Ultraschall-Zelldisaggregation bakterieller Proben

Bakterielle Proben liegen selten als echte Einzelzellsuspensionen vor. Kulturen wachsen in Ketten und Flocken, Umweltisolate bilden Aggregate, die durch extrazelluläre polymere Substanzen zusammengehalten werden, und zentrifugierte Pellets lassen sich trotz gründlichen Vortexens oft nur schwer resuspendieren. Die Bestimmung der Lebendzellzahl, die Messung der optischen Dichte, die Durchflusszytometrie und die Mikrobiomprofilierung setzen alle voraus, dass ein Partikel einer Zelle entspricht. Die Ultraschall-Zelldisaggregation löst diesen Widerspruch: Kurze, kontrollierte Beschallungsimpulse trennen Aggregate in einzelne Zellen, ohne sie zu lysieren.

Warum Zellaggregation Ihre Ergebnisse beeinträchtigt

Aggregation ist ein biologisches Merkmal und kein Fehler bei der Probenvorbereitung. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces und viele Umweltkeime wachsen in Ketten, Zellverbänden oder Biofilmfragmenten, und extrazelluläre DNA und Polysaccharide verkleben Zellen in Pellets und Abstricheluaten miteinander. Die Folgen für die Analytik sind systematisch:

• Koloniezahlen werden unterschätzt, da ein Zellklumpen eine Kolonie bildet, unabhängig davon, wie viele Zellen er enthält.
• Messungen der optischen Dichte und Partikelzähler erfassen Aggregate statt Zellen und verfälschen dadurch Wachstumskurven.
• Durchflusszytometrie und Zellsortierung zählen Ereignisse mit verklumpten Zellen falsch und schließen sie von der Analyse aus.
• DNA- und Proteinextraktionen repräsentieren nur die Zellen an der Aggregatoberfläche und verfälschen dadurch Mikrobiom- und Omics-Daten.

Herkömmliche Abhilfemaßnahmen sind langsam, unvollständig oder bewirken chemische Veränderungen. Intensives Pipettieren und Vortexen lassen Mikroaggregate zurück. Eine enzymatische oder chelatorbasierte Dispergierung verändert die Zelloberfläche, die Sie möglicherweise analysieren möchten. Die mechanische Disaggregation durch kontrollierte Kavitation wirkt innerhalb von Sekunden und erfordert keine Zusatzstoffe.

Wie Beschallung Zellen disaggregiert, ohne sie zu lysieren

Die Ultraschall-Zelldisaggregation nutzt einen Unterschied in der mechanischen Festigkeit. Bakterielle Aggregate werden durch relativ schwache interzelluläre Bindungen und eine extrazelluläre Matrix zusammengehalten, während eine intakte Zellhülle wesentlich höheren Scherbelastungen standhält. Wenn kalibrierter Ultraschall in die Suspension eingekoppelt wird, erzeugt akustische Kavitation Mikroströmungen, Druckimpulse und Scherkräfte, die zunächst an den Grenzflächen der Aggregate wirken. Zellklumpen, Ketten und Biofilmfragmente werden durch Scherung getrennt (Deagglomeration), bevor das Energieniveau erreicht wird, bei dem Membranen aufbrechen (Lyse).

Ultraschalldisaggregation bakterieller Zellklumpen

Disaggregation oder Lyse – welche Rolle die Beschallungsparameter spielen

In der Praxis bedeutet dies, dass Disaggregation und Lyse mit demselben Gerät bei unterschiedlichen Parametern durchgeführt werden. Bei moderater Amplitude, kurzen gepulsten Zyklen und kontrollierter Temperatur erhalten Sie eine lebensfähige Einzelzellsuspension. Eine Erhöhung der Amplitude, der Beschallungsdauer oder der Probentemperatur verschiebt den Prozess hin zum vollständigen Zellaufschluss zur Gewinnung intrazellulärer Zielsubstanzen. Mit den Generatoren von Hielscher können Sie Amplitude, Leistung, Puls und Energieeintrag präzise einstellen und die Methode speichern, sodass der Disaggregationsschritt über verschiedene Proben, Bedienpersonen und Durchläufe hinweg reproduzierbar ist.

Effiziente kontaktlose Beschallung

Die Beschallung im Ultraschallbad bietet keine vergleichbare Kontrolle. Ultraschallreinigungsbäder und -tanks stellen nur geringe Ultraschallenergie bereit, was zu einer unvollständigen Probenvorbereitung führt, und die Kavitation tritt ungleichmäßig auf, sodass jedes Röhrchen entsprechend seiner Position im Bad behandelt wird. Der VialTweeter überträgt intensive, fokussierte Ultraschallkräfte direkt durch die Gefäßwand in bis zu 10 verschlossene Proben gleichzeitig. Behandlungen, die im Bad eine lange, variable Beschallungsdauer erfordern, werden mit einem standardisierten Pulsmuster abgeschlossen.
Die kontaktlosen Ultraschallgeräte von Hielscher koppeln intensiven, fokussierten Ultraschall durch die Wände verschlossener Vials ein. Der VialTweeter behandelt bis zu 10 Vials gleichzeitig bei identischer Intensität, ohne Sonotrode in der Probe, ohne Kreuzkontamination und ohne Freisetzung von Aerosolen. Wenn der Probendurchsatz es erfordert, erweitern die Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräte UIP400MTP und UIP550MTP dieselbe kontrollierte Energieübertragung auf Multiwell-Platten.

Vorteile der kontaktlosen Ultraschalldisaggregation

• Keine Kreuzkontamination: Da die Vials durchgehend geschlossen bleiben und keine Sonotrode in die Probe eingetaucht wird, werden Kreuzkontamination und Probenverlust vollständig vermieden. Zwischen den Proben muss nichts sterilisiert werden, und ein Durchlauf kann den nächsten nicht beeinflussen.
• Aerosolschutz: Die offene Beschallung mit einer Sonotrode erzeugt infektiöse Aerosole und kontaminiert Geräteoberflächen. Bei der Beschallung verschlossener Vials bleibt die Probe in ihrem eigenen Röhrchen eingeschlossen. Dies ist beim Umgang mit pathogenen Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis und anderen BSL-2- oder BSL-3-Erregern von Bedeutung.
• Keine Erosion der Sonotrodenspitze: Titansonotroden können während des Betriebs geringe Mengen an Mikropartikeln in die Probe abgeben. Diese Partikel verändern die optische Dichte und die Partikelzahlen bei nachfolgenden Messungen. Die indirekte Beschallung durch die Gefäßwand beseitigt diese Feststoffquelle vollständig.
• Gleichmäßige Probenbehandlung: Der VialTweeter überträgt dieselbe Ultraschallintensität auf jedes der bis zu 10 Vials, sodass die Beschallungsergebnisse gleichmäßig und reproduzierbar sind. Positionseffekte, die bei Bädern und der Beschallung einzelner Proben mit einer Sonotrode Probleme verursachen, entfallen, und Ihre Ausgangswerte bleiben über Replikate hinweg vergleichbar.
• Probenintegrität: Die Röhrchen bleiben während der gesamten Behandlung geschlossen, sodass die Probe weder kontaminiert werden noch verderben oder sich verflüchtigen kann. Kleine Volumina lassen sich ohne Verdünnung behandeln, einschließlich wertvoller klinischer Pellets, bei denen ein zusätzlicher Überführungsschritt nicht vertretbar ist.
• Prozesskontrolle: Die Amplitude ist von 20 bis 100% einstellbar, der Pulsmodus von 0 bis 100%, und die Systeme unterstützen die Temperaturüberwachung, sodass temperaturempfindliche Stämme und Proteine unterhalb schädigender Temperaturschwellen bleiben.

Typische Anwendungen

• Mikrobiom- und Darminhaltsanalyse: Dispergierung von Lactobacillus, Bifidobacterium und Stuhlproben vor dem Ausplattieren oder der Sequenzierung, damit Zellklumpen nicht zu niedrigeren Zählwerten führen.
• Lebensmittel- und Wassermikrobiologie: Disaggregation von Flocken in Abstrichen, Spülproben und Anreicherungsbouillons für eine genaue Bestimmung der Koloniezahl und der Lebensfähigkeit.
• Biofilmforschung: Gewinnung von Zellen von Trägern und Oberflächen als Einzelzellsuspensionen, ohne enzymatische Behandlung, die Oberflächenproteine entfernen würde.
• Klinische Diagnostik: Resuspendierung von Sputum, Eiter und Abstricheluaten unter Containment-Bedingungen.
• Zellkultur: Trennung verklumpter Säugetier-, Insekten- und CHO-Zellaggregate vor dem Zählen und Passagieren.
• Probenvorbereitung für den gesamten Arbeitsablauf: Dasselbe Gerät, das bei niedriger Amplitude disaggregiert, führt bei höheren Einstellungen einen vollständigen Zellaufschluss durch, sodass Lyse, Proteinextraktion und DNA-Fragmentierung ohne Überführung in andere Röhrchen folgen.

Literatur / Referenzen

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
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