Kromatiinin leikkaaminen sonikaatiolla
Kromatiinin leikkaaminen on kriittinen vaihe monissa epigenetiikan ja molekyylibiologian työnkuluissa, erityisesti kromatiinin immunoprecipitaatiossa (ChIP), ChIP-seq:ssa ja vastaavissa määrityksissä. Tavoitteena on fragmentoida kromatiini toistettaviksi DNA-proteiinikomplekseiksi säilyttäen samalla epitooppien eheys ja minimoiden näytteiden hävikki. Käytettävissä olevista menetelmistä ultraäänikromatiinin fragmentoinnista on tullut laajalti käytetty menetelmä, koska se tarjoaa luotettavan, reagenssittoman fragmentoinnin, jonka toistettavuus on erinomainen.
Mitä minun pitäisi ottaa huomioon, kun leikkaan kromatiinia?
Tehokas kromatiinin leikkaus edellyttää kokeellisten parametrien huolellista hallintaa. Epäasianmukainen fragmentointi voi vaarantaa ChIP-kokeiden jatkokäsittelyn tuottamalla joko liian suuria, liian hajanaisia tai näytteiden välillä epäjohdonmukaisia fragmentteja.
Yksi tärkeimmistä tekijöistä on haluttu fragmenttikokojakauma. Useimmissa ChIP- ja ChIP-seq-sovelluksissa kromatiinifragmentit, joiden koko on 100-600 emäsparia, ovat optimaalisia. Tämä kokoluokka mahdollistaa tehokkaan immunoprecipitaation ja tarjoaa samalla riittävän resoluution genomikartoitusta varten.
Toinen keskeinen tekijä on ristisilloituksen tehokkuus ennen sonikointia. Useimmissa ChIP-työprosesseissa käytetään formaldehydifiksaatiota proteiini-DNA-vuorovaikutusten vakauttamiseksi. Liiallinen ristisilloittaminen voi kuitenkin tehdä kromatiinista vastustuskykyisempää fragmentoitumiselle, mikä edellyttää pidempiä sonikointiaikoja ja mahdollisesti lisää lämpöaltistusta.
Lämpötilan säätö on myös ratkaisevan tärkeää. Sonikaatio tuottaa paikallista energiaa, joka voi nostaa näytteen lämpötilaa. Kohonnut lämpötila voi vahingoittaa DNA:ta tai denaturoida proteiineja, mikä vaikuttaa vasta-aineen tunnistamiseen ChIP:n aikana. Monet tutkijat suorittavat sen vuoksi pulssitettuja sonikointisyklejä yhdistettynä jäähdytysjaksoihin näytteen vakauden säilyttämiseksi.
Näytteen konsentraatio ja tilavuus vaikuttavat myös fragmentointitehokkuuteen. Erittäin konsentroituneet kromatiinisuspensiot saattavat vaatia pidempiä sonikointiaikoja, kun taas pienet näytetilavuudet edellyttävät tarkkaa energian syöttöä ylikäsittelyn välttämiseksi.
Lisäksi sonikointilaitteen valinta vaikuttaa voimakkaasti kokeiden toistettavuuteen. Kromatiinin leikkaamiseen suunnitellut laitteet tarjoavat yleensä kontrolloitua ultraäänienergiaa ja standardoitua näytteen käsittelyä, mikä mahdollistaa yhdenmukaisen fragmentoinnin useissa näytteissä.
Ultraääni-DNA-leikkaus ChIP: n aikana – kromatiinin immunosaostus
Mikä Sonicator pitäisi valita kromatiinin leikkaamiseen?
Erilaiset laboratorion työnkulut edellyttävät erilaisia sonikointikonfiguraatioita. Optimaalinen järjestelmä riippuu pitkälti näytteen läpimenosta, tilavuudesta ja koemuodosta.
Songe-tyyppinen Sonicator
Sondityyppinen kaikuluotain tuottaa ultraäänienergiaa suoraan näytteeseen titaanisen luotaimen kautta. Tämä konfiguraatio tuottaa erittäin suuren energiatiheyden ja soveltuu siksi yksittäisten näytteiden vankkaan kromatiinin hajottamiseen.
Sonikaattorit ovat erityisen käyttökelpoisia:
- Pienet ja keskisuuret näytemäärät
- Vaikeasti hajoava kromatiini
- Joustavat koeprotokollat
Multi-Tube Sonicator - VialTweeter
Useita näytteitä samanaikaisesti käsitteleville laboratorioille VialTweeter-moniputkiäänilaite tarjoaa erittäin toistettavan ratkaisun. Järjestelmä lähettää ultraäänienergiaa epäsuorasti injektiopullon pidikkeen läpi, jolloin useita suljettuja putkia voidaan pirstoa identtisissä olosuhteissa.
Tämä kokoonpano tarjoaa merkittäviä etuja:
- Rinnakkainen kromatiinin leikkaus useista näytteistä
- Anturin saastumisen poistaminen
- Korkea toistettavuus putkien välillä
- Yksinkertaistettu työnkulku ChIP-näytteiden valmisteluun
Tällaiset moniputkijärjestelmät soveltuvat hyvin rutiininomaisiin ChIP-kokeisiin ja keskinkertaisen läpimenon tutkimuksiin.
Mikrolevyjen Sonicator - UIP400MTP
Suuren läpimenon epigeneettiset tutkimukset perustuvat yhä useammin mikrolevyihin perustuvaan näytteiden käsittelyyn. UIP400MTP-mikrolevykuvauslaite on suunniteltu fragmentoimaan kromatiinia suoraan standardimikrolevyissä ilman näytteiden siirtämistä.
Tämä lähestymistapa mahdollistaa:
- Kymmenien tai satojen näytteiden samanaikainen käsittely
- Automaatioystävälliset työnkulut
- Ultraäänienergian tasainen jakautuminen kuoppien välillä
- Näytteen käsittelyvaiheiden merkittävä vähentäminen
Suurissa ChIP-seq-seulontahankkeissa tai epigeneettisissä korkean läpimenon tutkimuksissa mikrolevyjen sonikaatio tarjoaa poikkeuksellisen skaalautuvuuden ja tehokkuuden. Monikuoppalevy-äänilaite UIP400MTP soveltuu hyvin seuraaviin tarkoituksiin. integrointi nesteenkäsittelyjärjestelmiin ja automatisoituihin laboratoriotyöprosesseihin.
Miksi valita sonikaatio muiden kromatiinin leikkaustekniikoiden sijaan?
Verrattuna entsymaattisiin menetelmiin ChIP:n sonikointi mahdollistaa puolueettoman fragmentoinnin, koska prosessi ei riipu sekvenssispesifisestä entsyymiaktiivisuudesta. Tämä on erityisen tärkeää koko genomin laajuisissa epigeneettisissä tutkimuksissa, joissa yhtenäinen kattavuus on välttämätöntä.
Toinen merkittävä etu on skaalautuvuus. Ultraäänijärjestelmiin voidaan sijoittaa yksittäisiä näytteitä, useita putkia tai kokonaisia mikrolevyjä, jolloin laboratoriot voivat valita kokeelliseen läpimenoonsa parhaiten sopivan kokoonpanon.
Lopuksi voidaan todeta, että sonikointi mahdollistaa pirstoutumisparametrien erinomaisen hallinnan. Säätämällä pulssisyklejä, kestoa ja tehotasoja tutkijat voivat luotettavasti saavuttaa halutun fragmenttikokojakauman.
Kromatiinin fragmentoituminen ChIP-näytteiden optimoidulla sonikaatiolla.
(a) ei leikkausta (pitkät fragmentit geelissä);
(b) optimaalinen fragmentaatioprofiili (200-600 bp:n fragmenttien rikastuminen);
(c) DNA:n liiallinen fragmentoituminen (yli 200 bp:n pituisten fragmenttien yliedustus).
© Jarillo et al., 2018
Kromatiinin leikkaustekniikoiden vertailu
| Kromatiinin leikkausmenetelmä | Periaate | Etuja | Rajoitukset |
| Ultraäänellä | Korkeataajuinen akustinen energia pirstoo mekaanisesti kromatiinia. | Reagenssivapaa fragmentointi, erittäin hyvin toistettavat tulokset, säädettävä fragmenttikokojakauma, yhteensopiva ristisilloitetun kromatiinin kanssa, skaalautuva yksittäisistä putkista moninäyte- ja mikrolevymuotoihin. | Vaatii sonikointilaitteiston ja sonikointiparametrien optimoinnin. |
| Entsymaattinen pilkkominen (MNaasi) | Mikrokokkinukleaasi pilkkoo DNA:ta nukleosomien välissä. | Hellävarainen fragmentaatio ja hyödyllinen natiivikromatiinianalyysissä. | Entsyymiharha, sekvenssipreferenssi, vaikeasti hallittavissa oleva pilkkominen, mahdollinen vaihtelu kokeiden välillä. |
| Mekaaninen leikkaus (neula/ruisku) | Kromatiini rikkoutuu toistuvan fyysisen voiman avulla. | Yksinkertainen menetelmä, joka vaatii vain vähän laitteita. | Huono toistettavuus, fragmenttien koon rajoitettu hallinta, työläs useiden näytteiden osalta. |
| Sumutus | Paineilma pakottaa DNA:n pienten aukkojen läpi ja aiheuttaa pirstoutumista. | Nopea pirstoutumisprosessi. | Mahdollinen näytteiden hävikki, rajoitettu skaalautuvuus, vaatii erikoislaitteita. |
Miten kromatiinin saanto kvantifioidaan ja kvalifioidaan ultraäänifragmentoinnin jälkeen?
ChIP:n sonikaation jälkeen tutkijoiden on arvioitava sekä fragmentoituneen kromatiinin määrä että laatu. Tällä varmennusvaiheella varmistetaan, että kromatiinin fragmentoituminen täyttää jatkokäsittelyssä käytettävien sovellusten, kuten ChIP-qPCR:n tai ChIP-seq:n, vaatimukset.
Kvantifiointi aloitetaan yleensä DNA:n pitoisuuden mittaamisella. Spektrofotometriset menetelmät, kuten Nanodrop-analyysi, tai fluorometriset määritykset, kuten Qubit-DNA:n kvantifiointi, antavat luotettavia arvioita kromatiinin saannista dekrussidonnan ja puhdistuksen jälkeen.
Pelkkä DNA-konsentraatio ei kuitenkaan paljasta, onnistuiko pirstoutuminen. Tutkijat arvioivat siksi fragmenttien kokojakaumaa elektroforeettisilla tekniikoilla. Agaroosigeelielektroforeesi on edelleen yleisesti käytetty menetelmä DNA-fragmenttien visualisoimiseksi ja sen tarkistamiseksi, että suurin osa niistä kuuluu tavoitekokoluokkaan.
Edistyneemmissä laboratorioissa käytetään usein kapillaarielektroforeesijärjestelmiä, kuten Agilent Bioanalyzer tai TapeStation. Näillä alustoilla saadaan tarkkoja kokojakaumaprofiileja, ja tutkijat voivat havaita liiallisen fragmentoitumisen tai epätäydellisen leikkauksen.
Kun tutkijat arvioivat kromatiinin laatua ultraäänifragmentoinnin jälkeen, he yleensä varmistavat:
- Suurin osa DNA-fragmenteista on 100-600 bp:n pituisia.
- Fragmenttien jakauma on yhdenmukainen eri näytekerroissa.
- DNA:n hajoaminen on vähäistä
- Kromatiinin kokonaistuotos on riittävä suunniteltua ChIP-testiä varten.
Asianmukaisella laadunvalvonnalla varmistetaan, että kromatiinin leikkaus ultraäänellä tuottaa toistettavia ja biologisesti merkityksellisiä tuloksia.
Johtopäätökset: Kromatiinin leikkaaminen ultraäänellä luotettavaa tutkimusta varten
Luotettava kromatiinin leikkaus on olennaisen tärkeää ChIP- ja epigeneettisen tutkimuksen onnistumiselle. Ultraäänifragmentointi tarjoaa tehokkaan ratkaisun, koska se mahdollistaa tarkan, toistettavan ja reagenssivapaan kromatiinin hajottamisen useissa eri koemuodoissa.
Optimoimalla sonikaatioparametrit huolellisesti, tarkistamalla fragmenttien kokojakauma ja valitsemalla sopiva sonikaatiojärjestelmä. – olipa kyseessä sitten anturityyppinen kaikuluotain, moniputkinen VialTweeter tai suuritehoinen UIP400MTP-mikrolevykuulain. – Tutkijat voivat saada aikaan johdonmukaisen kromatiinifragmentaation, joka tukee korkealaatuisia ChIP- ja ChIP-seq-tuloksia.
Koska epigenetiikan tutkimus laajenee jatkuvasti kohti suurempaa läpimenoa ja suurempaa kokeellista toistettavuutta, kromatiinin ultraäänileikkaus on edelleen yksi monipuolisimmista ja luotettavimmista nykyaikaisissa molekyylibiologian laboratorioissa käytettävissä olevista menetelmistä.
Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa
Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.
UIP400MTP:ssä sonisoitu putkihylly kromatiinin leikkaamista varten.
Kirjallisuus / Viitteet
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Usein Kysytyt Kysymykset
Mikä on kromatiini?
Kromatiini on DNA:sta ja siihen liittyvistä proteiineista koostuva rakennekompleksi, joka järjestää geneettisen materiaalin eukaryoottisolujen ytimessä. Kromatiinin tärkeimmät proteiinit ovat histonit, joiden ympärille DNA kietoutuu nukleosomeiksi. Tämä organisaatio tiivistää DNA:ta ja säätelee samalla geneettisen informaation saatavuutta prosesseissa, kuten transkriptiossa, replikaatiossa ja DNA:n korjauksessa.
Mitkä ovat kromatiinin tyypit?
Kromatiini luokitellaan yleisesti kahteen päämuotoon: euchromatiiniin ja heterokromatiiniin. Eukromatiini on löyhästi pakattua ja transkriptiivisesti aktiivista, jolloin transkriptiokoneisto pääsee helposti käsiksi geeneihin. Heterokromatiini on tiheämmin pakattu ja transkriptiivisesti inaktiivinen, ja se sisältää tyypillisesti toistuvia DNA-sekvenssejä tai geenejä, jotka on vaiennettu. Heterokromatiini voidaan jakaa edelleen konstitutiiviseen heterokromatiiniin, joka pysyy pysyvästi tiivistyneenä, ja fakultatiiviseen heterokromatiiniin, joka voi vaihtaa aktiivisen ja inaktiivisen tilan välillä soluolosuhteiden mukaan.
Mitä on ristiinlinkitys?
Ristikytkentä on biokemiallinen prosessi, jota käytetään biomolekyylien välisten vuorovaikutusten vakauttamiseen muodostamalla niiden välille kovalenttisia sidoksia. Kromatiinitutkimuksessa ristisilloittamista käytetään yleisesti proteiini-DNA-vuorovaikutusten säilyttämiseen kromatiinin sisällä ennen analyysia. Kemiallisia aineita, kuten formaldehydiä, käytetään tyypillisesti luomaan palautuvia kovalenttisia sidoksia DNA:n ja siihen liittyvien proteiinien välille, jolloin ne tehokkaasti “jäädyttäminen” molekyylien vuorovaikutukset tietyllä hetkellä. Tämä vakauttaminen mahdollistaa kromatiinikompleksien pirstomisen ja prosessoinnin menettämättä DNA:n ja säätelyproteiinien välisiä natiiviyhteyksiä, mikä on olennaista kromatiinin immunoprecipitaation (ChIP) kaltaisten tekniikoiden kannalta.
Mikä on ChIP?
Kromatiinin immunoprecipitaatio (ChIP) on molekyylibiologinen tekniikka, jota käytetään proteiinien ja DNA:n välisten vuorovaikutusten tutkimiseen kromatiinissa. Menetelmässä DNA-proteiinikompleksit stabiloidaan ensin, yleensä ristisilloittamalla, ja kromatiini pirstotaan sen jälkeen. Kohteena olevalle proteiinille spesifisiä vasta-aineita käytetään proteiini-DNA-kompleksien immunoprecipitaatioon, jolloin niihin liittyvät DNA-sekvenssit voidaan eristää ja analysoida.
Mihin ChIP:tä käytetään?
ChIP:tä käytetään tunnistamaan genomialueita, joihin sitoutuu tiettyjä DNA:han assosioituneita proteiineja, kuten transkriptiotekijöitä, histonimodifikaatioita tai kromatiiniin assosioituneita säätelyproteiineja. Tekniikkaa käytetään laajalti geenien säätelyn, epigeneettisten modifikaatioiden, transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtien ja kromatiinin rakenteen tutkimiseen. Kun se yhdistetään jatkoanalyysimenetelmiin, kuten kvantitatiiviseen PCR:ään (ChIP-qPCR) tai korkean läpimenon sekvensointiin (ChIP-seq), se mahdollistaa proteiini-DNA-vuorovaikutusten kartoittamisen koko genomin laajuisesti.
Mitkä ovat ChIP-tyypit?
Kromatiinin immunoprecipitaatiosta on olemassa useita muunnelmia, jotka riippuvat koesuunnitelmasta ja jatkoanalyysistä. Yleisimpiä lähestymistapoja ovat ChIP-qPCR, jolla mitataan tiettyjen genomialueiden rikastumista, ChIP-seq, jossa käytetään seuraavan sukupolven sekvensointia proteiinien ja DNA:n vuorovaikutusten kartoittamiseen koko genomissa, ja ChIP-chip, jossa yhdistetään ChIP ja DNA-mikrosarja-analyysi. Muita muunnelmia, kuten natiivia ChIP:tä (N-ChIP), jossa analysoidaan ristisilloittumatonta kromatiinia, ja ristisilloitettua ChIP:tä (X-ChIP), jossa käytetään kemiallista ristisilloittamista proteiinin ja DNA:n vuorovaikutusten stabiloimiseksi, käytetään myös laajalti tutkittavasta biologisesta kysymyksestä riippuen.
Korkean läpimenon kromatiinin leikkaus UIP400MTP-mikrolevykuvauslaitteella.
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita laboratorio jotta Teollisuuden koko.