Ultraschall-gestützte Zell-Deagglomerierung von Bakterienproben

Bakterienproben liegen selten als echte Einzelzellsuspensionen vor. Kulturen wachsen in Ketten und Flocken, Umweltisolate bilden Aggregate, die durch extrazelluläre polymere Substanzen gebunden sind, und zentrifugierte Pellets lassen sich trotz gründlichem Vortexen oft nicht resuspendieren. Lebensfähigkeitszählungen, optische Dichte, Durchflusszytometrie und Mikrobiomprofilierung gehen alle davon aus, dass ein Partikel einer Zelle entspricht. Die ultraschallgestützte Zelldisaggregation löst diesen Konflikt: Kurze, kontrollierte Ultraschallimpulse trennen Aggregate in einzelne Zellen auf, ohne diese zu lysieren.

Warum Zellaggregation Ihre Ergebnisse beeinträchtigt

Die Aggregation ist ein biologisches Phänomen und kein Fehler bei der Probenvorbereitung. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces und viele Umweltkeime wachsen in Ketten, Clustern oder Biofilmfragmenten, und extrazelluläre DNA sowie Polysaccharide verbinden die Zellen in Pelletproben und Abstrich-Eluaten miteinander. Die analytischen Konsequenzen sind systematischer Natur:

• Die Koloniezahlen werden unterschätzt, da ein Klumpen als eine Kolonie gezählt wird, unabhängig davon, wie viele Zellen er enthält.
• Optische Dichte- und Partikelzähler erfassen Aggregate anstelle von Zellen, was zu einer Verzerrung der Wachstumskurven führt.
• Bei der Durchflusszytometrie und der Zellsortierung werden verklumpte Ereignisse falsch gezählt und aus der Analyse ausgeschlossen.
• Bei der DNA- und Proteinextraktion werden lediglich die Zellen auf der Oberfläche des Aggregats berücksichtigt, was zu einer Verzerrung der Mikrobiom- und Omics-Daten führt.

Herkömmliche Verfahren sind langsam, unvollständig oder führen zu chemischen Veränderungen. Durch kräftiges Pipettieren und Vortexen bleiben Mikroaggregate zurück. Die enzymatische oder chelatbasierte Dispersion verändert die Zelloberfläche, die Sie möglicherweise analysieren möchten. Die mechanische Disaggregation durch kontrollierte Kavitation wirkt innerhalb von Sekunden und erfordert keine Zusatzstoffe.

Wie die Ultraschallbehandlung Zellen auflöst, ohne sie zu lysieren

Bei der Ultraschall-Zelldisaggregation wird ein Unterschied in der mechanischen Festigkeit ausgenutzt. Bakterielle Aggregate werden durch relativ schwache interzelluläre Bindungen und eine extrazelluläre Matrix zusammengehalten, während eine intakte Zellhülle wesentlich höheren Scherkräften standhält. Wenn kalibrierter Ultraschall in die Suspension eintritt, erzeugt akustische Kavitation Mikroströmungen, Druckimpulse und Scherkräfte, die zunächst an den Grenzflächen der Aggregate wirken. Klumpen, Ketten und Biofilmfragmente werden auseinandergerissen (Deagglomeration), bevor das Energieniveau erreicht wird, bei dem die Membranen reißen (Lyse).

Ultraschall-Disaggregation von Bakterienzellklumpen

Disaggregation oder Lyse – Die Bedeutung der Ultraschallparameter

In der Praxis bedeutet dies, dass Disaggregation und Lyse mit demselben Gerät bei unterschiedlichen Parametern durchgeführt werden. Bei mäßiger Amplitude, kurzen Impulszyklen und kontrollierter Temperatur erhält man eine lebensfähige Einzelzellsuspension. Durch Erhöhen der Amplitude, der Einwirkzeit oder der Probentemperatur wird der Prozess in Richtung eines vollständigen Zellaufschlusses für intrazelluläre Ziele verschoben. Mit Hielscher-Generatoren können Sie Amplitude, Leistung, Impuls und Energiezufuhr präzise einstellen und die Methode speichern, sodass der Disaggregationsschritt über Proben, Bediener und Durchläufe hinweg reproduzierbar ist.

Effiziente berührungslose Ultraschallbehandlung

Die Ultraschallbehandlung im Bad kann diese Präzision nicht erreichen. Ultraschallreinigungsbäder und -behälter liefern nur geringe Ultraschallenergie, was zu einer unvollständigen Aufbereitung führt, und die Kavitation erfolgt ungleichmäßig, sodass jedes Röhrchen entsprechend seiner Position im Bad behandelt wird. Der VialTweeter überträgt intensive, gebündelte Ultraschallkräfte direkt durch die Gefäßwand auf bis zu 10 verschlossene Proben gleichzeitig. Behandlungen, die eine lange, variable Einwirkzeit in einem Bad erfordern, werden in einem standardisierten Impulsmuster durchgeführt.
Die berührungslosen Ultraschallgeräte von Hielscher übertragen intensiven, fokussierten Ultraschall durch die Wände geschlossener Fläschchen. Der VialTweeter verarbeitet bis zu 10 Fläschchen gleichzeitig mit identischer Intensität – ohne Sonde in der Probe, ohne Kreuzkontamination und ohne Aerosolbildung. Wo der Durchsatz es erfordert, übertragen die Mikroplatten-Ultraschallgeräte UIP400MTP und UIP550MTP dieselbe kontrollierte Energieübertragung auf Multiwell-Platten.

Vorteile der berührungslosen Ultraschall-Disaggregation

• Keine Kreuzkontamination: Da die Probenfläschchen dauerhaft verschlossen bleiben und keine Sonde in die Probe eingetaucht wird, werden Kreuzkontaminationen und Probenverluste vollständig vermieden. Zwischen den einzelnen Proben muss nichts sterilisiert werden, und ein Durchlauf hat keinen Einfluss auf den nächsten.
• Schutz vor Aerosolen: Bei der Ultraschallbehandlung mit offener Sonde entstehen infektiöse Aerosole, die die Oberflächen der Geräte kontaminieren. Bei der Ultraschallbehandlung in verschlossenen Röhrchen bleibt die Probe in ihrem eigenen Röhrchen eingeschlossen, was beim Umgang mit pathogenen Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis und anderen BSL-2- oder BSL-3-Erregern von Bedeutung ist.
• Keine Verringerung des Trinkgeldes: Titan-Sonden können während des Betriebs eine geringe Menge an Mikropartikeln in die Probe abgeben. Diese Partikel verändern die optische Dichte und die Partikelzahl im nachgeschalteten Bereich. Durch indirekte Ultraschallbehandlung durch die Behälterwand wird diese Quelle von Feststoffen vollständig beseitigt.
• Gleichmäßiger Durchsatz: Der VialTweeter liefert an jedes der bis zu 10 Fläschchen die gleiche Ultraschallintensität, sodass die Ultraschallbehandlungsergebnisse gleichmäßig und reproduzierbar sind. Positionseffekte, die bei Ultraschallbädern und der Untersuchung einzelner Proben auftreten, entfallen, und Ihre Basislinien bleiben über alle Wiederholungen hinweg vergleichbar.
• Probenintegrität: Die Röhrchen bleiben während des gesamten Verarbeitungsprozesses verschlossen, sodass die Probe weder kontaminiert noch verdorben werden oder verflüchtigen kann. Kleine Volumina können ohne Verdünnung verarbeitet werden, darunter auch wertvolle klinische Pellets, bei denen ein zusätzlicher Umfüllschritt nicht möglich ist.
• Prozesskontrolle: Die Amplitude ist von 20 bis 100 % einstellbar, der Impulsmodus von 0 bis 100 %, und die Systeme unterstützen die Temperaturüberwachung, sodass temperaturempfindliche Stämme und Proteine unterhalb der Schadensschwelle bleiben.

Typische Anwendungen

• Mikrobiom- und Darminhaltsanalyse: Aufschlämmung von Lactobacillus-, Bifidobacterium- und Stuhlproben vor dem Ausplattieren oder der Sequenzierung, damit die Keimzahlen nicht durch Klumpen verfälscht werden.
• Mikrobiologie von Lebensmitteln und Wasser: Aufschlüsselung von Flocken in Abstrichen, Spülproben und Anreicherungsbrühen zur genauen Bestimmung der Kolonienzahl und Lebensfähigkeit.
• Biofilmforschung: Gewinnung von Zellen aus Trägern und Oberflächen als Einzelzellsuspensionen, ohne enzymatische Behandlung, die Oberflächenproteine entfernen würde.
• Klinische Diagnostik: Resuspension von Sputum, Eiter und Abstrich-Eluaten unter Sicherheitsbedingungen.
• Zellkultur: Aufbrechen von Aggregaten aus Säugetierzellen, Insektenzellen und CHO-Zellen vor der Zählung und Passagierung.
• Vorbereitung des gesamten Arbeitsablaufs: Das gleiche Gerät, das bei niedriger Amplitude eine Disaggregation bewirkt, führt bei höheren Einstellungen einen vollständigen Zellaufschluss durch, sodass Lyse, Proteinextraktion und DNA-Fragmentierung ohne Umfüllen in andere Röhrchen erfolgen können.

Literatur / Literaturhinweise