MBEC-määritysprotokolla, jossa käytetään 96-kuoppaista Plate Sonicator -UIP400MTP
MBEC-määritystä käytetään määrittämään antimikrobisten aineiden pitoisuus, jota tarvitaan tappien kansiin muodostuneiden biokalvojen poistamiseen. Biokalvon elinkelpoisuuden arvioimiseksi biokalvot on ensin irrotettava 96-kuoppaisen levyn tapin kansista. Sonikaatio on luotettavin ja tehokkain menetelmä tähän irtoamiseen. Monikuoppalevyinen sonikaattori UIP400MTP on erityisesti suunniteltu käsittelemään määrityslevyjä mahdollisimman tehokkaasti ja kätevästi, virtaviivaistamalla ja nopeuttamalla korkean suorituskyvyn MBEC-määrityksiä.
Sonikaatio biofilmin irtoamiseen
Sonikaatio on ratkaiseva askel MBEC-määrityksissä (Minimum Biofilm Eradication Concentration), mikä mahdollistaa biofilmisolujen tehokkaan irrottamisen niiden pinnan kiinnittymisestä. Biofilmit ovat luonnostaan solunulkoiseen matriisiin koteloituja mikro-organismiyhteisöjä, mikä tekee niistä huomattavasti vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille verrattuna planktonisiin soluihin. MBEC-määritysten aikana sonikaatio käyttää ultraääniaaltoja kontrolloidun kavitaation tuottamiseksi, häiritsemällä biofilmimatriisia ja vapauttamalla upotetut solut suspensioon. Tämä vaihe varmistaa, että biofilmisolut dispergoituvat tasaisesti talteenottoväliaineeseen, mikä helpottaa tarkkaa elinkyvyn arviointia pinnoitus-, laimennus- tai spektrofotometristen menetelmien avulla. Ilman asianmukaista biofilmin irtoamista matriisin jäännöskomponentit voisivat suojata soluja, mikä johtaisi antimikrobisen tehon aliarviointiin. Siksi sonikaatio on välttämätöntä luotettavien ja toistettavien MBEC-arvojen saamiseksi, mikä heijastaa testattujen aineiden todellista hävittämispotentiaalia. Monikuoppainen levysonikaattori mahdollistaa UIP400MTP helpon korkean suorituskyvyn näytteen valmistuksen määrityslevyissä.
Monikuoppainen levysoitin UIP400MTP helpottaa suuren suorituskyvyn näytteen valmistelua määrityslevyissä.
Biofilmin hävittämisen vähimmäispitoisuus (MBEC) määritysprotokolla
Vaihe 1: Biofilmin muodostuminen
- Valmistele bakteerisuspensio:
Kasvata bakteereja sopivassa alustassa log-vaiheen kasvua varten.
Laimennetaan bakteeriviljelmä määritettyyn optiseen tiheyteen (esim. OD600 ~0,1). - Inokuloidaan 96-kuoppainen levy:
Lisätään bakteerisuspensio (esim. 150–200 μl) tavallisen 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn kuoppaan. - Kiinnitä tapin kansi:
Aseta tapin kansi inokuloidulle levylle, jotta biofilmi muodostuu tapin pinnoille. - Inkuboidaan levyä:
Inkuboidaan sopivassa lämpötilassa (esim. 37 °C) 24–48 tuntia ravistamatta biokalvon kasvun edistämiseksi.
Vaihe 2: Hoito antimikrobisilla aineilla
- Valmistele antimikrobisia liuoksia:
Valmistetaan erilaisia antimikrobisia pitoisuuksia tuoreissa väliaineissa.
Altista biokalvot mikrobilääkkeille:
Poista tapin kansi bakteeriviljelmästä ja huuhtele se steriilillä suolaliuoksella tai PBS:llä planktonisten solujen poistamiseksi.
Aseta tapin kansi uuteen 96-kuoppaiseen levyyn, joka sisältää antimikrobisia liuoksia. - Inkuboidaan levyä:
Inkuboidaan määrätyn ajan (esim. 24 tuntia) mikrobilääkealtistuksen mahdollistamiseksi.
Multi-well-levyn sonikaattori UIP400MTP suuren suorituskyvyn näytteen valmistukseen
Vaihe 3: Sonikaatio 96-Well Plate Sonicator -UIP400MTP kanssa
Sonikaatiovaihe on kriittinen biokalvojen irrottamiseksi tapin kansista elinkelpoisuuden arvioimiseksi. Noudata näitä ohjeita UIP400MTP sonicatorille:
- Valmistele asennus:
Täytä tuore 96-kuoppainen levy keräyselatusaineella (esim. neutraloivalla liemellä tai tuoreella kasvualustalla) jokaisessa kuopassa. - Siirrä tapin kansi:
Poista tapin kansi antimikrobisesta hoitolevystä.
Huuhtele tapin kansi steriilillä suolaliuoksella tai PBS:llä antimikrobisten aineiden jäämien poistamiseksi. - Aseta levy ja sonikaattori:
Kiinnitä tapin kansi keräysväliainelevyyn.
Aseta palautusväliainelevy UIP400MTP sonicator -alustalle varmistaen, että levy on keskitetty ja vakaa. - Säädä sonikaatioparametreja:
Aseta sonikaatioparametrit UIP400MTP (asetukset voidaan säätää biofilmiin):
Amplitudi: 70–100%.
Sonikaatioaika: 1–3 minuuttia (säädä biofilmin kestävyyden perusteella) syklitilassa. - Sonikaatti:
Aloita sonikaatioprosessi. Ultraäänivärähtely irrottaa biokalvot tapin pinnoilta talteenottoväliaineeseen. - Seuraa prosessia:
Käytä kytkettävää lämpötila-anturia näytteen lämpötilan seuraamiseen kaivoissa. UIP400MTP voidaan liittää laboratoriojäähdyttimeen jäähdytystä varten. - Post-sonication-käsittely:
Keräyselatusaine (joka sisältää nyt irronneita biofilmejä) siirretään välittömästi tuoreeseen steriiliin levyyn analysointia varten.
(A) TSB:tä sisältävä levy, jossa on 2 % glukoosia ja jota käytetään biofilmin muodostukseen, solujen talteenottoon ja
MIC: n ja MBCB: n määrittäminen; B) Kansi, jossa on tapit stafylokokkibiofilmien muodostamiseksi. MIC: n ja MBCB: n määrittäminen; B) Kansi, jossa on tapit stafylokokkibiofilmien muodostamiseksi.
Nastoille muodostetut biofilmisolut irrotettiin sonikaatiolla (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minuutin ajan 96-kuoppalevyissä, jotka sisälsivät tuoretta viljelyalustaa solujen talteenottoa varten.
(Kuva ja tutkimus: ©de Oliveira et ai., 2016)
Vaihe 4: Elinkelpoisuuden arviointi
Levy- ja viljelmäirrotetut biofilmit:
- Keräyselatusaine ja malja laimennetaan sarjalaimennoksina agarille pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) luettelemiseksi.
Vaihtoehtoisesti käytetään kolorimetristä tai fluoresenssiin perustuvaa elinkykymääritystä. - Tallenna tulokset:
Määritä MBEC pienimmäksi antimikrobisen aineen pitoisuudeksi, joka hävitti havaittavissa olevan biofilmin elinkelpoisuuden.
Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa
Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscherin sonikaattorit käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.
Virtaviivaista näytteen valmistelua 96-kuoppalevyissä ja määrityslevyissä käyttämällä monikuoppaista levysonikaattoria UIP400MTP
Kirjallisuus / Viitteet
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Usein Kysytyt Kysymykset
Mikä on MBEC-määritys?
MBEC-määritys (Minimum Biofilm Eradication Concentration) on standardoitu menetelmä, jota käytetään määrittämään biofilmiin liittyvien bakteerien hävittämiseen tarvittavan mikrobilääkkeen pienin pitoisuus. Se sisältää biokalvojen kasvattamisen erikoistuneilla pinnoilla, altistamalla ne erilaisille antimikrobisille pitoisuuksille ja arvioimalla irrotettujen solujen elinkelpoisuutta biofilmin häiriöiden jälkeen, tyypillisesti sonikoinnin avulla, hoidon tehokkuuden arvioimiseksi.
Mitä eroa on MBIC: n ja MBEC: n välillä?
Pienin biofilmin estopitoisuus (MBIC) on pienin antimikrobisen aineen pitoisuus, joka tarvitaan estämään biofilmin muodostuminen, kun taas pienin biofilmin hävittämispitoisuus (MBEC) on pienin pitoisuus, joka tarvitaan vakiintuneen biofilmin hävittämiseen. MBIC keskittyy biofilmien ehkäisyyn, kun taas MBEC arvioi hoidon tehoa kypsiä biofilmejä vastaan.
Mitä levyjä käytetään yleisesti MBEC-määrityksissä?
MBEC-määrityksissä yleisesti käytetyt mikrotiitterilevyt ovat tyypillisesti polystyreenistä tai polypropeenista valmistettuja 96-kuoppalevyjä. Nämä materiaalit tarjoavat sopivan pinnan biofilmin muodostumiselle ja ovat kemiallisesti resistenttejä määrityksen aikana testatuille mikrobilääkkeille. Polystyreenilevyjä suositaan laajalti niiden optisen selkeyden vuoksi, mikä on edullista loppupään analyyseissä, kuten spektrofotometrisissä tai fluoresenssipohjaisissa mittauksissa. Näiden levyjen suunnittelussa on irrotettavat tapin kannet, jotka ovat välttämättömiä määrityksessä, koska biokalvot muodostuvat tappeihin, jotka upotetaan kasvualustoja sisältäviin kuoppiin. Standardoidut levyt, kuten MBEC-määritysprotokollan mukaiset levyt, on erityisesti suunniteltu varmistamaan toistettavuus ja yhteensopivuus UIP400MTP sonicatorin tai muun prosessointilaitteen kanssa.
Mitä ovat PEG-kansilevyt?
PEG-kansilevyt ovat erikoistuneita monikuoppalevyjärjestelmiä, joissa kansi on varustettu pienillä polyetyleeniglykoli (PEG) -tapilla tai tapilla, jotka ulottuvat kuhunkin kuoppaan. Nämä tapit tarjoavat pinnan mikrobien biofilmin muodostumiselle valvotuissa olosuhteissa jäljittelemällä todellista biofilmin kasvua. Rakenne mahdollistaa biokalvojen kehittymisen tappeihin, kun taas kuopat sisältävät kasvualustoja tai antimikrobisia aineita, mikä mahdollistaa biofilmiherkkyyden korkean suorituskyvyn testauksen hoidoille, kuten MBEC- ja MBIC-määrityksissä.
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita laboratorio jotta Teollisuuden koko.