MBEC-Assay-Protokoll mit dem 96-Well-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Der MBEC-Assay dient dazu, die Konzentration antimikrobieller Wirkstoffe zu bestimmen, die erforderlich ist, um auf Stiftdeckeln gebildete Biofilme zu eliminieren. Zur Beurteilung der Biofilmviabilität müssen die Biofilme zunächst von den Stiftdeckeln einer 96-Well-Platte abgelöst werden. Die Ultraschallbehandlung ist die zuverlässigste und effizienteste Methode für diese Ablösung. Das Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP wurde speziell für die Behandlung von Assay-Platten mit maximaler Effizienz und Bedienkomfort entwickelt und vereinfacht und beschleunigt MBEC-Assays mit hohem Probendurchsatz.

Ultraschallbehandlung zur Biofilmablösung

Die Ultraschallbehandlung ist ein entscheidender Schritt bei Assays zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC), da sie die wirksame Ablösung oberflächengebundener Biofilmzellen ermöglicht. Biofilme sind von Natur aus strukturierte Gemeinschaften von Mikroorganismen, die in eine extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Dadurch sind sie gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen deutlich resistenter als planktonische Zellen. Bei MBEC-Assays erzeugen Ultraschallwellen kontrollierte Kavitation, die die Biofilmmatrix aufbricht und die eingebetteten Zellen in eine Suspension freisetzt. Dieser Schritt gewährleistet, dass die Biofilmzellen gleichmäßig im Rückgewinnungsmedium dispergiert werden, und erleichtert so eine genaue Beurteilung der Viabilität durch Ausplattieren, Verdünnung oder spektrophotometrische Methoden. Ohne eine sachgerechte Biofilmablösung könnten verbleibende Matrixbestandteile die Zellen abschirmen, was zu einer Unterschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit führen könnte. Daher ist die Ultraschallbehandlung unverzichtbar, um zuverlässige und reproduzierbare MBEC-Werte zu erhalten, die das tatsächliche Eradikationspotenzial der getesteten Wirkstoffe widerspiegeln. Das Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP ermöglicht eine einfache Probenvorbereitung mit hohem Probendurchsatz in Assay-Platten.

Assay-Protokoll zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC)

Schritt 1: Biofilmbildung

1. Bakteriensuspension vorbereiten:
   Kultivieren Sie die Bakterien in geeigneten Medien bis zur logarithmischen Wachstumsphase.
   Verdünnen Sie die Bakterienkultur auf eine definierte optische Dichte (z. B. OD600 ~0,1).
2. Die 96-Well-Platte inokulieren:
   Geben Sie die Bakteriensuspension (z. B. 150–200 µL) in jedes Well einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte.
3. Stiftdeckel aufsetzen:
   Setzen Sie den Stiftdeckel auf die inokulierte Platte, um die Biofilmbildung auf den Stiftoberflächen zu ermöglichen.
4. Platte inkubieren:
   Inkubieren Sie den Ansatz bei einer geeigneten Temperatur (z. B. 37°C) für 24–48 Stunden ohne Schütteln, um das Biofilmwachstum zu fördern.

Schritt 2: Behandlung mit antimikrobiellen Wirkstoffen

• Antimikrobielle Lösungen vorbereiten:
  Bereiten Sie in frischen Medien eine Reihe unterschiedlicher Konzentrationen antimikrobieller Wirkstoffe vor.
  Biofilme antimikrobiellen Wirkstoffen aussetzen:
  Nehmen Sie den Stiftdeckel aus der Bakterienkultur und spülen Sie ihn in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um planktonische Zellen zu entfernen.
  Setzen Sie den Stiftdeckel auf eine neue 96-Well-Platte, die die antimikrobiellen Lösungen enthält.
• Platte inkubieren:
  Inkubieren Sie die Platte für einen festgelegten Zeitraum (z. B. 24 Stunden), damit die antimikrobiellen Wirkstoffe einwirken können.

Schritt 3: Ultraschallbehandlung mit dem 96-Well-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Die Ultraschallbehandlung ist entscheidend für die Ablösung der Biofilme von den Stiftdeckeln zur Beurteilung der Viabilität. Gehen Sie beim Ultraschallgerät UIP400MTP wie folgt vor:

1. Versuchsaufbau vorbereiten:
   Füllen Sie jedes Well einer neuen 96-Well-Platte mit Rückgewinnungsmedium (z. B. neutralisierende Nährbouillon oder frisches Wachstumsmedium).
2. Stiftdeckel überführen:
   Nehmen Sie den Stiftdeckel von der Platte für die antimikrobielle Behandlung ab.
   Spülen Sie den Stiftdeckel in steriler Kochsalzlösung oder PBS, um verbleibende antimikrobielle Wirkstoffe zu entfernen.
3. Platte und Ultraschallgerät positionieren:
   Setzen Sie den Stiftdeckel auf die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium.
   Stellen Sie die Platte mit dem Rückgewinnungsmedium auf die Plattform des Ultraschallgeräts UIP400MTP und stellen Sie sicher, dass die Platte mittig und stabil steht.
4. Beschallungsparameter einstellen:
   Stellen Sie die Beschallungsparameter am UIP400MTP ein (die Einstellungen können an den Biofilm angepasst werden):
   Amplitude: 70–100%.
   Beschallungsdauer: 1–3 Minuten (je nach Widerstandsfähigkeit des Biofilms anpassen) im Zyklusmodus.
5. Beschallen:
   Starten Sie die Ultraschallbehandlung. Die Ultraschallschwingungen lösen die Biofilme von den Stiftoberflächen ab und überführen sie in das Rückgewinnungsmedium.
6. Prozess überwachen:
   Verwenden Sie den anschließbaren Temperatursensor, um die Probentemperatur in den Wells zu überwachen. Das UIP400MTP kann zur Kühlung an einen Laborkühler angeschlossen werden.
7. Handhabung nach der Ultraschallbehandlung:
   Überführen Sie das Rückgewinnungsmedium, das nun die abgelösten Biofilme enthält, sofort in eine neue sterile Platte für die nachfolgende Analyse.

(A) Platte mit TSB und 2% Glucose zur Biofilmbildung, Zellrückgewinnung und
Bestimmung von MIC und MBCB; (B) Deckel mit Stiften zur Bildung von Staphylokokken-Biofilmen. Bestimmung von MIC und MBCB; (B) Deckel mit Stiften zur Bildung von Staphylokokken-Biofilmen.
Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch Ultraschallbehandlung (Hielscher Ultraschalltechnologie) für 5 min in 96-Well-Platten abgelöst, die frisches Kulturmedium zur Rückgewinnung der Zellen enthielten.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Schritt 4: Beurteilung der Viabilität

Abgelöste Biofilme ausplattieren und kultivieren:

1. Führen Sie serielle Verdünnungen des Rückgewinnungsmediums durch und plattieren Sie diese auf Agar aus, um die koloniebildenden Einheiten (KBE) zu zählen.
   Verwenden Sie alternativ einen kolorimetrischen oder fluoreszenzbasierten Viabilitätsassay.
2. Ergebnisse dokumentieren:
   Bestimmen Sie die MBEC als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffs, bei der keine Biofilmviabilität mehr nachweisbar war.

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Lesen Sie hier, wie das UIP400MTP zur Biofilmablösung als Schritt der Probenvorbereitung im ASTM-E2799-Protokoll eingesetzt wird, um die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Pseudomonas-aeruginosa-Biofilm mittels MBEC-Assay zu prüfen.