ASTM E2799-22 -protokolla antimikrobisen tehon arviointiin

Hielscher UIP400MTP on tehokas ja suorituskykyinen monikuoppalevyjen ultraäänilaite, joka on suunniteltu sujuvoittamaan ASTM E2799-22 -protokollan ultraäänikäsittelyvaihetta. Jakamalla ultraäänienergian tasaisesti koko mikrotiitterilevylle UIP400MTP varmistaa biofilmien tasaisen ja luotettavan irtoamisen tappikansista vahingoittamatta soluja tai vaarantamatta näytteiden eheyttä. Sen suuri näytteenkäsittelykapasiteetti ja helppokäyttöisyys lyhentävät käsittelyaikaa merkittävästi ja parantavat samalla toistettavuutta. Siksi se on ihanteellinen ratkaisu laboratorioille, jotka tekevät biofilmien elinkykyisyysmäärityksiä ja antimikrobisen tehon testejä.

ASTM E2799

ASTM E2799 on standardoitu testimenetelmä, joka on suunniteltu arvioimaan antimikrobisten aineiden tehoa biofilmejä vastaan ja joka keskittyy erityisesti Pseudomonas aeruginosa -bakteeriin. Biofilmit ovat monimutkaisia mikrobiyhteisöjä, jotka kiinnittyvät pinnoille ja joiden vastustuskyky antimikrobisia käsittelyjä vastaan on tavallista suurempi. Tämä tekee niistä merkittävän haasteen terveydenhuollossa, teollisuudessa ja ympäristöön liittyvissä yhteyksissä. Menetelmässä käytetään biofilmin hävittämiseen tarvittavan vähimmäispitoisuuden määritystä (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC), joka tarjoaa luotettavan ja toistettavan perustan desinfiointiaineiden testaamiseen realistisissa biofilmiolosuhteissa.

Mikä on ultraäänikäsittelyn tehtävä ASTM E2799 -protokollassa?

Ultraäänikäsittelyllä on keskeinen tehtävä ASTM E2799 -protokollassa: se helpottaa biofilmien irrottamista testipinnoilta ja varmistaa mikrobien elinkykyisyyden tarkan arvioinnin käsittelyn jälkeen. Hallitun ultraäänienergian avulla protokolla mahdollistaa biofilmien tehokkaan ja tasaisen hajottamisen vahingoittamatta soluja, mikä tuottaa tarkkoja ja toistettavia tuloksia. Siksi ASTM E2799 on olennainen työkalu biofilmitutkimuksen edistämisessä ja tehokkaiden antimikrobisten strategioiden kehittämisessä.

MBEC-määrityksen suorittaminen ASTM E2799-22 -standardin mukaisesti

ASTM E2799-22 -protokolla kuvaa vaiheet, joilla arvioidaan antimikrobisten aineiden tehoa biofilmejä vastaan. Kun käytössä on mikrotiitterilevyjen ultraäänilaite Hielscher UIP400MTP, protokollaa voidaan mukauttaa sisällyttämällä siihen tämä edistynyt ultraäänikäsittelymenetelmä biofilmien irrottamiseksi. Alla kuvataan vaiheet, jotka on mukautettu mikrolevyjen ultraäänilaitteen UIP400MTP käyttöön:

1. Biofilmien valmistelu
   Valmista steriili 96-kuoppainen mikrotitterilevy, jossa on irrotettavat tapin kannet.
   Kuopat inokuloidaan standardoidulla bakteerisuspensiolla sopivaan kasvualustaan.
   Aseta tapin kansi levylle varmistaen, että tapit ovat täysin upotettuina bakteerisuspensioon.
   Inkuboidaan levyä valvotuissa olosuhteissa (esim. lämpötilassa ja ajassa), jotta tappeihin voi muodostua biokalvoa.
2. Käsittely antimikrobisilla aineilla
   Biofilmin muodostumisen jälkeen elatusaine korvataan tuoreella elatusaineella, joka sisältää testimikrobilääkkeitä eri pitoisuuksina.
   Kiinnitä tapin kansi takaisin ja inkuboi testisuunnitelmassa määritellyissä olosuhteissa.
3. Valmistelu biofilmien irrottamista varten
   Käsittelyn jälkeen tapin kansi huuhdellaan upottamalla se steriiliin huuhteluliuokseen antimikrobisten aineiden jäämien ja löyhästi kiinnittyneiden planktonisten solujen poistamiseksi.
4. Biofilmien irrottaminen ultraäänilaitteella UIP400MTP
   Prepare a fresh 96-well microtiter plate containing a recovery medium (e.g., neutralizing broth).
   Irrota biokalvot asettamalla tapin kansi keräysväliainelevyn kuoppiin.
   Aseta levy UIP400MTP sonicatoriin varmistaen, että kansi ja levy on kohdistettu oikein.
   Aseta sonikaattori 70–80%: n amplitudiin ja sonikoidaan 3-4 minuutin ajan syklitilassa, jotta varmistetaan johdonmukainen biofilmin irtoaminen ilman solulyysiä.
5. Biofilmien elinkykyisyyden arviointi
   Käsittele ultraäänikäsittelyn jälkeen irrotettuja biofilmisoluja sisältävä talteenottoväliaine tavanomaisilla mikrobiologisilla tai analyyttisillä menetelmillä, kuten:
   • Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) lukumäärät: Suoritetaan sarjalaimennukset ja malja agarilla elinkelpoisten solujen laskemiseksi.
   • Optisen tiheyden (OD) mittaukset: Arvioi solutiheys spektrofotometrisellä analyysillä.
   • Fluoresenssiin perustuvat elinkykyisyysmääritykset: Määritä elävien ja kuolleiden solujen määrät fluoresoivilla väriaineilla.
6. Tietojen analysointi
   Vertaa käsiteltyjen ja käsittelemättömien biofilmien elinkykyisyystietoja antimikrobisten aineiden tehon määrittämiseksi.
   Laske biofilmin hävittämiseen tarvittava vähimmäispitoisuus (MBEC) sen pitoisuuden perusteella, joka tarvitaan elinkykyisten biofilmisolujen eliminoimiseen.
7. Laadunvalvonta
   Varmista ultraäänikäsittelyn olosuhteiden yhdenmukaisuus kalibroimalla UIP400MTP säännöllisesti ja varmistamalla, ettei biofilmien irrotusprosessi aiheuta merkittävää solujen lyysiä tai tuhoutumista.
   Sisällytä asianmukaiset kontrollit, kuten käsittelemättömät biofilmit ja pelkkää väliainetta sisältävät nollanäytteet, tulosten varmentamiseksi.

Nastoille muodostetut biofilmisolut irrotettiin sonikaatiolla (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Saksa, UIP250MTP) 5 minuutin ajan 96-kuoppaisissa levyissä, jotka sisälsivät tuoretta viljelyalustaa solujen talteenottoa varten.
(Kuva ja tutkimus: ©de Oliveira et al., 2016)

Kun UIP400MTP integroidaan ASTM E2799-22 -työnkulkuun, biofilmien irrotusprosessi optimoidaan yhdenmukaisuutta, tehokkuutta ja suuren näytemäärän käsittelyä vaativia sovelluksia varten.