Parafiinin poisto ja proteiinien uutto FFPE-näytteistä

Helpota proteiinien uuttoa formaliinifiksoiduista, parafiiniin valetuista (FFPE) kudosleikkeistä käyttämällä optimoitua parafiinin poiston, liuotuksen ja moniputkiultraäänilaitteella VialTweeter tehtävän ultraäänikäsittelyn yhdistelmää. Tämä protokolla tukee myöhempää massaspektrometriaan perustuvaa proteomiikkaa ja soveltuu työnkulkuihin, joihin sisältyy SP3-puhdistus ja entsymaattinen pilkkominen.

Tämä vakiotoimintaohje (SOP) on tarkoitettu laboratoriohenkilöstölle, joka analysoi FFPE-kudosnäytteiden proteomeja tehokasta ultraäänikäsittelyä käyttäen. Se on optimoitu enintään kymmenen FFPE-näytteen rinnakkaiseen käsittelyyn moniputkiultraäänilaitteella VialTweeter.

Protokolla: proteiinien uutto FFPE-näytteistä laitteen VialTweeter avulla

Materiaalit ja reagenssit

Reagenssit

• Ksyleeni (histologiseen käyttöön soveltuva laatu)
• Etanoli (absoluuttinen 96 %)
• Lyysipuskuri:

6 M guanidiinihydrokloridi
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksietyyli)fosfiini)
40 mM CAA (2-klooriasetamidi)

• Proteaasinestäjä (valinnainen; esim. cOmplete™ mini EDTA-free)

Laitteet

• Moniputkiultraäänilaite VialTweeter
• 1,5 mL:n tai 2,0 mL:n mikrosentrifugiputket, joiden pintaan näyte sitoutuu vähän
• Lämpöblokki tai inkubaattori (95 °C:n ja 80 °C:n asetukset)
• Mikrosentrifugi
• Lämpösekoitin (valinnainen mutta suositeltava)

Näytemäärä

• 1–2 leikettä 10 µm:n paksuista FFPE-kudosta näytettä eli näyteputkea kohden

TAI

• Yhteensä ~100 µg kudosta näytettä eli näyteputkea kohden

Huomautus: käytä mikrotomileikkauksessa uusia teriä parafiinijäämien aiheuttaman kontaminaation minimoimiseksi.

Menettely

1. Parafiinin poisto
   1. Siirrä FFPE-leikkeet mikrosentrifugiputkiin, joiden pintaan näyte sitoutuu vähän.
   2. Lisää 1 mL ksyleeniä ja sekoita lyhyesti vorteksisekoittimella.
   3. Inkuboi 10 minuuttia huoneenlämmössä.
   4. Sentrifugoi 14 000 × g:n voimalla 2 minuuttia; poista supernatantti.
   5. Toista ksyleenipesu vielä kerran (vaiheet 2–4).
   6. Pese pelletti 1 mL:lla etanolia (96 %), sekoita vorteksisekoittimella ja sentrifugoi sitten suhteellisella keskipakoisvoimalla 14 000 × g 2 minuuttia. Poista supernatantti.
   7. Toista etanolipesu vielä kerran (yhteensä 2 etanolipesua).
   8. Kuivaa pellettiä ilmassa 10 minuuttia huoneenlämmössä kannet avoinna, jotta jäljellä oleva etanoli haihtuu.
2. Proteiinien uutto ja ultraäänikäsittely
   1. Lisää 200 µL lyysipuskuria kuhunkin kuivaan pellettiin.

      Huomautus: vaikka ultraäänilaitteeseen mahtuu enintään 1 mL, 200 µL on optimaalinen tilavuus jatkokäsittelyä varten.

   2. Sekoita vorteksisekoittimella tai pipetoimalla varovasti.
3. Ensimmäinen lämpöinkubointi
   1. Inkuboi putkia 95 °C:ssa 30 min sekoittaen nopeudella 400 rpm lämpösekoittimella tai lämpöblokilla.
   2. Anna näytteiden jäähtyä huoneenlämmössä 5 min.
4. Ensimmäinen ultraäänikäsittely laitteella VialTweeter
   1. Aseta putket ultraäänilaitteeseen VialTweeter.
   2. Aseta VialTweeter UP200St -laitteeseen alla olevat arvot ja käsittele ultraäänellä.
Ultraäänilaitteen asetukset
• Aseta amplitudiksi (A) 100 %
• Aseta pulssitustilaksi (C) 100 %
• Jaksoajastin: käytössä
• Käyntiaika: 60 s
• Taukoaika: 30 s
• Raja-arvo: 15 min (vastaa 10 jaksoa)
(Laskentahuomautus: (60 s käyntiä + 30 s taukoa) × 10 jaksoa = 900 s = 15 min)
5. Toinen lämpöinkubointi
   Poista putket ja inkuboi uudelleen 95 °C:ssa 15 min nopeudella 400 rpm.
6. Toinen ultraäänikäsittely
   Toista ultraäänikäsittely laitteella VialTweeter samoilla asetuksilla (kuten yllä) vielä 10 jakson ajan (yhteensä 15 min).
7. Lysaatin kirkastus
   1. Sentrifugoi näytteitä 13 000 × g:n voimalla 10 min 23 °C:ssa (huoneenlämmössä).
   2. Kerää supernatantti varovasti uuteen 2,0 mL:n Safe-lock Eppendorf -putkeen. Vältä pelletin häiritsemistä.
8. Jatkokäsittely
   Lysaatti on nyt valmis SP3-puhdistukseen ja entsymaattiseen pilkkomiseen.

Huomautukset ja parhaat käytännöt

1. Ultraäänikäsittelyn aikaista ylikuumenemisriskiä vähennetään ohjelmoiduilla käynti- ja taukojaksoilla.
2. Vältä vorteksisekoittimen käyttöä ultraäänikäsittelyn jälkeen proteiinien aggregoitumisen estämiseksi.

Jätteiden hävittäminen ja turvallisuus

Alla oleva taulukko antaa käsityksen laboratoriokokoisten ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: