Bakteerinäytteiden soluaggregaattien hajottaminen ultraäänellä
Bakteerinäytteet ovat harvoin todellisia yksittäissolususpensioita. Viljelmät kasvavat ketjuina ja flokkeina, ympäristöstä eristetyt kannat muodostavat solunulkoisten polymeeristen aineiden sitomia aggregaatteja, ja sentrifugoidut pelletit ovat usein vaikeita suspendoida uudelleen perusteellisesta vorteksoinnista huolimatta. Elinkykyisten solujen laskenta, optisen tiheyden mittaus, virtaussytometria ja mikrobiomin profilointi perustuvat kaikki oletukseen, että yksi hiukkanen vastaa yhtä solua. Soluaggregaattien hajottaminen ultraäänellä ratkaisee tämän ristiriidan: lyhyet, hallitut ultraäänipulssit erottavat aggregaatit yksittäisiksi soluiksi aiheuttamatta solujen lyysiä.
Miksi solujen aggregoituminen heikentää tulostesi luotettavuutta
Aggregoituminen on biologinen ominaisuus, ei näytteenvalmistuksen virhe. Staphylococcus-, Streptococcus-, Lactobacillus- ja Actinomyces-sukujen bakteerit sekä monet ympäristössä esiintyvät lajit kasvavat ketjuina, ryppäinä tai biofilmin fragmentteina, ja solunulkoinen DNA ja polysakkaridit liimaavat soluja yhteen pelleteissä ja pyyhkäisynäytteiden eluaateissa. Analyyttiset seuraukset ovat systemaattisia:
- Pesäkelukumäärät aliarvioidaan, koska yksi soluryppäs tuottaa yhden pesäkkeen riippumatta siitä, kuinka monta solua se sisältää.
- Optisen tiheyden mittaus ja hiukkaslaskurit ilmoittavat aggregaatteja solujen sijaan, mikä vääristää kasvukäyriä.
- Virtaussytometria ja solulajittelu laskevat soluryppäiden tuottamat tapahtumat väärin ja jättävät ne analyysin ulkopuolelle.
- DNA:n ja proteiinien uutto edustaa vain aggregaatin pinnalla olevia soluja, mikä vääristää mikrobiomi- ja omiikkatietoja.
Tavanomaiset ratkaisut ovat hitaita, puutteellisia tai aiheuttavat kemiallisia muutoksia. Voimakas pipetointi ja vorteksointi jättävät jäljelle mikroaggregaatteja. Entsymaattinen tai kelatoiviin aineisiin perustuva dispergointi muuttaa solupintaa, jota saatat haluta analysoida. Hallittuun kavitaatioon perustuva mekaaninen aggregaattien hajottaminen vaikuttaa sekunneissa eikä vaadi lisäaineita.
Yksi aggregaatti vastaa yhtä pesäkettä – ja yhtä väärää tulosta. Katso, miten aggregaattien hajottaminen ultraäänellä tuottaa todellisia yksittäissolususpensioita ilman lyysiä, aerosoleja tai ultraäänikärjen käsittelyä. Pyydä lisätietoja!
Usean putken ultraäänilaite VialTweeter kosketuksettomaan näytteenvalmistukseen: hajota soluryppäät suljetuissa putkissa
Miten ultraäänikäsittely hajottaa soluaggregaatit aiheuttamatta solujen lyysiä
Soluaggregaattien hajottaminen ultraäänellä hyödyntää mekaanisen lujuuden eroa. Bakteeriaggregaatteja pitävät koossa suhteellisen heikot solujen väliset sidokset ja solunulkoinen matriksi, kun taas ehjä soluvaippa kestää huomattavasti suurempaa leikkausrasitusta. Kun kalibroitu ultraääni siirtyy suspensioon, akustinen kavitaatio tuottaa mikrovirtauksia, painepulsseja ja leikkausvoimia, jotka vaikuttavat ensin aggregaattien rajapinnoilla. Soluryppäät, ketjut ja biofilmin fragmentit hajoavat leikkausvoimien vaikutuksesta (deagglomeraatio) ennen kuin saavutetaan energiataso, jolla solukalvot rikkoutuvat (lyysi).
Bakteerisoluryppäiden hajottaminen ultraäänellä
Aggregaattien hajottaminen vai lyysi – ultraäänikäsittelyn parametrien merkitys
Käytännössä tämä tarkoittaa, että aggregaattien hajottaminen ja lyysi tehdään samalla laitteella eri parametreilla. Kohtuullisella amplitudilla, lyhyillä pulssijaksoilla ja hallitussa lämpötilassa saadaan elinkykyinen yksittäissolususpensio. Amplitudin, altistusajan tai näytteen lämpötilan nostaminen ohjaa prosessia kohti täydellistä solujen hajotusta solunsisäisten kohteiden käsittelyä varten. Yrityksen Hielscher generaattoreilla voit asettaa amplitudin, tehon, pulssin ja energiansyötön tarkasti sekä tallentaa menetelmän, joten aggregaattien hajotusvaihe on toistettavissa eri näytteillä, käyttäjillä ja käsittelykerroilla.
Tehokas kosketukseton ultraäänikäsittely
Ultraäänikäsittely hauteessa ei tarjoa vastaavaa hallintaa. Ultraäänipesuhauteet ja -säiliöt tuottavat vain vähän ultraäänienergiaa, mikä johtaa puutteelliseen näytteenvalmistukseen. Lisäksi kavitaatio esiintyy epätasaisesti, joten kunkin putken käsittely riippuu sen sijainnista hauteessa. VialTweeter siirtää voimakkaita, keskitettyjä ultraäänivoimia suoraan astian seinämän läpi jopa 10 suljettuun näytteeseen samanaikaisesti. Käsittelyt, jotka vaativat hauteessa pitkän ja vaihtelevan altistuksen, tehdään vakioidulla pulssikuviolla.
Hielscherin kosketuksettomat ultraäänilaitteet kohdistavat voimakasta, keskitettyä ultraääntä suljettujen näytepullojen seinämien läpi. VialTweeter käsittelee samanaikaisesti jopa 10 näytepulloa samalla intensiteetillä ilman näytteeseen asetettavaa ultraäänikärkeä, ristikontaminaatiota tai aerosolien vapautumista. Kun tarvittava näytteiden käsittelykapasiteetti sitä edellyttää, mikrolevyjen ultraäänilaitteet UIP400MTP ja UIP550MTP ulottavat saman hallitun energiansiirron monikuoppalevyihin.
VialTweeter ultraäänikäsittelee samanaikaisesti jopa 10 pienempää näytepulloa ja jopa 5 suurempaa koeputkea.
Kosketuksettoman ultraääneen perustuvan aggregaattien hajottamisen edut
- Ei lainkaan ristikontaminaatiota: Koska näytepullot pysyvät koko ajan suljettuina eikä näytteeseen upoteta ultraäänikärkeä, ristikontaminaatio ja näytehävikki vältetään kokonaan. Näytteiden välillä ei tarvitse steriloida mitään, eikä yksi käsittelykerta voi vaikuttaa seuraavaan.
- Suoja aerosoleilta: Avoimessa astiassa tehtävä ultraäänikärkikäsittely tuottaa tartuntavaarallisia aerosoleja ja kontaminoi laitteiden pintoja. Suljetussa näytepullossa tehtävä ultraäänikäsittely pitää näytteen omassa putkessaan, mikä on merkityksellistä käsiteltäessä patogeenisia bakteereita, kuten Mycobacterium tuberculosis, ja muita BSL-2 tai BSL-3 -tason taudinaiheuttajia.
- Ei kärjen eroosiota: Titaanisista ultraäänikärjistä voi käytön aikana irrota näytteeseen pieni määrä mikrohiukkasia. Nämä hiukkaset muuttavat myöhemmissä vaiheissa mitattavaa optista tiheyttä ja hiukkaslukumääriä. Epäsuora ultraäänikäsittely astian seinämän läpi poistaa tämän kiintoaineiden lähteen kokonaan.
- Tasainen näytteiden käsittelykapasiteetti: VialTweeter kohdistaa saman ultraääni-intensiteetin jokaiseen jopa 10 näytepullosta, joten ultraäänikäsittelyn tulokset ovat tasaisia ja toistettavia. Hauteissa ja yksittäisten näytteiden ultraäänikärkikäsittelyssä ongelmia aiheuttavat sijaintivaikutukset poistuvat, ja lähtötasot pysyvät vertailukelpoisina rinnakkaisnäytteiden välillä.
- Näytteen eheys: Putket pysyvät suljettuina koko käsittelyn ajan, joten näyte ei voi kontaminoitua, pilaantua tai haihtua. Pieniä tilavuuksia voidaan käsitellä laimentamatta, myös arvokkaita kliinisiä pellettejä, joiden käsittelyyn ei voida lisätä ylimääräistä siirtovaihetta.
- Prosessin hallinta: Amplitudia voidaan säätää välillä 20–100 % ja pulssitilaa välillä 0–100 %. Järjestelmät tukevat lämpötilan seurantaa, joten lämpöherkkien kantojen ja proteiinien lämpötila pysyy vaurioitumiskynnysten alapuolella.
Tyypilliset käyttökohteet
- Mikrobiomin ja suolensisällön analyysi: Lactobacillus- ja Bifidobacterium-bakteerien sekä ulostenäytteiden dispergointi ennen maljausta tai sekvensointia, jotta soluryppäät eivät pienennä laskentatuloksia.
- Elintarvike- ja vesimikrobiologia: flokkien hajottaminen pyyhkäisynäytteissä, huuhtelunesteissä ja rikastusliemissä pesäkelukumäärän ja elinkykyisyyden tarkkaa määritystä varten.
- Biofilmitutkimus: solujen talteenotto kantajista ja pinnoilta yksittäissolususpensioina ilman entsymaattista käsittelyä, joka poistaisi pintaproteiineja.
- Kliininen diagnostiikka: ysköksen, märän ja pyyhkäisynäytteiden eluaattien uudelleensuspendointi olosuhteissa, joissa näytteen leviäminen ympäristöön on estetty.
- Soluviljely: ryppäiksi muodostuneiden nisäkäs-, hyönteis- ja CHO-soluaggregaattien erottaminen ennen laskentaa ja jatkoviljelyä.
- Koko työnkulun näytteenvalmistus: sama laite, joka hajottaa aggregaatteja pienellä amplitudilla, hajottaa solut kokonaan suuremmilla asetuksilla, joten lyysi, proteiinien uutto ja DNA:n fragmentointi voidaan tehdä peräkkäin siirtämättä näytettä putkesta toiseen.
Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP soluryppäiden deagglomeraatioon suurella näytteiden käsittelykapasiteetilla
Mikrolevyjen ultraäänilaitemallit UIP400MTP ja UIP550MTP käsittelevät monikuoppalevyjen lisäksi myös putkitelineitä.
Löydä aggregaattien hajotustyönkulkuusi sopiva ultraäänilaite
Usean putken ultraäänilaite VialTweeter
Ensisijainen menetelmä steriiliin aggregaattien hajottamiseen suljetuissa näytepulloissa. Automaattisella virityksellä varustetun 200 watin ultraääniprosessorin UP200St käyttämä VialTweeter toimii 26 kHz:n taajuudella ja siirtää ultraääntä epäsuorasti jopa 10 suljetun näytepullon seinämien läpi samanaikaisesti, jopa 10 W:n teholla putkea kohti. Näin saadaan tasaisia ja toistettavia tuloksia ilman ristikontaminaatiota tai näytehävikkiä. Titaaninen sonotrodi VialTweeter voidaan autoklavoida, ja amplitudi- ja pulssiasetuksia voidaan säätää ja tallentaa, mikä tarjoaa deagglomeraatioprotokollan tarvitseman säätöalueen. Vakiomalliseen 10-paikkaiseen sonotrodiin sopivat automaattisen näytteensyöttäjän näytepullot, mikrosentrifugiputket sekä 1–5 mL:n putket valmistajilta Eppendorf tai Nunc. Kiinnityslaitteella VialPress voidaan käsitellä jopa 5 suurempaa astiaa, joiden halkaisija on enintään 20 mm.
Erityisiä yhden putken malleja laitteesta VialTweeter on saatavana Falcon-putkille sekä yksittäisille näytepulloille astian koon mukaan räätälöityinä. Irrota lohkosonotrodi, niin perusyksikkö UP200St toimii tavanomaisena ultraäänikärjellä varustettuna laitteena pienten ja keskikokoisten näytteiden suoraan käsittelyyn.
Mikrolevyjen ultraäänilaitteet
Siirry suuren näytteiden käsittelykapasiteetin näytteenvalmistukseen monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelyllä: Levyihin perustuvissa työnkuluissa mikrolevyjen ultraäänilaitteet UIP400MTP ja UIP550MTP laajentavat kosketuksettoman, tasaisen ultraäänikäsittelyn kymmenestä putkesta kokonaiseen levyyn.
400 watin UIP400MTP käsittelee vakiomallisia mikrotiitteri- ja monikuoppalevyjä, myös 96-kuoppaisia malleja. Laitteessa on tarkka amplitudin, tehon ja pulssituksen säätö sekä ajastin, lämpötila-anturi ja vesihaudejäähdytys. Biofilmin irrottaminen ja bakteeriviljelmien käsittely ovat mikrolevyjen ultraäänilaitteen UIP400MTP vakiintuneita käyttökohteita.
550 watin UIP550MTP on tehokkaampi vaihtoehto – ihanteellinen vaativampiin käyttökohteisiin.
Molemmat kosketuksettomat ultraäänikäsittelyjärjestelmät käsittelevät luotettavasti 6-, 12-, 24-, 48-, 96- ja 384-kuoppaisia levyjä sekä putkitelineitä ja petrimaljoja. Yrityksen Hielscher mikrolevyjen ultraäänilaitteet toimivat minkä tahansa vakiomallisen levyn kanssa, joten kalliita valmistajakohtaisia kulutustarvikkeita ei tarvita. Ohjelmoitavien lämpötilarajojen ansiosta ultraäänikäsittely keskeytyy automaattisesti näytteen enimmäislämpötilassa ja jatkuu jäähdytyksen jälkeen, mikä suojaa elinkykyisyyttä toistuvissa jaksoissa. Älykäs ja luotettava suuren näytteiden käsittelykapasiteetin näytteenvalmistus toistettaviin tuloksiin.
Alla oleva taulukko antaa yleiskuvan biotieteissä, genomiikassa, proteomiikassa ja diagnostiikassa käytettävien laboratorionäytteiden ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:
| Suositellut laitteet | Erätilavuus | Tilavuusvirta |
|---|---|---|
| Usean putken ultraäänilaite VialTweeter | 0,5–1,5 mL:n näytepullot | n.a. |
| Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP (440 wattia) | monikuoppa- / mikrotiitterilevyt | n.a. |
| Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP550MTP (550 wattia) | monikuoppa- / mikrotiitterilevyt | n.a. |
| Ultraäänilaite CupHorn | CupHorn näytepulloille tai dekantterilasille | n.a. |
| UP100H, 100 watin ultraäänikärjellä varustettu laite | 1–500 mL | 10–200 mL/min |
| UP200Ht, UP200St 200 watin ultraäänikärjellä varustetut laitemallit | 10–1 000 mL | 20–200 mL/min |
| UP400St, 400 watin ultraäänikärjellä varustettu laite | 10–2 000 mL | 20–400 mL/min |
| GDmini2 | steriili ultraääneen perustuva mikrovirtausreaktori | n.a. |
| Ultraääniseularavistin | n.a. | n.a. |
Usein kysyttyä soluaggregaattien hajottamisesta ultraäänellä
Mitä eroa on soluaggregaattien hajottamisella ja solujen lyysillä?
Aggregaattien hajottaminen, jota kutsutaan myös deagglomeraatioksi, erottaa soluryppäät yksittäissolususpensioksi solujen pysyessä ehjinä ja elinkykyisinä. Lyysi rikkoo soluvaipan ja vapauttaa solunsisäisen sisällön. Molemmat perustuvat kavitaation aiheuttamiin leikkausvoimiin, ja erona on energiansyöttö. Optimoiduilla amplitudi-, pulssi- ja lämpötila-asetuksilla ultraäänikäsittely hajottaa aggregaatit lyysikynnyksen alapuolella.
Miksi ultraäänihauteet eivät sovellu vakioituun aggregaattien hajottamiseen?
Hauteet tuottavat vain vähän ultraäänienergiaa, mikä johtaa puutteelliseen näytteenvalmistukseen. Lisäksi kavitaatio kehittyy hyvin epätasaisesti eri puolilla säiliötä, joten kukin näyte saa sijaintinsa mukaan erilaisen käsittelyn. Mikrobiologiset laskennat ja vertailevat tutkimukset edellyttävät vertailukelpoisuutta. Kosketuksettomat ultraäänilaitteet, kuten usean putken ultraäänilaite VialTweeter sekä mikrolevyjen ultraäänilaitemallit UIP400MTP ja UIP550MTP, käsittelevät kaikki astiat säädetyissä ultraääniolosuhteissa, mikä parantaa toistettavuutta rinnakkaisnäytteiden välillä.
Voiko ultraäänikäsittely vaurioittaa soluja?
Kyllä, jos parametreja ei hallita. Liiallinen ultraäänikäsittely tai hallitsematon lämpeneminen voi vaurioittaa soluja, ja vapautuva DNA tekee näytteistä viskooseja ja edistää uudelleenaggregoitumista. Siksi prosessi on kehitettävä harkiten: kohtuullinen amplitudi, pulssijaksot, jäähdytys ja lämpötilarajoitetut laitteet pitävät käsittelyn käyrän aggregaattien hajottamista vastaavalla alueella.
Kaikki Hielscherin digitaaliset ultraäänilaitteet tarjoavat tarkasti hallittavat parametrit, liitettävät lämpötila-anturit, ohjelmoitavat asetukset ja automaattisen tietojen tallennuksen luotettavaa näytteenvalmistusta varten.
Onko näyte siirrettävä toiseen astiaan?
Ei. Näytepullot ja levyt käsitellään alkuperäisissä, suljetuissa astioissaan. Epäsuora ultraäänikäsittely välttää sekä siirtohäviöt että ultraäänikärjen käsittelyyn liittyvän näytejäämien siirtymisen.
Millaisia näytepullo- ja putkimalleja VialTweeter voi käsitellä?
Vakiomalliseen 10-paikkaiseen sonotrodiin sopivat automaattisen näytteensyöttäjän näytepullot, mikrosentrifugiputket sekä 1–5 mL:n putket valmistajilta Eppendorf tai Nunc. Lisävarusteeseen VialPress mahtuu jopa 5 suurempaa astiaa, joiden halkaisija on enintään 20 mm. Erityisiä yhden putken malleja laitteesta VialTweeter on saatavana Falcon-putkille sekä räätälöityihin yksittäisen näytepullon tai suuremman astian kokoonpanoihin.
Voinko hajottaa aggregaatteja ja tehdä lyysin yhdellä laitteella?
Kyllä. Sama laitekokoonpano, joka hajottaa aggregaatteja kohtuullisella amplitudilla, hajottaa solut kokonaan suuremmalla amplitudilla ja pidemmällä altistuksella, joten yksittäissolususpension valmistus ja sitä seuraava uutto voidaan tehdä peräkkäin vaihtamatta laitejärjestelmää.
Käytetäänkö ultraäänikäsittelyä MBEC-määrityksissä?
Ultraäänikäsittely on vakiintunut ja suurelta osin vakiomenettelyyn kuuluva osa. Tappikannelliseen levyyn perustuvassa MBEC-määrityksessä biofilmit kasvatetaan polystyreenitapeilla ja altistetaan antibiootille. Tämän jälkeen tapit siirretään tuoreeseen kasvatusväliaineeseen ja käsitellään vorteksoimalla ja ultraäänellä, jotta kiinnittyneet biofilmisolut irtoavat ja niiden aggregaatit hajoavat planktoniseksi suspensioksi ennen sarjalaimennusta ja elinkykyisten solujen laskentaa (MBEC luetaan pienimmäksi pitoisuudeksi, joka vähentää talteen otettujen elinkykyisten solujen lukumäärää ≥3 log10 verrattuna käsittelemättömään biofilmiin). Ultraäänikäsittely parantaa dispergoinnin laatua merkittävästi: EPS-matriksiin sitoutuneiden solujen puutteellinen vapautuminen johtaa hävittämistehon aliarviointiin ja suurentaa MBEC-arvoja. Tappeja sisältävien kuoppien kohdennettu ultraäänikäsittely eri puolilla määrityslevyjä mikrolevyjen ultraäänilaitteella UIP400MTP poistaa hauteessa tehtävän ultraäänikäsittelyn perinteiset heikkoudet – epätasaisen energian jakautumisen, lämpenemisen sekä aerosolien ja ristikontaminaation riskin.
Lue, miten kosketukseton mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP helpottaa MBEC-määrityksiä!
Käytetäänkö ultraäänikäsittelyä MIC-määrityksissä?
Ultraäänikäsittelyä käytetään erilaisissa MIC-määrityksiin liittyvissä työnkuluissa tehokkuuden ja toistettavuuden parantamiseksi:
- mykobakteriologiassa, jossa yskös ja muut viskoosit näytteet dekontaminoidaan ja homogenisoidaan rutiininomaisesti, toisinaan ultraäänikäsittelyllä, ennen herkkyysmääritystä, ja jossa ryppäitä muodostavien mykobakteerien inokulaattien lyhyt dispergointi auttaa saamaan tarkkoja MIC-arvoja;
- aggregoitumiseen taipuvaisilla organismeilla (esim. streptokokit ja stafylokokit pelleteissä), joilla mikroaggregaatit vääristävät inokulaatin tiheyttä; sekä
- yhdistetyssä diagnostiikassa, kuten implantin ultraäänikäsittelyssä käytetyn nesteen viljelyssä ja sitä seuraavassa herkkyysmäärityksessä tekonivelinfektion yhteydessä (MBEC:n kaltainen sovellus, ei klassinen MIC-määritys).
Kirjallisuus / lähteet
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Valitse oma levysi! Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP550MTP hajottaa bakteerinäytteiden aggregaatit missä tahansa vakiomallisessa monikuoppalevyssä.
Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitemallit UIP400MTP mikrolevyille, VialTweeter ja CupHorn: nopea näytteenvalmistus suurella käsittelykapasiteetilla