Sonikaatioavusteinen proteiinien uuttaminen fosfoproteomiikkaa varten

Nykyaikaisissa biotieteissä fosfoproteomiikka on noussut kulmakiveksi teknologiaksi, jonka avulla voidaan purkaa solujen signaalireittejä ja ymmärtää sairauksien mekanismeja järjestelmätasolla. Koska fosforylaatio ohjaa kriittisiä biologisia toimintoja – entsyymiaktiivisuudesta proteiini-proteiini-vuorovaikutuksiin – sen tarkka mittaaminen on välttämätöntä sekä perustutkimuksen että translationaalisen lääketieteen kannalta. Viimeaikaiset edistysaskeleet massaspektrometriassa ovat mahdollistaneet kymmenien tuhansien fosforylaatiotapahtumien tunnistamisen yhdessä kokeessa, mikä korostaa tarvetta vankkoihin, skaalautuviin ja toistettaviin näytteenvalmistusprosesseihin.
Yksi alan merkittävimmistä kehityssuuntauksista on sonikaatioavusteinen proteiinien uuttaminen, joka parantaa merkittävästi näytteen laatua, läpimenoa ja toistettavuutta. Ultraäänitekniikat, kuten VialTweeter ja UIP400MTP, määrittelevät nyt uudelleen sen, miten laboratoriot käsittelevät suuria näytekohortteja, erityisesti korkean läpimenon fosfoproteomiikan alalla.

Tehokkaan näytteenvalmistuksen tieteellinen merkitys fosfoproteomiikan tutkimuksessa

Proteiinien fosforylaatio on erittäin dynaaminen ja palautuva translaation jälkeinen modifikaatio, joka vaikuttaa suurimpaan osaan ihmisen solujen proteiineista. Se säätelee proteiinien rakennetta, lokalisaatiota ja vuorovaikutusverkostoja, ja sen säätelyhäiriöt ovat osallisina sairauksissa, kuten syövässä ja neurodegeneraatiossa.
Fosfoproteomianalyysiin liittyy kuitenkin ainutlaatuisia teknisiä haasteita. Fosforyloituja peptidejä on usein vähän, ja ne vaativat huolellista rikastamista ja erittäin tehokasta näytteenvalmistusta. Tehottomuus proteiinien uutossa tai sulatuksessa voi johtaa signaalin häviämiseen, huonoon toistettavuuteen ja puutteelliseen fosfossiittikattavuuteen.
Tässä vaiheessa sonikaatiosta tulee kriittinen tekijä.

Miksi Sonication muuttaa proteiinien uuttamista

Sonikaatiossa käytetään voimakkaita ultraääniaaltoja solujen ja kudosten mekaaniseen hajottamiseen, mikä mahdollistaa proteiinien tehokkaan vapautumisen soluista, kudoksista, bioesteistä ja solunulkoisista vesikkeleistä. Perinteisiin lyysitekniikoihin verrattuna sonikointi tarjoaa useita selviä etuja:

• Ensinnäkin se takaa solujen nopean ja tasaisen hajoamisen, mikä on erityisen tärkeää ohimenevien fosforylaatiotilojen säilyttämiseksi. Fosfoproteomiikan alalla pienetkin viiveet tai epätäydellinen lyysi voivat muuttaa signaaliprofiileja, joten nopea ja toistettava uutto on välttämätöntä.
• Toiseksi sonikointi parantaa proteiinien saantoa ja liukenemista erityisesti vaikeasti liukenevissa näytteissä, kuten tiheissä kudoksissa tai kalvorikkaissa soluissa. Tämä johtaa suoraan parempaan jatkojalostukseen ja fosfopeptidien talteenottoon.
• Kolmanneksi ultraäänikäsittely on luonnostaan skaalautuvaa. VialTweeterin kaltaiset laitteet mahdollistavat useiden suljettujen putkien samanaikaisen sonikoimisen, mikä takaa identtiset käsittelyolosuhteet kaikissa näytteissä. Tämä eliminoi manuaalisen käsittelyn aiheuttaman vaihtelun.
• UIP400MTP edustaa merkittävää teknologista harppausta, kun tarvitaan vielä suurempaa läpimenoa. Se mahdollistaa kokonaisten mikrolevyjen tai putkiräkkien, myös automaattisen näytteenottimen injektiopullojen, suoran sonikoimisen, joten se on ihanteellinen satojen näytteiden rinnakkaiseen käsittelyyn. Tämä ominaisuus on erityisen arvokas systeemibiologiassa ja kliinisessä tutkimuksessa, jossa suuret näytekohortit ovat vakio.

Suuren läpimenon sonikointi: VialTweeter ja UIP400MTP fokuksessa

Kehittyneiden ultraäänilaitteiden integrointi fosfoproteomisiin työnkulkuihin ei ole pelkkä mukavuus. – se on metodologinen parannus.
VialTweeter on suunniteltu useiden suljettujen injektiopullojen synkronoitua ultraäänikäsittelyä varten, mikä minimoi ristikontaminaation ja varmistaa toistettavuuden. Se soveltuu erityisesti keskitehoisiin sovelluksiin ja standardoituihin työnkulkuihin.
 

Sen sijaan UIP400MTP on optimoitu korkean läpimenon ympäristöihin, mikä mahdollistaa:

• Tasainen sonikointi koko standardimikrolevyjen, esim. 96- tai 384-kuoppalevyjen, alueella.
• Putkitelineiden ja automaattisen näytteenottimen injektiopullojen suora käsittely
• Käsityöajan merkittävä väheneminen
• Parempi toistettavuus suurissa tietokokonaisuuksissa

Tämä skaalautuvuus sopii täydellisesti nykyaikaisiin fosfoproteomiikan lähestymistapoihin, joissa työnkulut käsittelevät rutiininomaisesti kymmeniä tai satoja näytteitä rinnakkain.

Sonikaatioavusteisen fosfoproteomisen näytteen valmistuksen yleinen protokolla

Vankka fosfoproteominen työnkulku yhdistää tehokkaan proteiinien uuton, entsymaattisen pilkkomisen ja fosfopeptidirikastuksen. Seuraavassa esitellään vakiintuneita parhaita käytäntöjä, jotka on mukautettu sonikointiin perustuvaan valmistukseen:

1. Nopea näytteen sammuttaminen ja kerääminen
   Solut tai kudokset sammuvat nopeasti. – yleisesti pikapakastamalla – fosforylaatiotilojen säilyttämiseksi. Tämä vaihe on ratkaisevan tärkeä fosforylaatiotapahtumien ohimenevän luonteen vuoksi.
2. Solujen ultraäänilyysi ja proteiinien uuttaminen
   Näytteet sulatetaan ja niille tehdään sonikointi, yleensä lyhyissä sykleissä. Ultraäänienergia rikkoo solukalvot ja vapauttaa proteiinit tehokkaasti. Validoiduissa työnkuluissa sonikointi suoritetaan useissa sykleissä täydellisen lyysauksen varmistamiseksi.
   Esimerkki: Esimerkki: Kun näytteet oli sulatettu jäässä, solujen lyysi saavutettiin sonikoimalla, esim. Vialtweeter-laitteella 2 syklin ajan, kukin sykli 1 min.
3. Selkeytys ja proteiinien kvantifiointi
   Lyysin jälkeen näytteet sentrifugoidaan roskien poistamiseksi. Liukoisia proteiineja sisältävä supernatantti kerätään ja kvantifioidaan, jotta voidaan varmistaa, että näytteet ovat yhdenmukaisia.
4. Pelkistäminen ja alkylointi
   Disulfidisidoksia pelkistetään (esim. DTT:n avulla) ja alkyloidaan (esim. IAA:n avulla) proteiinien stabiloimiseksi ja sulatuksen tehokkuuden parantamiseksi.
5. proteolyyttinen pilkkominen
   Proteiinit pilkotaan entsymaattisesti, tyypillisesti trypsiinillä, jolloin saadaan massaspektrometriseen analyysiin soveltuvia peptidejä. Lue lisää ultraäänellä kiihdytetystä proteiinin sulatuksesta!
6. Peptidien puhdistus ja suolanpoisto
   Peptidit puhdistetaan C18-pohjaisilla menetelmillä LC-MS-analyysia häiritsevien epäpuhtauksien poistamiseksi.
7. Fosfopeptidien rikastaminen
   Koska fosforyloituja peptidejä on vähän, fosfopeptidien valikoivaan eristämiseen käytetään rikastustekniikoita, kuten Fe-NTA- tai TiO₂-affiniteettimenetelmiä.
8. LC-MS/MS-analyysi ja tietojen käsittely
   Rikastetut näytteet analysoidaan korkean resoluution massaspektrometrialla, jossa käytetään usein DIA-menetelmää (data-independent acquisition), joka parantaa kvantifiointia ja toistettavuutta.

Laajamittaiset työnkulut voidaan mukauttaa 96-kuoppalevyihin, mikä mahdollistaa jopa satojen näytteiden rinnakkaisen käsittelyn. – lähestymistapa on täysin yhteensopiva UIP400MTP-pohjaisen sonikaation kanssa.
 

Optimoitu protokolla nopeaa fosfoproteomin sammutusta, fosfopeptidirikastusta ja Phos-DIA-MS:ää varten.
Pöytäkirja ja kuva: ©Die et al. 2023.

Toistettavuuden ja tietojen laadun parantaminen sonikaation avulla

Yksi fosfoproteomiikan keskeisistä haasteista on saada aikaan johdonmukainen kvantifiointi suurissa tietokokonaisuuksissa. Näytteen valmistuksen aikana syntyvä vaihtelu voi peittää biologisesti merkitykselliset erot.

Sonikaatio ratkaisee tämän tarjoamalla:

1. Vakioitu energiapanos näytteissä
2. Pienempi manuaalinen vaihtelu
3. Parempi toistettavuus proteiinien uuttamisessa ja pilkkomisessa

Yhdistettynä UIP400MTP:n kaltaisiin korkean läpimenon alustoihin laboratoriot voivat saavuttaa johdonmukaisuuden tason, joka on välttämätön systeemibiologisissa tutkimuksissa ja kliinisten biomarkkereiden löytämisessä.

Fosfoproteomiikan tulevaisuus: Fosforoposmopografia: automatisointi ja skaalautuvuus: automaatio ja skaalautuvuus

Fosfoproteomiikan laajentuessa laajamittaisiin ja kliinisiin sovelluksiin automatisoinnin ja läpimenotehon kysyntä vain kasvaa. Sonikaatioon perustuva näytteenvalmistus, erityisesti integroituna mikrolevy-yhteensopiviin järjestelmiin, on keskeinen mahdollistava teknologia.
Yhdistämällä tehokkaan ultraäänilyysin, rinnakkaiskäsittelyn ja yhteensopivuuden automatisoitujen työnkulkujen kanssa VialTweeterin ja UIP400MTP:n kaltaiset laitteet asettavat uusia standardeja proteomiikan näytteenvalmistuksessa.
Lue lisää UIP400MTP:n integroinnista automatisoituihin laboratoriotyöprosesseihin!

Hyödynnä sonikaatioavusteista näytteenvalmistusta fosfoproteomiikan tutkimuksessa!

Sonikaatioavusteisesta proteiinien uuttamisesta on tullut kriittinen osa nykyaikaista fosfoproteomiikkaa, sillä se tarjoaa vertaansa vailla olevaa tehokkuutta, skaalautuvuutta ja toistettavuutta. Kun monimutkaisten biologisten järjestelmien analysointi suurissa näytekohorteissa on yhä tärkeämpää, ultraäänitekniikat eivät ole vain edullinen vaihtoehto. – ne ovat välttämättömiä.
VialTweeterin ja UIP400MTP:n kaltaiset ratkaisut mahdollistavat korkean läpimenon ja standardoidut työnkulut, ja ne nopeuttavat solusignaalien välittämiseen, tautimekanismeihin ja täsmälääketieteeseen liittyviä löytöjä.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa

Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.

Hielscher Multi-Sample Sonicator -mallit UIP400MTP mikrolevyille, VialTweeter ja CupHorn: nopea ja läpimenevä näytteenvalmistus.