Protokoll für den Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC)

Der biofilmbasierte Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) ist eine wesentliche Methode zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe gegen biofilmassoziierte Mikroorganismen, die aufgrund ihrer schützenden extrazellulären Matrix eine erhöhte Resistenz aufweisen. Ein entscheidender Schritt dieses Assays ist die Ablösung der Biofilmstrukturen, um eingebettete Zellen für eine genaue Beurteilung der Lebensfähigkeit freizusetzen. Das Ultraschallgerät für Multiwell-Platten UIP400MTP erleichtert diesen Prozess, indem es mittels fokussierten Ultraschalls kontrollierte Kavitation erzeugt, Biofilmzellen effizient ablöst und sie zu einer gleichmäßigen Suspension dispergiert. Diese präzise und reproduzierbare Auflösung des Biofilms verbessert die Zuverlässigkeit und den Probendurchsatz von MIC-Assays und macht den UIP400MTP zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Fortschritte in der Biofilmforschung.

Warum sollte ich bei MIC-Assays eine Ultraschallbehandlung einsetzen?

• Genaue, reproduzierbare Daten: Erhalten Sie gleichmäßige Zellsuspensionen, die die Abschirmung durch die Matrix beseitigen und sicherstellen, dass Ihre Koloniezählungen und Messwerte der optischen Dichte die antimikrobielle Wirksamkeit tatsächlich widerspiegeln.
• Effizienz bei hohem Probendurchsatz: Behandeln Sie eine gesamte 96-Well-Platte gleichzeitig in nur 1–3 Minuten und ersetzen Sie langsames, uneinheitliches manuelles Abschaben durch einen optimierten Arbeitsablauf.
• Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen: Lösen Sie eingebettete Zellen schonend ab, ohne die durch Abschaben verursachten physischen Schäden, und erhalten Sie höhere Überlebensraten für zuverlässige MIC/MBEC-Berechnungen.
• Kein Risiko einer Kreuzkontamination: Profitieren Sie von einer berührungslosen Cup-Horn-Bauweise, die alle Wells gleichmäßig behandelt, ohne dass Sonotroden einzelne Proben oder Wells berühren.
• Normgerechte Durchführung: Richten Sie Ihre Methodik an validierten Industrieprotokollen wie ASTM E2799-22 aus und verleihen Sie Ihren Daten dadurch größere Glaubwürdigkeit für regulatorische Zwecke oder Veröffentlichungen.
• Zuverlässiges Screening von Wirkstoffen und Behandlungen: Verlassen Sie sich auf Ihre Ergebnisse zur Empfindlichkeit, um fundiertere Entscheidungen über die antimikrobielle Wirksamkeit, die Erstellung von Resistenzprofilen oder die Entwicklung von Therapien zu treffen.

Ultraschallbehandlung zur Biofilmablösung

Der biofilmbasierte MIC-Assay misst typischerweise die Lebensfähigkeit von Bakterien oder die Wachstumshemmung mit Methoden wie Ausplattieren, Koloniezählung oder Messungen der optischen Dichte. Die Ultraschallbehandlung ist ein entscheidender Schritt in biofilmbasierten MIC-Assays, wenn die Empfindlichkeit biofilmassoziierter Mikroorganismen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen beurteilt wird. Ihre Hauptfunktion besteht darin, in der Biofilmmatrix eingebettete Zellen abzulösen und für eine genaue Analyse zu einer gleichmäßigen Suspension zu dispergieren.
Biofilme sind gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen deutlich resistenter als planktonische Zellen, weshalb eine sachgerechte Ablösung für eine genaue Analyse entscheidend ist. Während dieses Prozesses erzeugen Ultraschallwellen kontrollierte Kavitation, die die Biofilmmatrix aufbricht und eingebettete Zellen als gleichmäßige Suspension im Rückgewinnungsmedium freisetzt. Dieser Schritt ermöglicht eine präzise Beurteilung der Lebensfähigkeit der aus dem Biofilm dispergierten Zellen durch Methoden wie Ausplattieren, Verdünnen und Koloniezählung. Eine sachgerechte Auflösung des Biofilms durch Ultraschallbehandlung verhindert, dass verbleibende Matrixbestandteile die Zellen abschirmen, was andernfalls zu einer Unterschätzung der antimikrobiellen Aktivität führen könnte. Das Ultraschallgerät für Multiwell-Platten UIP400MTP eignet sich besonders gut für diesen Zweck und bietet präzise und reproduzierbare Beschallungsbedingungen, um eine zuverlässige Vorbereitung von Assayplatten mit hohem Probendurchsatz sicherzustellen.

Warum eine Ultraschallbehandlung bei biofilmbasierten Assays zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration notwendig ist

Für Messungen der Lebensfähigkeit und Zellzählungen sind eine vollständige und zuverlässige Ablösung und Dispergierung einzelner Zellen erforderlich. Der UIP400MTP fördert eine gleichmäßige, schonende Biofilmablösung und Zelldispergierung für robuste Assay-Ergebnisse.

• Komplexität von Biofilmen: Biofilme sind strukturierte mikrobielle Gemeinschaften, die von einer Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) umgeben sind. Diese schützt die Mikroorganismen und macht sie resistenter gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen.
• Gleichmäßige Dispergierung: Um die Lebensfähigkeit der in den Biofilm eingebetteten Zellen oder ihre Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen genau zu messen, muss der Biofilm zunächst abgelöst und zu einer homogenen Suspension aufgelöst werden.

Protokoll für den biofilmbasierten Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration

Der Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) ermittelt die niedrigste Konzentration eines antimikrobiellen Wirkstoffs, die erforderlich ist, um das sichtbare Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen. Dieses Protokoll ist für biofilmassoziierte Mikroorganismen ausgelegt und verwendet das Ultraschallgerät für Multiwell-Platten UIP400MTP zur Auflösung des Biofilms.

Schritt 1: Vorbereitung des bakteriellen Inokulums

1. Bakteriensuspension vorbereiten:
   Kultivieren Sie die Bakterien in geeigneten Medien bis zur mittleren logarithmischen Wachstumsphase.
   Verdünnen Sie die Kultur, um eine standardisierte Zelldichte zu erreichen (z. B. 0,5 McFarland-Standard oder OD600 ~0,1).
2. Antimikrobielle Lösungen vorbereiten:
   Verdünnen Sie den antimikrobiellen Wirkstoff in einem geeigneten Medium, um eine Reihe unterschiedlicher Konzentrationen herzustellen (z. B. serielle Zweifachverdünnungen).
3. In die 96-Well-Platte dosieren:
   Geben Sie die antimikrobiellen Lösungen in die Wells einer Standard-96-Well-Platte, sodass das Endvolumen je Well ~150–200 µL beträgt.
   Sehen Sie Wachstumskontrollen (ohne antimikrobiellen Wirkstoff) und Sterilitätskontrollen (ohne bakterielles Inokulum) vor.

Schritt 2: Biofilmbildung auf dem Stiftdeckel

• Stiftdeckel aufsetzen:
  Setzen Sie den speziellen Stiftdeckel auf die inokulierten Wells und stellen Sie sicher, dass die Stifte vollständig in die Bakteriensuspension eingetaucht sind.
• Platte inkubieren:
  Inkubieren Sie bei der geeigneten Temperatur (z. B. 37°C) für eine festgelegte Dauer (z. B. 24 Stunden) unter statischen Bedingungen, damit sich Biofilme auf den Stiften bilden können.

Schritt 3: Exposition gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen

• Stifte spülen:
  Nehmen Sie den Stiftdeckel aus der Bakteriensuspension und spülen Sie ihn vorsichtig in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um locker anhaftende planktonische Zellen zu entfernen.
• Antimikrobiellen Wirkstoffen aussetzen:
  Überführen Sie den Stiftdeckel in eine neue 96-Well-Platte mit den zuvor vorbereiteten Verdünnungen des antimikrobiellen Wirkstoffs.
  Inkubieren Sie für einen festgelegten Zeitraum (z. B. 24 Stunden) unter statischen Bedingungen, damit der antimikrobielle Wirkstoff auf die Biofilme einwirken kann.

Schritt 4: Ultraschallbehandlung mit dem Ultraschallgerät für Mikroplatten UIP400MTP

Die Ultraschallbehandlung ist entscheidend für die Ablösung der Biofilme von den Stiftdeckeln zur Beurteilung der Lebensfähigkeit. Befolgen Sie diese Schritte für das Ultraschallgerät UIP400MTP:

1. Versuchsaufbau vorbereiten:
   Füllen Sie jedes Well einer neuen 96-Well-Platte mit Rückgewinnungsmedium (z. B. neutralisierende Nährbouillon oder steriles Wachstumsmedium).
2. Stiftdeckel überführen:
   Nehmen Sie den Stiftdeckel von der Platte für die antimikrobielle Behandlung ab.
   Spülen Sie den Stiftdeckel in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um Rückstände antimikrobieller Wirkstoffe zu entfernen.
3. Platte im Ultraschallgerät positionieren:
   Setzen Sie den Stiftdeckel auf die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium.
   Stellen Sie die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium in das Ultraschallgerät UIP400MTP und achten Sie darauf, dass die Platte wie in der Bedienungsanleitung beschrieben mittig und stabil sitzt.
4. Beschallungsparameter einstellen:
   Stellen Sie die Beschallungsparameter am UIP400MTP ein (die Einstellungen können an den Biofilm angepasst werden):
   Amplitude: 70–100%.
   Beschallungsdauer: 1–3 Minuten (je nach Biofilmstruktur anpassen) im Zyklusbetrieb.
5. Beschallen:
   Starten Sie die Ultraschallbehandlung. Die Ultraschallwellen brechen die Biofilmmatrix auf und lösen die Zellen ab, sodass sie in das Rückgewinnungsmedium gelangen.
6. Prozess überwachen:
   Verwenden Sie den anschließbaren Temperatursensor, um die Probentemperatur in den Wells zu überwachen. Der UIP400MTP kann zur Kühlung an einen Laborkühler angeschlossen werden.
7. Handhabung nach der Ultraschallbehandlung:
   Überführen Sie das Rückgewinnungsmedium mit den abgelösten Biofilmen sofort in eine neue sterile Platte für die anschließende Analyse.

(A) Platte mit TSB und 2% Glucose für die Biofilmbildung, Zellrückgewinnung und Bestimmung von MIC und MBEC; (B) Deckel mit Stiften zur Bildung von Staphylokokken-Biofilmen.
Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch eine Ultraschallbehandlung (Hielscher Ultraschalltechnologie) für 5 min in 96-Well-Platten abgelöst, die frisches Kulturmedium zur Rückgewinnung der Zellen enthielten.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Schritt 4: Beurteilung der Lebensfähigkeit

Abgelöste Biofilme ausplattieren und kultivieren:

1. Führen Sie serielle Verdünnungen des Rückgewinnungsmediums durch und plattieren Sie diese auf Agar aus, um die koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen.
2. MIC bestimmen:
   Bestimmen Sie die MIC als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffs, die das sichtbare mikrobielle Wachstum im Rückgewinnungsmedium vollständig hemmt.

MIC – minimale Hemmkonzentration: Beispiel einer Mikrotiterplatte und Interpretation der Mikroverdünnungsergebnisse.
(Studie und Bild: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Wer profitiert von der Ultraschallbehandlung bei MIC-Assays?

• Hersteller von Medizinprodukten: Zur Prüfung der Wirksamkeit von Oberflächenbeschichtungen und zur Validierung von Reinigungsprotokollen für Produkte, die zur Biofilmbildung neigen.
• Klinische Mikrobiologen: Zur genauen Diagnose implantatassoziierter Infektionen (wie PJI) durch die Rückgewinnung von Bakterien von medizinischen Implantaten und anderen eingebrachten Medizinprodukten.
• Pharmazeutische Entwickler: Zur Bewertung der Wirksamkeit neuer antimikrobieller Wirkstoffe gegen widerstandsfähige, in Biofilme eingebettete Krankheitserreger.
• Akademische Forscher: Zur Durchführung reproduzierbarer Studien mit hohem Probendurchsatz zur Biofilmbiologie und zu Mechanismen antimikrobieller Resistenz.
• Teams der industriellen Qualitätskontrolle: Zur Bewertung von Biofouling und der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln in industriellen Umgebungen (z. B. unter Anwendung der Norm ASTM E2799-22).

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Die Ultraschallgeräte von Hielscher sind für höchste Qualitäts- und Konstruktionsstandards bekannt. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Die Ultraschallgeräte von Hielscher bewältigen raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen problemlos.

Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt besonderen Wert auf leistungsstarke Ultraschallgeräte, die sich durch modernste Technologie und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind die Ultraschallgeräte von Hielscher CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

Lesen Sie hier, wie der UIP400MTP im ASTM E2799-Protokoll zur Biofilmablösung eingesetzt wird – Prüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Pseudomonas-aeruginosa-Biofilme mit dem MBEC-Assay.