MBEC-määrityksen menetelmäohje 96-kuoppalevyjen ultraäänilaitteella UIP400MTP

MBEC-määrityksellä selvitetään tappikansiin muodostuneiden biofilmien hävittämiseen tarvittava antimikrobisten aineiden pitoisuus. Biofilmien elinkyvyn arvioimiseksi biofilmit on ensin irrotettava 96-kuoppalevyn tappikansista. Ultraäänikäsittely on luotettavin ja tehokkain menetelmä tähän irrotukseen. Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP on suunniteltu erityisesti määrityslevyjen käsittelyyn mahdollisimman tehokkaasti ja vaivattomasti, mikä sujuvoittaa ja nopeuttaa suurten näytemäärien MBEC-määrityksiä.

Ultraäänikäsittely biofilmien irrottamiseen

Ultraäänikäsittely on ratkaiseva vaihe biofilmin hävittävän vähimmäispitoisuuden (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) määrityksissä, sillä se mahdollistaa biofilmin solujen tehokkaan irrottamisen pinnasta, johon ne ovat kiinnittyneet. Biofilmit ovat luontaisesti järjestäytyneitä mikro-organismiyhteisöjä, joita ympäröi solunulkoinen matriksi. Tämä tekee niistä huomattavasti vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille kuin planktoniset solut. MBEC-määrityksissä ultraäänikäsittely tuottaa ultraääniaaltojen avulla hallittua kavitaatiota, joka hajottaa biofilmin matriksin ja vapauttaa siihen sitoutuneet solut suspensioon. Tämä vaihe varmistaa, että biofilmin solut jakautuvat tasaisesti talteenottoväliaineeseen, mikä helpottaa elinkyvyn tarkkaa arviointia maljaviljelyllä, laimennuksilla tai spektrofotometrisillä menetelmillä. Jos biofilmiä ei irroteta asianmukaisesti, jäljelle jäävät matriksin osat voivat suojata soluja ja johtaa antimikrobisen tehon aliarviointiin. Ultraäänikäsittely on siksi välttämätön luotettavien ja toistettavien MBEC-arvojen saamiseksi. Nämä arvot kuvastavat testattujen aineiden todellista hävittämiskykyä. Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP mahdollistaa suurten näytemäärien helpon valmistelun määrityslevyillä.

Biofilmin hävittävän vähimmäispitoisuuden (MBEC) määrityksen menetelmäohje

Vaihe 1: Biofilmin muodostuminen

1. Valmista bakteerisuspensio:
   Kasvata bakteereja sopivissa kasvatusväliaineissa logaritmiseen kasvuvaiheeseen asti.
   Laimenna bakteeriviljelmä määritettyyn optiseen tiheyteen (esim. OD600 ~0,1).
2. Inokuloi 96-kuoppalevy:
   Lisää bakteerisuspensiota (esim. 150–200 µL) tavallisen 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn jokaiseen kuoppaan.
3. Kiinnitä tappikansi:
   Aseta tappikansi inokuloidun levyn päälle, jotta tappien pinnoille voi muodostua biofilmiä.
4. Inkuboi levy:
   Inkuboi kokonaisuutta sopivassa lämpötilassa (esim. 37°C) 24–48 tuntia ravistamatta biofilmin kasvun edistämiseksi.

Vaihe 2: Käsittely antimikrobisilla aineilla

• Valmista antimikrobiset liuokset:
  Valmista tuoreisiin kasvatusväliaineisiin antimikrobisten aineiden pitoisuussarja.
  Altista biofilmit antimikrobisille aineille:
  Poista tappikansi bakteeriviljelmästä ja huuhtele se steriilissä suolaliuoksessa tai PBS:ssä planktonisten solujen poistamiseksi.
  Aseta tappikansi uuteen 96-kuoppalevyyn, joka sisältää antimikrobiset liuokset.
• Inkuboi levy:
  Inkuboi määritetyn ajan (esim. 24 tuntia), jotta biofilmit altistuvat antimikrobisille aineille.

Vaihe 3: Ultraäänikäsittely 96-kuoppalevyjen ultraäänilaitteella UIP400MTP

Ultraäänikäsittelyvaihe on ratkaiseva biofilmien irrottamiseksi tappikansista elinkyvyn arviointia varten. Noudata näitä vaiheita käyttäessäsi ultraäänilaitetta UIP400MTP:

1. Valmistele kokonaisuus:
   Lisää uuden 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan talteenottoväliainetta (esim. neutraloivaa lientä tai tuoretta kasvatusväliainetta).
2. Siirrä tappikansi:
   Poista tappikansi antimikrobiseen käsittelyyn käytetystä levystä.
   Huuhtele tappikansi steriilissä suolaliuoksessa tai PBS:ssä antimikrobisten aineiden jäämien poistamiseksi.
3. Aseta levy ja ultraäänilaite paikoilleen:
   Kiinnitä tappikansi talteenottoväliainetta sisältävään levyyn.
   Aseta talteenottoväliainetta sisältävä levy ultraäänilaitteen UIP400MTP alustalle ja varmista, että levy on keskellä ja vakaasti paikallaan.
4. Säädä ultraäänikäsittelyn parametrit:
   Aseta ultraäänikäsittelyn parametrit laitteessa UIP400MTP (asetuksia voidaan säätää biofilmin mukaan):
   Amplitudi: 70–100%.
   Ultraäänikäsittelyn kesto: 1–3 minuuttia (säädä biofilmin kestävyyden mukaan) syklisessä tilassa.
5. Käsittele ultraäänellä:
   Käynnistä ultraäänikäsittely. Ultraäänivärähtely irrottaa biofilmit tappien pinnoilta talteenottoväliaineeseen.
6. Seuraa prosessia:
   Seuraa kuopissa olevien näytteiden lämpötilaa liitettävällä lämpötila-anturilla. UIP400MTP voidaan liittää laboratoriojäähdyttimeen jäähdytystä varten.
7. Ultraäänikäsittelyn jälkeinen käsittely:
   Siirrä talteenottoväliaine (joka sisältää nyt irrotetut biofilmit) välittömästi uuteen steriiliin levyyn jatkoanalyysiä varten.

(A) Levy, joka sisältää TSB:tä ja 2% glukoosia ja jota käytetään biofilmien muodostukseen, solujen talteenottoon ja
MIC:n ja MBCB:n määritykseen; (B) Tappikansi stafylokokkibiofilmien muodostukseen. MIC:n ja MBCB:n määritys; (B) Tappikansi stafylokokkibiofilmien muodostukseen.
Tappeihin muodostuneet biofilmin solut irrotettiin 5 min kestävällä ultraäänikäsittelyllä (Hielscher Ultrasound Technology) 96-kuoppalevyissä, jotka sisälsivät tuoretta kasvatusväliainetta solujen talteenottoa varten.
(Kuva ja tutkimus: ©de Oliveira et al., 2016)

Vaihe 4: Elinkyvyn arviointi

Siirrä irrotetut biofilmit maljoille ja viljele ne:

1. Tee talteenottoväliaineesta sarjalaimennokset ja siirrä ne agarmaljoille pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) laskemiseksi.
   Vaihtoehtoisesti käytä kolorimetristä tai fluoresenssiin perustuvaa elinkyvyn määritystä.
2. Kirjaa tulokset:
   Määritä MBEC antimikrobisen aineen pienimmäksi pitoisuudeksi, joka poisti biofilmin havaittavan elinkyvyn.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscher-ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti tehokkaita ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät uusinta tekniikkaa edustava teknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher-ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL-, CSA- ja RoHs-vaatimukset.

Lue täältä, miten laitetta UIP400MTP käytetään biofilmien irrottamiseen näytteiden valmisteluvaiheessa ASTM E2799 -menetelmässä, jossa testataan desinfiointiaineiden tehoa Pseudomonas aeruginosa -biofilmiä vastaan MBEC-määrityksellä.