Protokoll zur Kultivierung und Ablösung von Staphylococcus-Biofilmen

Standardisierte Methoden sind für zuverlässige Forschungsergebnisse unerlässlich. Hier finden Sie ein Protokoll zur Kultivierung und Ablösung von Staphylokokken-Biofilmen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine effiziente Hochdurchsatz-Probenvorbereitung mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten zur effizienten Ablösung von Biofilmen in 96-Well-Platten mit hohem Probendurchsatz. Das Protokoll enthält außerdem wesentliche Schritte zur Kultivierung, zum Waschen und zur Visualisierung von Biofilmen, wobei der Schwerpunkt auf der Minimierung der Variabilität und der Gewährleistung der Reproduzierbarkeit liegt.

Forschung zu Staphylococcus-Biofilmen und Antibiotika

Staphylococcus-Biofilme spielen aufgrund ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Antibiotika und Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei persistierenden Infektionen. Die Biofilmbildung schafft eine schützende Umgebung für Bakterien und erschwert dadurch die Behandlung von Infektionen. Die Biofilmforschung konzentriert sich häufig darauf, die Bildung, das Verhalten und die Empfindlichkeit von Biofilmen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen zu verstehen. Dabei liegt ein Schwerpunkt auf Hochdurchsatzmethoden zur Vereinfachung experimenteller Arbeitsabläufe.
Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten bietet einen erheblichen Vorteil in der Biofilmforschung, da es die schnelle und effiziente Ablösung von Biofilmen aus 96-Well-Platten ermöglicht. Dieses Gerät führt allen Wells gleichmäßig Ultraschallenergie zu und gewährleistet dadurch konsistente Ergebnisse bei gleichzeitig minimierter Variabilität.

Protokoll zur Kultivierung und Ablösung von Staphylococcus-Biofilmen

Im Folgenden führen wir Sie mit einer schrittweisen Anleitung durch die Kultivierung und Ablösung eines Staphylococcus-Biofilms. Als beispielhaften Analyseschritt zeigen wir Ihnen, wie Sie die kultivierte Biomasse durch Kristallviolettfärbung spektrophotometrisch quantifizieren können.

Kultivierung von Staphylococcus-Biofilmen

Benötigte Materialien:

• Sterile 96-Well-Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden, für die Gewebekultur behandelter Oberfläche und Deckeln
• Tryptic Soy Broth (TSB) mit 0,25% Glucose
• Mikrobiologische Sicherheitswerkbank

Schritte:

1. Richten Sie in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank eine sterile Arbeitsumgebung ein, um Kontaminationen zu minimieren.
2. Geben Sie TSB mit 0,25% Glucose in die Wells der Mikrotiterplatte. TSB ohne Glucose unterstützt die Biofilmbildung im Allgemeinen nicht und sollte bei Bedarf nur als Kontrolle verwendet werden.
3. Inokulieren Sie die Wells mit Bakterienstämmen, die wie nachfolgend beschrieben vorbereitet wurden:
4. Bereiten Sie Bakteriensuspensionen vor und stellen Sie sicher, dass keine bereits vorhandenen Zellaggregate verbleiben, indem Sie die Suspensionen durch Ultraschallbehandlung homogenisieren oder die Aggregate mit einer 23-Gauge-Kanüle und kurzem Vortexen auflösen.
5. Verschließen Sie die Platte mit ihrem Deckel und inkubieren Sie sie unter optimalen Bedingungen für die Biofilmbildung (z. B. 37°C für 24 Stunden).
6. Führen Sie das Experiment für jeden Bakterienstamm in Dreifachbestimmung durch (drei Wells pro Stamm), um die Zuverlässigkeit sicherzustellen.
7. Reservieren Sie sechs Wells pro Platte für Negativkontrollen. Pro 96-Well-Platte können bis zu 30 Stämme getestet werden.

Visualisierung und Waschen des Biofilms

1. Verwerfen Sie nach der Inkubation vorsichtig das Medium, ohne den Biofilm zu beeinträchtigen.
2. Waschen Sie jedes Well viermal mit physiologischer Kochsalzlösung, um planktonische Bakterien zu entfernen.
3. Untersuchen Sie den Boden der Wells auf weiße Flecken, die auf das Vorhandensein eines Biofilms hinweisen.

Biofilmablösung mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten

Geräteeinrichtung und Parameter:

• Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten
• Betriebseinstellungen: 60% Amplitude, Zyklusbetrieb mit 60 Sekunden EIN / 30 Sekunden AUS

Schritte:

1. Stellen Sie die gewaschene Mikrotiterplatte auf die Plattform des UIP400MTP.
2. Beschallen Sie die Proben mit den empfohlenen Einstellungen (60% Amplitude, 60 Sekunden EIN, 30 Sekunden AUS). Passen Sie die Einstellungen an den Bakterienstamm an.
3. Starten Sie die Beschallung, um den Biofilm abzulösen. Die Ultraschallwellen brechen die Biofilmmatrix auf und setzen die adhärenten Bakterien frei.
4. Das UIP400MTP gewährleistet eine gleichmäßige Beschallung aller Wells und damit konsistente Ablösungsergebnisse.

Analyseschritt: Quantifizierung der abgelösten Staphylococcus-Biofilm-Biomasse mit Kristallviolett (CV)

Benötigte Materialien:

• 0,1%ige Kristallviolettlösung (CV)
• 95%iges Ethanol oder 30%ige Essigsäure (zum Lösen)
• Mikroplatten-Reader, der Messungen bei 570 nm ermöglicht
• Sterile Mikrotiterplatten für die Färbung

Schritte:

1. Vorbereitung der Färbeplatte: Überführen Sie 100 µL der Suspension des abgelösten Biofilms aus jedem Well der beschallten Platte in die entsprechenden Wells einer sauberen, sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte. Dies gewährleistet eine saubere und einheitliche Umgebung für die Färbung.
2. Färbung des abgelösten Biofilms: Geben Sie 150 µL einer 0,1%igen Kristallviolettlösung in jedes Well, das die Suspension des abgelösten Biofilms enthält. Pipettieren Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Vermischung der Biofilmsuspension mit dem Kristallviolett sicherzustellen.
3. Inkubation: Inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur, damit das Kristallviolett die Biomasse wirksam anfärben kann.
4. Waschen: Verwerfen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Kristallviolettlösung aus den Wells, ohne die Biomasse zu beeinträchtigen. Waschen Sie jedes Well dreimal mit steriler physiologischer Kochsalzlösung, um ungebundenen Farbstoff zu entfernen.
5. Trocknen: Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur oder im sterilen Luftstrom einer Sterilwerkbank an der Luft trocknen. Vermeiden Sie Erwärmung, da diese die Ergebnisse verändern kann.
6. Lösen: Geben Sie in jedes Well 200 µL 95%iges Ethanol (oder 30%ige Essigsäure, je nach üblicher Laborpraxis), um das gebundene Kristallviolett zu lösen. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren oder durch Schütteln der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Messung: Messen Sie die optische Dichte (OD) der Kristallviolettlösung nach dem Lösen bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
8. Datenanalyse: Subtrahieren Sie den mittleren OD570-Wert der Negativkontrollen (Wells mit TSB, aber ohne bakterielles Inokulum) von den Werten der Versuchs-Wells, um die Hintergrundfärbung zu berücksichtigen. Dokumentieren und analysieren Sie die Daten.

Hinweis: Führen Sie das Experiment für jede Bedingung in Dreifachbestimmung durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Achten Sie auf den sachgerechten Umgang mit Kristallviolett und Ethanol und halten Sie die Sicherheits- und Entsorgungsprotokolle ein.
 

Die wichtigsten Vorteile des UIP400MTP auf einen Blick:

• Hochdurchsatz-Verarbeitung: Speziell für Multiwell-Platten entwickelt, sodass Sie mehrere Proben gleichzeitig verarbeiten können.
• Gleichmäßige Ultraschallverteilung: Gewährleistet die gleiche Ultraschallintensität in allen Wells und liefert dadurch konsistente Ergebnisse für alle Proben.
• Verwendung beliebiger Standardplatten: Das UIP400MTP kann beliebige Standard-Multiwell-Platten, Petrischalen und Röhrchenständer verarbeiten. Teure proprietäre Platten sind nicht erforderlich!
• Benutzerfreundliche Bedienoberfläche: Das Gerät lässt sich einfach einrichten und steuern und ist damit ein hervorragendes Werkzeug zur Steigerung der Laborproduktivität. Programmierbare Einstellungen und Automatisierung erleichtern die Prozessstandardisierung!