Staphylococcus-Biofilm: Protokoll für Kultivierung und Ablösen

Standardisierte Methoden sind für zuverlässige Forschungsergebnisse unerlässlich. Hier finden Sie ein Protokoll für die Kultivierung- und Ablösungsvon Staphylokokken-Biofilmen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung mit dem UIP400MTP Multi-Well-Platten-Sonicator für ein effizientes Ablösen von Biofilmen im Hochdurchsatz in 96-Well-Platten. Das Protokoll enthält alle wichtige Schritte für die Biofilmkultivierung, das Waschen und die visuelle Quantifizierung, wobei der Schwerpunkt auf der Minimierung der Variabilität und der Gewährleistung der Reproduzierbarkeit liegt.

Staphylokokken-Biofilm und Antibiotikaforschung

Biofilme von Staphylokokken spielen bei hartnäckigen Infektionen eine entscheidende Rolle, da sie resistent gegen Antibiotika und Immunreaktionen sind. Die Bildung von Biofilmen bildet eine schützende Umgebung für Bakterien, was die Behandlung von Infektionen erschwert. Die Erforschung von Biofilmen konzentriert sich häufig auf das Verständnis deren Bildung, Verhaltens und Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln. In der Biofilm-Forschung werden dafür Hochdurchsatzmethoden zur effizienten Durchführung der Arbeitsabläufe favorisiert.
Der UIP400MTP Multi-Well-Plate-Sonicator bietet einen bedeutenden Vorteil in der Biofilmforschung, da er die schnelle und effiziente Ablösung von Biofilmen von 96-Well-Platten ermöglicht. Dieser Sonicator liefert gleichmäßige Ultraschallenergie an alle Vertiefungen und gewährleistet so konsistente Ergebnisse bei gleichzeitiger Minimierung der Variabilität.

Protokoll für die Kultivierung und das Ablösen von Staphylokokken-Biofilmen

Im Folgenden führen wir Sie mit einer Schritt-für-Schritt-Anleitung durch den Prozess der Kultivierung und des Ablösens eines Staphylokokken-Biofilms. Als beispielhaften Analyseschritt zeigen wir Ihnen, wie Sie die kultivierte Biomasse durch Kristallviolettfärbung spektrophotometrisch quantifizieren können.

Kultivierung eines Staphylokokken-Biofilms

Erforderliche Materialien:

• Sterile Flachboden-Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Wells und Deckel, mit Gewebekulturen behandelt
• Tryptische Soja Broth (TSB) mit 0,25% Glukose
• Biologische Sicherheitswerkbank

Arbeitsschritte:

1. Bereiten Sie eine sterile Arbeitsumgebung in einer biologischen Sicherheitswerkbank vor, um die Kontamination zu minimieren.
2. Geben Sie TSB mit 0,25 % Glukose in die Wells der Mikrotiterplatte. TSB ohne Glukose unterstützt die Biofilmbildung im Allgemeinen nicht und sollte nur bei Bedarf als Kontrolle verwendet werden.
3. Die Wells mit Bakterienstämmen beimpfen, die wie unten beschrieben vorbereitet wurden:
4. Bereiten Sie Bakteriensuspensionen vor und stellen Sie sicher, dass keine Zellcluster vorhanden sind, indem Sie die Suspensionen mit Ultraschall homogenisieren oder die Cluster mit einer 23er-Nadel und kurzem Vortexen aufbrechen.
5. Die Platte mit dem Deckel verschließen und unter für die Biofilmbildung optimalen Bedingungen inkubieren (z.B. 37°C für 24 Stunden).
6. Führen Sie den Versuch für jeden Bakterienstamm in dreifacher Ausführung durch (drei Wells pro Stamm), um die Zuverlässigkeit zu gewährleisten.
7. Sechs Wells pro Platte für Negativkontrollen vorsehen. Pro 96-Well-Platte können bis zu 30 Stämme getestet werden.

Visualisierung und Reinigung von Biofilmen

1. Nach der Inkubation entsorgen Sie das Medium vorsichtig, um den Biofilm nicht zu beinträchtigen.
2. Jedes Well viermal mit physiologischer Kochsalzlösung waschen, um planktonische Bakterien zu entfernen.
3. Untersuchen Sie den Boden des Wells auf weiße Flecken, welche auf einen Biofilm hindeuten.

Ablösen von Biofilmen mit dem Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP

Geräteeinstellungen und Parameter:

• UIP400MTP Ultraschallgerät für Microwell-Platten
• Betriebseinstellungen: 60% Amplitude, Zyklusmodus mit 60 Sekunden EIN / 30 Sekunden AUS

Arbeitsschritte:

1. Setzen Sie die gewaschene Mikrotiterplatte auf die UIP400MTP-Plattform.
2. Beschallen Sie die Proben mit den empfohlenen Einstellungen (60 % Amplitude, 60 Sekunden EIN, 30 Sekunden AUS). Passen Sie die Einstellungen ggf. an den Bakterienstamm an.
3. Starten Sie den Beschallungsprozess, um den Biofilm abzulösen. Die Ultraschallwellen brechen die Biofilm-Matrix auf und setzen die anhaftenden Bakterien frei.
4. Das UIP400MTP sorgt für eine gleichmäßige Beschallung aller Wells und damit für ein konsistentes Ablösen des Biofilms.

Analytischer Schritt: Quantifizierung der abgelösten Staphylococcus-Biofilm-Biomasse mit Kristallviolett (CV)

Erforderliche Materialien:

• 0.1%ige Kristallviolett-Lösung (CV)
• 95%iges Ethanol oder 30%ige Essigsäure (zur Solubilisierung)
• Mikroplate-Reader, das bei 570 nm messen kann
• Sterile Mikrotiterplatten für Färbungen

Arbeitsschritte:

1. Vorbereitung der Färbeplatte: Übertragen Sie 100 µl der abgelösten Biofilmsuspension aus jedem Well der beschallten Platte in die entsprechenden Wells einer sauberen, sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte. Dies gewährleistet eine einheitliche Färbung.
2. Färben des abgelösten Biofilms: Geben Sie 150 µL einer 0,1%igen Kristallviolettlösung in jedes Well, das die abgelöste Biofilmsuspension enthält. Vorsichtig pipettieren, um eine gleichmäßige Durchmischung von Biofilmsuspension und Kristallviolett sicherzustellen.
3. Inkubation: Lassen Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, damit das Kristallviolett die Biomasse wirksam anfärben kann.
4. Waschen: Nach der Inkubation wird die kristallviolette Lösung vorsichtig aus den Wells entfernt, ohne die Biomasse zu stören. Jedes Well dreimal mit steriler physiologischer Kochsalzlösung waschen, um ungebundene Färbung zu entfernen.
5. Trocknen: Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur oder unter einer sterilen Abzugshaube an der Luft trocknen. Ein Erhitzen ist zu vermeiden, da dies die Ergebnisse verändern kann.
6. Solubilisierung: Geben Sie 200 µl 95 %iges Ethanol (oder 30 %ige Essigsäure, je nach Standardlaborverfahren) in jedes Well, um das gebundene Kristallviolett zu lösen. Mischen Sie vorsichtig urch wiederholtes Ansaugen und Ausstoßen mit einer Pipette oder Schütteln der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Messung: Messen Sie die optische Dichte (OD) der aufgelösten Kristallviolettlösung bei 570 nm mit einem Microplate Reader.
8. Datenanalyse: Ziehen Sie den mittleren OD570-Wert der Negativkontrollen (Wells mit TSB, aber ohne bakterielles Inokulum) von den Versuchs-Wells ab, um die Hintergrundfärbung zu berücksichtigen. Daten aufzeichnen und auswerten.

Hinweis: Führen Sie das Experiment für jede Bedingung in dreifacher Ausführung durch, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Achten Sie auf eine ordnungsgemäße Handhabung von Kristallviolett und Ethanol und halten Sie sich an die Sicherheits- und Entsorgungsprotokolle.
 

Die wichtigsten Vorteile des UIP400MTP auf einen Blick:

• High-Throughput Processing: Speziell für Multi-Well-Platten entwickelt, so dass Sie zahlreiche Proben gleichzeitig verarbeiten können.
• Gleichmäßige Beschallung: Sorgt für eine gleichmäßige Ultraschallintensität in allen Wells und damit für einheitliche Ergebnisse bei allen Proben.
• Verwenden Sie jede beliebige Multi-well-Platte: Das UIP400MTP kann alle Standard-Microwell-Platten, Petrischalen und Tube Racks beschallen. Es sind keine teuren proprietären Platten erforderlich!
• Benutzerfreundliches Interface: Das einfache Einrichten und das intuitive Steuerung machen den UIP400MTP zu einem hervorragenden Tool zur Steigerung der Produktivität im Labor. Programmierbare Einstellungen und Automatisierung erleichtern die Prozessstandardisierung!