkäiden, hyönteisten ja CHO-solujen kasautumien erottaminen ennen laskemista ja siirtoa.
- Koko työnkulun valmistelu: sama laite, joka hajottaa soluja pienellä amplitudilla, suorittaa täydellisen solujen hajottamisen suuremmilla asetuksilla, joten solujen hajottaminen, proteiinin uuttaminen ja DNA:n fragmentointi tapahtuvat ilman näytteiden siirtämistä putkesta toiseen.
Monikuoppalevyjen kaikuluotain UIP400MTP solukokkareiden tehokkaaseen hajottamiseen
UIP400MTP- ja UIP550MTP-mikrolevyultraäänikäsittelylaitteet eivät sovellu ainoastaan monikuoppalevyihin, vaan ne käsittelevät myös putkitelineitä.
Löydä oikea ultraäänilaite hajotustyöprosessiisi
VialTweeter moniputkinen sonikaattori
Paras menetelmä steriilien, suljettujen pullojen hajottamiseen. Laitetta ohjaa 200 watin tehoinen UP200St-prosessori, joka toimii 26 kHz:n taajuudella automaattisella virityksellä. VialTweeter lähettää ultraääntä epäsuorasti jopa 10 suljetun pullon seinämien läpi samanaikaisesti, jopa 10 W:n teholla pulloa kohti, mikä takaa tasaiset ja toistettavat tulokset ilman ristikontaminaatiota tai näytteen menetystä. Titaaninen VialTweeter-sonotrodi on autoklavoitava, ja sen amplitudi ja pulssi ovat säädettävissä ja tallennettavissa, mikä kattaa agglomeraation hajottamisprotokollan edellyttämän säätöalueen. Vakioinen 10-paikkainen sonotrodi sopii automaattisen näytteenottimen pulloille, mikrotsentrifugiputkille sekä 1–5 ml:n Eppendorf- tai Nunc-putkille. VialPress-kiinnityslaite käsittelee jopa viittä suurempaa astiaa, joiden halkaisija on enintään 20 mm.
Falcon-putkille ja astian koon mukaan räätälöityihin yksittäisiin pulloihin on saatavilla erityisiä yksiputkisia VialTweeter-malleja. Irrota lohko-sonotrodi, jolloin UP200St-ydinyksikkö toimii tavanomaisena koettimellisena ultraäänikäsittelylaitteena pienten ja keskikokoisten näytteiden suoraan käsittelyyn.
Mikrolevy-ultraäänilaitteet
Laajenna näytteiden valmisteluun suureen läpimenoon monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelyn avulla: Levyperusteisissa työnkuluissa mikrolevy-ultraäänikäsittelylaitteet UIP400MTP ja UIP550MTP laajentavat kosketuksettoman ja tasaisen ultraäänikäsittelyn kymmenestä putkesta koko levyyn.
400 watin tehoinen UIP400MTP-laite käsittelee tavallisia mikrotitraus- ja monikuoppalevyjä, mukaan lukien 96-kuoppaiset mallit, ja siinä on tarkka amplitudin, tehon ja pulssin säätö sekä ajastin, lämpötila-anturi ja vesihauteen jäähdytys. Biofilmin irrottaminen ja bakteeriviljelmien käsittely ovat UIP400MTP-mikrolevyultraäänikäsittelylaitteen vakiintuneita käyttökohteita.
550 watin UIP550MTP on tehokkaampi vaihtoehto – sopii erinomaisesti vaativimpiin käyttökohteisiin.
Molemmat kosketuksettomat ultraäänikäsittelyjärjestelmät käsittelevät luotettavasti 6-, 12-, 24-, 48-, 96- ja 384-kuoppalevyjä sekä putkitelineitä ja petrimaljoja. Hielscherin mikrolevyultraäänilaitteet toimivat minkä tahansa vakiomallisen levyn kanssa, jolloin vältytään kalliilta valmistajakohtaisilta kulutustarvikkeilta. Ohjelmoitavien lämpötilarajojen ansiosta ultraäänikäsittely keskeytyy automaattisesti näytteen maksimilämpötilassa ja jatkuu jäähtymisen jälkeen, mikä turvaa solujen elinkelpoisuuden toistuvissa sykleissä. Älykäs ja luotettava suurikapasiteettinen näytteiden esikäsittely toistettavien tulosten saavuttamiseksi.
Seuraavassa taulukossa on yhteenveto laboratoriokäyttöön tarkoitettujen ultraäänilaitteidemme arvioidusta käsittelykapasiteetista, joita käytetään biotieteissä, genomiikassa, proteomiikassa ja diagnostiikassa:
| Suositellut laitteet | Erän tilavuus | Virtausnopeus |
|---|---|---|
| VialTweeter moniputkinen sonikaattori | 00,5–1,5 ml:n ampullit | n.a. |
| UIP400MTP-monikuoppalevyn ultraäänikäsittelylaite (440 wattia) | monikuoppa- / mikrotiitterilevyt | n.a. |
| UIP550MTP-monikuoppalevyn ultraäänikäsittelylaite (550 wattia) | monikuoppa- / mikrotiitterilevyt | n.a. |
| Ultraääni CupHorn | CupHorn injektiopulloille tai dekantterilasille | n.a. |
| UP100H 100 watin anturityyppinen ultraäänilaite | 1 - 500 ml | 10 - 200 ml / min |
| UP200Ht, UP200St 200 watin anturityyppiset ultraäänikäsittelylaitteet | 10 - 1000ml | 20–200 ml/min |
| UP400St 400 watin anturityyppinen ultraäänilaite | 10 - 2000ml | 20–400 ml/min |
| GDmini2 | steriili ultraäänimikrovirtausreaktori | n.a. |
| Ultraääniseulan ravistin | n.a. | n.a. |
Usein kysyttyjä kysymyksiä solujen hajottamisesta ultraäänellä
Mikä ero on solujen hajottamisella ja solujen hajoamisella?
Disaggregaatio, jota kutsutaan myös deagglomeraatioksi, hajottaa kasautuneet solut yksisoluisten solujen suspensioksi siten, että solut pysyvät ehjinä ja elinkelpoisina. Lysyys rikkoo solukalvon ja vapauttaa solunsisäisen sisällön. Molempia prosesseja ohjaa kavitaatioleikkausvoima, ja ero on energian syötössä. Optimoiduilla amplitudin, pulssin ja lämpötilan asetuksilla ultraäänikäsittely saavuttaa disaggregaation lysyysrajan alapuolella.
Miksi ultraäänikylpyjä ei voida käyttää standardoituun hajottamiseen?
Kylpylaitteet tuottavat vain vähän ultraäänienergiaa, mikä johtaa epätäydelliseen esikäsittelyyn, ja kavitaatio kehittyy säiliössä hyvin epätasaisesti, joten jokainen näyte saa erilaisen käsittelyn sijaintinsa mukaan. Mikrobiologiset laskelmat ja vertailututkimukset edellyttävät vertailukelpoisuutta. Kosketuksettomat ultraäänikäsittelylaitteet, kuten Multi-Tube Sonicator VialTweeter sekä mikrolevy-ultraäänikäsittelylaitemallit UIP400MTP ja UIP550MTP, käsittelevät kaikki astiat säädetyissä ultraäänisolosuhteissa, mikä parantaa toistettavuutta toistojen välillä.
Voiko ultraäänikäsittely vahingoittaa soluja?
Kyllä, jos parametreja ei hallita. Liiallinen ultraäänikäsittely tai hallitsematon lämpeneminen voi vahingoittaa soluja, ja vapautunut DNA tekee näytteistä viskooseja ja edistää uudelleenaggregaatiota. Siksi prosessi on kehitettävä huolellisesti: kohtuullinen amplitudi, pulssimaiset syklit, jäähdytys ja lämpötilarajoitetut laitteet pitävät käsittelyn käyrän hajotuspuolella.
Kaikissa Hielscherin digitaalisissa ultraäänilaitteissa on tarkasti säädettävät parametrit, liitettävät lämpötila-anturit, ohjelmoitavat asetukset ja automaattinen tiedonkeruu, mikä takaa luotettavan näytteenvalmistuksen.
Pitääkö näyte siirtää toiseen astiaan?
Ei. Pullot ja levyt käsitellään alkuperäisissä, suljetuissa pakkauksissaan. Epäsuora ultraäänikäsittely estää sekä siirron yhteydessä syntyvät häviöt että anturin käsittelyyn liittyvän siirtymän.
Minkälaisia ampullimuotoja VialTweeter pystyy käsittelemään?
Vakioinen 10-paikkainen sonotrodi sopii automaattisen näytteenottimen pulloille, mikrotsentrifugiputkille sekä 1–5 ml:n Eppendorf- tai Nunc-putkille. VialPress-lisälaitteeseen mahtuu enintään 5 suurempaa astiaa, joiden halkaisija on enintään 20 mm. Falcon-putkille sekä räätälöityihin yhden putken tai suurempiin formaatteihin on saatavilla erillisiä VialTweeter-malleja.
Voinko suorittaa erottelun ja solujen hajottamisen yhdellä laitteella?
Kyllä. Sama laitteisto, joka hajottaa solut kohtuullisella amplitudilla, hajottaa solut täydellisesti suuremmalla amplitudilla ja pidemmällä altistusaikalla, joten yksisoluinen suspensio ja sitä seuraava uuttaminen voidaan suorittaa peräkkäin ilman alustan vaihtoa.
Käytetäänkö ultraäänikäsittelyä MBEC-määrityksissä?
Ultraäänikäsittely on vakiintunut ja laajalti käytetty menetelmä. Peg-lid-MBEC-määrityksessä, kun biofilmit on kasvatettu polystyreenitapeilla ja altistettu antibiootille, tapit siirretään tuoreeseen elatusaineeseen ja niille suoritetaan vortex-sekoitus sekä ultraäänikäsittely, jotta kiinnittyneet biofilmisolut irtoavat ja hajoavat planktoniseksi suspensioksi ennen sarjalaimennusta ja elävien solujen laskemista (MBEC määritetään alhaisimpana pitoisuutena, joka vähentää talteenotettuja solumääriä vähintään 3 log10:llä verrattuna käsittelemättömään biofilmiin). Ultraäänikäsittely parantaa dispergoitumista merkittävästi: upotettujen solujen epätäydellinen irtoaminen EPS-matriisista johtaa hävittämisen aliarviointiin ja MBEC-arvojen yliarviointiin. Mikrolevysoonikattimella UIP400MTP suoritettu kohdennettu sonikaatio peg-pidikkeiden kuopissa koko määrityslevyn alueella korjaa perinteisen kylpysoonikointimenetelmän heikkoudet – nimittäin epätasainen energian jakautuminen, ylikuumeneminen sekä aerosoli- ja ristikontaminaatioriski.
Tutustu siihen, kuinka kontaktiton mikrolevy-ultraäänilaite UIP400MTP helpottaa MBEC-määritysten suorittamista!
Käytetäänkö ultraäänikäsittelyä MIC-määrityksissä?
Ultraäänikäsittelyä sovelletaan erilaisissa MIC-prosessiin liittyvissä työvaiheissa tehokkuuden ja toistettavuuden parantamiseksi:
- mykobakteriologia, jossa yskös ja muut viskoosiset näytteet puhdistetaan ja homogenisoidaan rutiininomaisesti – toisinaan ultraäänikäsittelyllä – ennen herkkyystestausta, ja klustereita muodostavat mykobakteeriviljelmät hyötyvät lyhyestä hajottamisesta tarkkojen MIC-arvojen saamiseksi;
- aggregaatioherkät organismit (esim. streptokokit, stafylokokit pelleteissä), joissa mikroaggregaatit vääristävät inokulaatin tiheyttä; ja
- yhdistelmädiagnostiikka, kuten implantin ultraäänipesu ja nesteviljely, jota seuraa herkkyystestaus tekoniveltulehduksen yhteydessä (MBEC-tyyppinen, ei perinteinen MIC-menetelmä).
Kirjallisuus / Viitteet
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Valitse oma lautasesi! Mikrolevy-ultraäänikäsittelylaite UIP550MTP erottaa bakteerinäytteet missä tahansa tavallisessa monikuoppalevyssä.
Hielscher Multi-Sample Sonicator -mallit UIP400MTP mikrolevyille, VialTweeter ja CupHorn: nopea ja suuriläpimittainen näytteiden valmistelu