MBEC-Assay-Protokoll mit dem 96-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP

Der MBEC-Test dient zur Bestimmung der Konzentration antimikrobieller Mittel, die zur Beseitigung von Biofilmen, die sich auf Stöpseldeckeln gebildet haben, erforderlich sind. Um die Lebensfähigkeit des Biofilms zu beurteilen, müssen die Biofilme zunächst von den Stöpseldeckeln einer 96-Well-Platte abgelöst werden. Die zuverlässigste und effizienteste Methode für diese Ablösung ist die Sonikation. Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP wurde speziell für die Bearbeitung von Testplatten mit maximaler Effizienz und Bequemlichkeit entwickelt, wodurch MBEC-Tests mit hohem Durchsatz rationalisiert und beschleunigt werden.

Sonikation für das Ablösen von Biofilmen

Die Beschallung ist ein entscheidender Schritt bei Tests zur minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC), der es ermöglicht, Biofilmzellen wirksam aus ihrer Oberflächenanhaftung zu lösen. Biofilme sind von Natur aus strukturierte Gemeinschaften von Mikroorganismen, die in einer extrazellulären Matrix eingeschlossen sind, was sie im Vergleich zu planktonischen Zellen wesentlich resistenter gegen antimikrobielle Mittel macht. Bei MBEC-Tests werden bei der Sonikation Ultraschallwellen eingesetzt, um eine kontrollierte Kavitation zu erzeugen, die die Biofilmmatrix aufbricht und die eingebetteten Zellen in eine Suspension freisetzt. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Biofilmzellen gleichmäßig im Rückgewinnungsmedium dispergiert werden, was eine genaue Bewertung der Lebensfähigkeit durch Ausplattieren, Verdünnung oder spektrophotometrische Methoden erleichtert. Ohne eine ordnungsgemäße Ablösung des Biofilms könnten verbleibende Matrixkomponenten die Zellen abschirmen, was zu einer Unterschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit führt. Daher ist die Beschallung unerlässlich, um zuverlässige und reproduzierbare MBEC-Werte zu erhalten, die das tatsächliche Eradikationspotenzial der getesteten Wirkstoffe widerspiegeln. Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP ermöglicht die einfache Probenvorbereitung in Assay-Platten mit hohem Durchsatz.

Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) Assay-Protokoll

Schritt 1: Biofilmbildung

1. Bereiten Sie die Bakteriensuspension vor:
   Bakterien in geeigneten Medien bis zur log-Phase wachsen lassen.
   Die Bakterienkultur auf eine bestimmte optische Dichte (z. B. OD600 ~0,1) verdünnen.
2. Die 96-Well-Platte beimpfen:
   Die Bakteriensuspension (z. B. 150-200 µl) in jede Vertiefung einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geben.
3. Legen Sie den Deckel mit den Stiften auf:
   Setzen Sie den Deckel auf die geimpfte Platte, damit sich auf den Oberflächen der Stifte ein Biofilm bilden kann.
4. Inkubieren Sie die Platte:
   Inkubieren Sie den Aufbau bei einer geeigneten Temperatur (z. B. 37 °C) für 24-48 Stunden ohne Schütteln, um das Biofilmwachstum zu fördern.

Schritt 2: Behandlung mit antimikrobiellen Wirkstoffen

• Bereiten Sie antimikrobielle Lösungen vor:
  Bereiten Sie eine Reihe von antimikrobiellen Konzentrationen in frischen Medien vor.
  Biofilme antimikrobiellen Wirkstoffen aussetzen:
  Entfernen Sie den Stöpseldeckel von der Bakterienkultur und spülen Sie sie in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um planktonische Zellen zu entfernen.
  Setzen Sie den Stöpseldeckel in eine neue 96-Well-Platte ein, die die antimikrobiellen Lösungen enthält.
• Inkubieren Sie die Platte:
  Für einen bestimmten Zeitraum (z. B. 24 Stunden) bebrüten, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen.

Schritt 3: Beschallung mit dem 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP

Der Schritt der Beschallung ist entscheidend für die Ablösung von Biofilmen von den Zapfendeckeln, um die Zell-Viabilität zu beurteilen. Führen Sie die folgenden Schritte mit dem UIP400MTP Sonicator aus:

1. Bereiten Sie den Versuch vor:
   In jede Vertiefung eine frische 96-Well-Platte mit Rückgewinnungsmedium (z. B. Neutralisationsbrühe oder frisches Wachstumsmedium) füllen.
2. Übertragen Sie den Zapfendeckel:
   Nehmen Sie den Deckel von der antimikrobiell-behandelten 96-Well-Platte ab.
   Spülen Sie den Zapfendeckel mit steriler Kochsalzlösung oder PBS ab, um Rückstände von antimikrobiellen Wirkstoffen zu entfernen.
3. Positionieren Sie die Platte und den Sonicator:
   Setzen Sie den Deckel mit den Stiften in die frische 96-Well-Platte mit dem Rückgewinnungsmedium an.
   Legen Sie die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium auf die Plattform des UIP400MTP-Sonicators und stellen Sie sicher, dass die Platte zentriert und stabil ist.
4. Beschallungsparameter einstellen:
   Stellen Sie die Beschallungsparameter am UIP400MTP ein (die Einstellungen können an den Biofilm angepasst werden):
   Amplitude: 70-100%.
   Beschallungszeit: 1-3 Minuten (je nach Robustheit des Biofilms anpassen) im Zyklusmodus.
5. Beschallung:
   Starten Sie den Beschallungsprozess. Durch die Ultraschallschwingungen werden die Biofilme von den Zapfenoberflächen in das Rückgewinnungsmedium abgelöst.
6. Überwachen Sie den Prozess:
   Verwenden Sie den steckbaren Temperatursensor zur Überwachung der Probentemperatur in den Wells. Der UIP400MTP kann zur Kühlung an eine Laborkühlung angeschlossen werden.
7. Post-Sonication:
   Übertragen Sie das Rückgewinnungsmedium (das nun abgelöste Biofilme enthält) sofort in eine frische sterile Platte für die nachfolgende Analyse.

(A) Platte, die TSB mit 2 % Glukose enthält und für die Biofilmbildung, Zellwiederherstellung und
Bestimmung von MIC und MBCB; (B) Deckel mit Stiften zur Bildung von Staphylokokken-Biofilmen. Bestimmung von MIC und MBCB; (B) Deckel mit Stiften zur Bildung von Staphylokokken-Biofilmen.
Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch 5-minütige Beschallung (Hielscher Ultrasonics GmbH) in 96-Well-Platten mit frischem Kulturmedium abgelöst, um die Zellen zu gewinnen.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Schritt 4: Analyse der Zell-Viabilität

Abgelöste Biofilme plattieren und kultivieren:

1. Führen Sie serielle Verdünnungen des Rückgewinnungsmediums durch und plattieren Sie es auf Agar, um die koloniebildenden Einheiten (KBE) auszuzählen.
   Alternativ können Sie auch einen kolorimetrischen oder fluoreszenzbasierten Lebensfähigkeitstest verwenden.
2. Rekordergebnisse:
   Bestimmen Sie die MBEC als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Mittels, die eine nachweisbare Lebensfähigkeit des Biofilms auslöscht.

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Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Sonicators CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

Lesen Sie hier, wie das UIP400MTP für die Biofilmablösung als Probenvorbereitungsschritt während des ASTM E2799-Protokolls zur Prüfung der Desinfektionsmittelwirksamkeit gegen Pseudomonas aeruginosa-Biofilm unter Verwendung des MBEC-Tests verwendet wird.