Parafiinin poisto ja proteiiniuutto FFPE:stä

Helpota proteiinin uuttamista formaliinikiinnitteisestä parafiiniin upotetusta (FFPE) kudosososiosta käyttämällä optimoitua deparafiinisaation, liuottamisen ja sonikoinnin yhdistelmää VialTweeter-moniputkiultraäänilaitteella. Tämä protokolla tukee loppupään massaspektrometriaan perustuvaa proteomiikkaa ja on yhteensopiva SP3:n puhdistus- ja entsymaattisten ruoansulatustyönkulkujen kanssa.

Tämä SOP on tarkoitettu laboratoriohenkilöstölle, joka osallistuu FFPE-kudosnäytteiden proteomiseen analyysiin korkean suorituskyvyn sonikaatiolla. Se on optimoitu jopa kymmenelle FFPE-näytteelle, jotka käsitellään rinnakkain VialTweeter Multi-Tube Sonicatorilla.

Protokolla: Proteiinin uuttaminen FFPE-näytteistä VialTweeterin avulla

Materiaalit ja reagenssit

Reagenssit

• Ksyleeni (histologinen laatu)
• Etanoli (absoluuttinen 96 %)
• Lysis-puskuri:

6 M guanidiinihydrokloridi
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksyetyli)fosfiini)
40 mM CAA (2-klooriasetamidi)

• Proteaasi-inhibiittori (valinnainen; esim. cOmplete™ mini EDTA-vapaa)

Varusteet

• VialTweeter moniputkinen ultraäänilaite
• 1,5 ml tai 2,0 ml matalasitoiset mikrosentrifugiputket
• Lämpölohko tai inkubaattori (95 °C ja 80 °C asetukset)
• Mikrosentrifugi
• Lämpösekoitin (valinnainen, mutta suositeltavaa)

Sample Input

• 1–2 10 μm:n paksuista FFPE-kudosta näytettä kohden (eli injektiopulloa kohti)

tai

• Yhteensä ~100 μg kudosta per näyte (eli per injektiopullo)

Huomautus: Käytä tuoreita teriä mikrotomiaan parafiinijätteiden saastumisen minimoimiseksi.

Menettely

1. parafiinin poisto
   1. Siirrä FFPE-osat matalasitoviin mikrosentrifugiputkiin.
   2. Lisää 1 ml ksyleeniä, pyörre hetkeksi.
   3. Inkuboi 10 minuuttia huoneenlämmössä.
   4. Sentrifugoidaan 14 000 × g:ssa 2 minuutin ajan; Hylkää supernatantti.
   5. Toista ksyleenipesu vielä kerran (vaiheet 2–4).
   6. Pese pelletti 1 ml:lla 96-prosenttista etanolia, pyörre, ja sentrifugoi sitten 14 000 × g:ssa 2 minuutin ajan. Hävitä supernatantti.
   7. Toista etanolipesu vielä kerran (yhteensä 2 etanolipesua).
   8. Ilmakuivaa pellettiä 10 minuuttia huoneenlämmössä avoimilla kansilla jäännösetanolin haihduttamiseksi.
2. Proteiinien uuttaminen ja sonikaatio
   1. Lisää 200 μl lyysipuskuria jokaiseen kuivaan pellettiin.
      Huomautus: Vaikka sonikaattoriin mahtuu jopa 1 ml, 200 μL on optimaalinen loppupään käsittelyyn.

   2. Sekoita pyörteellä tai hellävaraisella pipetoinnilla.
3. Ensimmäinen lämpöinkubaatio
   1. Putkia inkuboidaan 95 °C:ssa 30 minuuttia sekoittaen nopeudella 400 rpm lämpösekoittimella tai lämpölohkolla.
   2. Anna näytteiden jäähtyä huoneenlämmössä 5 minuuttia.
4. Ensimmäinen sonikaatio VialTweeterillä
   1. Aseta putket injektiopulloon.
   2. Aseta VialTweeter UP200St alla oleviin arvoihin ja sonikoita.
Sonicator-asetukset
• Aseta amplitudi (A) arvoon 100 %
• Aseta sykkimistilaksi (C) 100 %
• Kuukautiskello: Päällä
• Ajallaan: 60s
• Sammutusaika: 30s
• Raja-arvo: 15 min (vastaa 10 jaksoa)
(Laskentahuomautus: (60 s päällä + 30 s pois päältä) × 10 sykliä = 900 s = 15 min)
5. Toinen lämpöinkubaatio
   Putket poistetaan ja inkuboidaan uudelleen 95 °C:ssa 15 minuuttia, 400 kierrosta minuutissa.
6. Toinen sonikaatio
   Toista ultraäänikäsittely VialTweeterissä samoilla asetuksilla (kuten yllä) vielä 10 syklin ajan (yhteensä 15 min).
7. Lysaatin selventäminen
   1. Sentrifugoi näytteitä 13 000 × g:ssa 10 minuutin ajan 23 °C:ssa (huoneenlämmössä).
   2. Kerää supernatantti varovasti uuteen 2,0 ml:n Safe-lock Eppendorf -putkeen. Vältä pelletin häiritsemistä.
8. Loppupään käsittely
   Lysaatti on nyt valmis SP3-puhdistukseen ja entsymaattiseen mädätykseen.

Huomautuksia ja parhaita käytäntöjä

1. Ylikuumenemisriskiä sonikoinnin aikana vähennetään ohjelmoidulla ON/OFF-pyöräilyllä.
2. Vältä vorteksia sonikoinnin jälkeen proteiinien aggregaation estämiseksi.

Jätehuolto ja turvallisuus

Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä laboratoriokokoisten ultraäänilaitteiden likimääräisestä käsittelykapasiteetista: