Protokoll für den Minimalen Hemmkonzentration (MIC) Assay

Der Test zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) auf der Grundlage von Biofilmen ist eine wichtige Methode zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Mittel gegen Biofilm-assoziierte Mikroorganismen, die aufgrund ihrer schützenden extrazellulären Matrix eine erhöhte Resistenz aufweisen. Ein entscheidender Schritt bei diesem Test ist das Aufbrechen der Biofilmstrukturen, um die eingebetteten Zellen freizusetzen und die Zellviabilität zu beurteilen. Der Microplate-Sonicator UIP400MTP erleichtert diesen Prozess, indem er fokussierten Ultraschall einsetzt, um kontrollierte Kavitation zu erzeugen, die Biofilmzellen effizient ablöst und sie in eine gleichmäßige Suspension dispergiert. Dieses präzise und reproduzierbare Ablösen des Biofilms erhöht die Zuverlässigkeit und den Durchsatz von MHK-Assays und macht das UIP400MTP zu einem unverzichtbaren Instrument für die Weiterentwicklung der Biofilmforschung.

Sonikation für das Ablösen von Biofilmen

Der biofilmbasierte MHK-Test misst in der Regel die bakterielle Lebensfähigkeit oder Wachstumshemmung mit Methoden wie Ausplattieren, Koloniezählung oder Messung der optischen Dichte. Die Beschallung ist ein entscheidender Schritt bei biofilmbasierten MHK-Tests, wenn es darum geht, die antimikrobielle Empfindlichkeit von Biofilm-assoziierten Mikroorganismen zu bewerten. Ihre Hauptfunktion besteht darin, die in der Biofilm-Matrix eingebetteten Zellen abzulösen und in eine einheitliche Suspension für eine genaue Analyse zu dispergieren.
Biofilme sind im Vergleich zu planktonischen Zellen wesentlich widerstandsfähiger gegen antimikrobielle Mittel, so dass ein genaues Ablösen für zuverlässinge Analyseergebnisse entscheidend ist. Während dieses Prozesses erzeugen Ultraschallwellen eine kontrollierte Kavitation, die die Biofilmmatrix aufbricht und die eingebetteten Zellen in eine einheitliche Suspension im Rückgewinnungsmedium freisetzt. Dieser Schritt ermöglicht eine präzise Bewertung der Lebensfähigkeit der im Biofilm dispergierten Zellen durch Methoden wie Ausplattierung, Verdünnung und Koloniezählung. Die ordnungsgemäße Zerstörung des Biofilms durch Beschallung verhindert, dass restliche Matrixkomponenten die Zellen abschirmen, was andernfalls zu einer Unterschätzung der antimikrobiellen Aktivität führen könnte. Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP ist für diesen Zweck besonders gut geeignet. Er bietet präzise und reproduzierbare Beschallungsbedingungen, um eine zuverlässige und durchsatzstarke Vorbereitung von Assay-Platten zu gewährleisten.

Warum Sonikation in Biofilm-basierten Assay der Minimalen Hemmkonzentration notwendig ist

Für Viabilitätsmessungen und Zellzählungen ist eine vollständige und zuverlässige Ablösung und Dispersion einzelner Zellen erforderlich. Das UIP400MTP sorgt für eine gleichmäßige, nicht schädigende Ablösung des Biofilms und eine Dispersion der Zellen für zuverlässige Testergebnisse.

• Komplexität von Biofilmen: Biofilme sind strukturierte Mikrobengemeinschaften, die von einer extrazellulären polymeren Substanz (EPS) umgeben sind, welche die Mikroorganismen schützt und sie widerstandsfähiger gegen antimikrobielle Mittel macht.
• Gleichmäßige Dispersion: Um die Lebensfähigkeit der in den Biofilm eingebetteten Zellen oder ihre Anfälligkeit für antimikrobielle Mittel genau zu messen, muss der Biofilm zunächst abgelöst und in eine homogene Suspension zerlegt werden.

Protokoll: Biofilmbasierter Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentration

Der Test der minimalen Hemmkonzentration (MHK) bestimmt die niedrigste Konzentration eines antimikrobiellen Mittels, die erforderlich ist, um das sichtbare Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen. Dieses Protokoll wurde für Biofilm-assoziierte Mikroorganismen entwickelt. Der UIP400MTP Multi-Well-Plate-Sonicator wird dabei für das Ablösen des Biofilms eingesetzt.

Schritt 1: Vorbereitung des bakteriellen Inokulums

1. Bereiten Sie die Bakteriensuspension vor:
   Bakterien in geeignetem Medium bis zur mittleren logarithmischen Phase wachsen lassen.
   Die Kultur verdünnen, um eine standardisierte Zelldichte zu erreichen (z.B. 0,5 McFarland-Standard oder OD600 ~0,1).
2. Bereiten Sie antimikrobielle Lösungen vor:
   Den antimikrobielle Wirkstoff in einem geeigneten Medium verdünnen, um eine Reihe von Konzentrationen zu erzeugen (z.B. zweifache Verdünnungsreihen).
3. In die 96-Well-Platte pipettieren:
   Geben Sie die antimikrobiellen Lösungen in die Wells einer Standard-96-Well-Platte mit einem Well-Volumen von ca. 150-200 µl.
   Führen Sie Wachstumskontrollen (ohne antimikrobielle Mittel) und Sterilitätskontrollen (ohne bakterielles Inokulum) durch.

Schritt 2: Biofilmbildung auf dem Zapfendeckel

• Legen Sie den Deckel mit den Stiften auf:
  Setzen Sie den speziellen Stiftdeckel auf die beimpften Wells und achten Sie darauf, dass die Stifte vollständig in die Bakteriensuspension eingetaucht sind.
• Inkubieren Sie die Platte:
  Bei geeigneter Temperatur (z.B. 37°C) für eine bestimmte Dauer (z.B. 24 Stunden) unter statischen Bedingungen inkubieren, damit sich ein Biofilm auf den Stiften bilden kann.

Schritt 3: Einwirken der antimikrobieller Lösung

• Spülen Sie die Stifte ab:
  Entfernen Sie den Zapfendeckel von der Bakteriensuspension und spülen Sie vorsichtig in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um lose anhaftende planktonische Zellen zu entfernen.
• Antimikrobiellen Wirkstoffe:
  Den Zapfendeckel in eine neue 96-Well-Platte mit den zuvor hergestellten antimikrobiellen Wirkstoffen mit verschiedenen Konzentrationen einsetzen.
  Für einen bestimmten Zeitraum (z. B. 24 Stunden) unter statischen Bedingungen inkubieren, damit das antimikrobielle Mittel auf die Biofilme wirken kann.

Schritt 4: Sonikation mit dem Mikroplatten-Sonicator UIP400MTP

Der Schritt der Beschallung ist entscheidend für die Ablösung von Biofilmen von den Zapfendeckeln, um die Zell-Viabilität zu beurteilen. Führen Sie die folgenden Schritte mit dem UIP400MTP Sonicator aus:

1. Bereiten Sie den Versuch vor:
   Jede Vertiefung der frischen 96-Well-Platte mit Rückgewinnungsmedium (z. B. Neutralisationsbrühe oder steriles Wachstumsmedium) befüllen.
2. Übertragen Sie den Zapfendeckel:
   Nehmen Sie den Deckel von der antimikrobiell-behandelten 96-Well-Platte ab.
   Spülen Sie den Zapfendeckel mit steriler Kochsalzlösung oder PBS ab, um Rückstände von antimikrobiellen Wirkstoffen zu entfernen.
3. Positionieren Sie die 96-Well-Platte im Sonicator:
   Setzen Sie den Deckel mit den Stiften in die frische 96-Well-Platte mit dem Rückgewinnungsmedium an.
   Setzen Sie die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium in den UIP400MTP-Sonicator und achten Sie darauf, dass die Platte zentriert und stabil sitzt, wie in der Anleitung beschrieben.
4. Beschallungsparameter einstellen:
   Stellen Sie die Beschallungsparameter am UIP400MTP ein (die Einstellungen können ggf. an den jeweiligen Biofilm angepasst werden):
   Amplitude: 70-100%.
   Beschallungszeit: 1-3 Minuten (je nach Biofilmstruktur anpassen) im Zyklusmodus.
5. Beschallung:
   Starten Sie den Beschallungsprozess. Durch die Ultraschallwellen wird die Biofilm-Matrix aufgebrochen und die Zellen werden im Rückgewinnungsmedium dispergiert.
6. Überwachen Sie den Prozess:
   Verwenden Sie den steckbaren Temperatursensor zur Überwachung der Probentemperatur in den Wells. Der UIP400MTP kann zur Kühlung an eine Laborkühlung angeschlossen werden.
7. Post-Sonication:
   Übertragen Sie das Rückgewinnungsmedium mit den abgelösten Biofilmen sofort in eine frische sterile Platte für die anschließende Analyse.

(A) Platte, die TSB mit 2 % Glukose enthält, für die Biofilmbildung, Zellwiederherstellung und Bestimmung der MHK und MBEC verwendet wird; (B) Deckel mit Stiften für die Bildung von Staphylokokken-Biofilmen.
Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch 5-minütige Beschallung (Hielscher Ultrasonics GmbH) in 96-Well-Platten mit frischem Kulturmedium abgelöst, um die Zellen zu gewinnen.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Schritt 4: Analyse der Zell-Viabilität

Abgelöste Biofilme plattieren und kultivieren:

1. Führen Sie serielle Verdünnungen des Rückgewinnungsmediums durch und plattieren Sie es auf Agar, um die koloniebildenden Einheiten (KBE) auszuzählen.
2. MHK auswerten:
   Bestimmen Sie die MHK als die niedrigste antimikrobielle Konzentration, die das sichtbare mikrobielle Wachstum im Wiederfindungsmedium vollständig hemmt.

MIC Minimale Hemmstoffkonzentration: Beispiel einer Mikrotiterplatte und Auswertung der Mikrodilution-Ergebnisse.
(Studie und Bild: ©Jaskiewicz et al. 2019)

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Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Sonicators CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

Lesen Sie hier, wie das UIP400MTP für die Biofilmablösung im ASTM E2799-Protokoll verwendet wird – Wirksamkeitstest von Desinfektionsmitteln gegen den Biofilm von Pseudomonas aeruginosa mittels MBEC-Assay.