ASTM E2799-22: Protokoll zur Bewertung der antimikrobiellen Wirksamkeit

Der Hielscher UIP400MTP ist ein leistungsstarkes und effizientes Ultraschallgerät für Multiwellplatten, das den Beschallungsschritt im ASTM E2799-22-Protokoll vereinfachen soll. Durch die gleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie über die gesamte Mikrotiterplatte gewährleistet der UIP400MTP eine gleichmäßige und zuverlässige Ablösung von Biofilmen von Stiftdeckeln, ohne die Zellen zu schädigen oder die Probenintegrität zu beeinträchtigen. Sein hoher Probendurchsatz und seine benutzerfreundliche Bedienung verkürzen die Bearbeitungszeit erheblich und verbessern zugleich die Reproduzierbarkeit. Damit ist er eine ideale Lösung für Labore, die Assays zur Biofilmviabilität und Prüfungen der antimikrobiellen Wirksamkeit durchführen.

ASTM E2799

ASTM E2799 ist ein standardisiertes Prüfverfahren zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe gegen Biofilme, mit besonderem Schwerpunkt auf Pseudomonas aeruginosa. Biofilme sind komplexe mikrobielle Gemeinschaften, die an Oberflächen haften und eine erhöhte Resistenz gegenüber antimikrobiellen Behandlungen aufweisen. Dadurch stellen sie im Gesundheitswesen, in der Industrie und im Umweltbereich eine erhebliche Herausforderung dar. Dieses Verfahren verwendet den Assay zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC), um einen zuverlässigen und reproduzierbaren Rahmen für die Prüfung von Desinfektionsmitteln unter realistischen Biofilmbedingungen bereitzustellen.

Welchen Beitrag leistet die Beschallung zu ASTM E2799?

Die Beschallung spielt im ASTM E2799-Protokoll eine entscheidende Rolle, indem sie die Ablösung von Biofilmen von den Prüfflächen erleichtert und damit eine genaue Bewertung der mikrobiellen Viabilität nach der Behandlung gewährleistet. Durch den Einsatz kontrollierter Ultraschallenergie ermöglicht das Protokoll ein effizientes und gleichmäßiges Aufbrechen der Biofilme, ohne die Zellen zu schädigen, und liefert so präzise und reproduzierbare Ergebnisse. Dies macht ASTM E2799 zu einem unverzichtbaren Instrument, um die Biofilmforschung voranzubringen und wirksame antimikrobielle Strategien zu entwickeln.

Durchführung des MBEC-Assays gemäß ASTM E2799-22

Das ASTM E2799-22-Protokoll beschreibt die Schritte zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe gegen Biofilme. Bei Verwendung des Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräts UIP400MTP von Hielscher kann das Protokoll angepasst werden, um dieses fortschrittliche Beschallungsverfahren zur Biofilmablösung einzubeziehen. Nachfolgend werden die auf die Verwendung des Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräts UIP400MTP abgestimmten Schritte beschrieben:

1. Vorbereitung der Biofilme
   Bereiten Sie eine sterile 96-Well-Mikrotiterplatte mit abnehmbaren Stiftdeckeln vor.
   Inokulieren Sie die Wells mit einer standardisierten Bakteriensuspension in einem geeigneten Wachstumsmedium.
   Setzen Sie den Stiftdeckel auf die Platte und stellen Sie sicher, dass die Stifte vollständig in die Bakteriensuspension eingetaucht sind.
   Inkubieren Sie die Platte unter kontrollierten Bedingungen (z. B. Temperatur und Zeit), um die Biofilmbildung auf den Stiften zu ermöglichen.
2. Behandlung mit antimikrobiellen Wirkstoffen
   Ersetzen Sie nach der Biofilmbildung das Medium durch frisches Medium, das die zu prüfenden antimikrobiellen Wirkstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen enthält.
   Setzen Sie den Stiftdeckel wieder auf und inkubieren Sie unter den im Versuchsplan festgelegten Bedingungen.
3. Vorbereitung der Biofilmablösung
   Spülen Sie den Stiftdeckel nach der Behandlung durch Eintauchen in eine sterile Spüllösung, um verbleibende antimikrobielle Wirkstoffe und locker anhaftende planktonische Zellen zu entfernen.
4. Biofilmablösung mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP
   Bereiten Sie eine neue 96-Well-Mikrotiterplatte mit einem Rückgewinnungsmedium (z. B. Neutralisationsbouillon) vor.
   Lösen Sie die Biofilme ab, indem Sie den Stiftdeckel in die Wells der Platte mit dem Rückgewinnungsmedium einsetzen.
   Setzen Sie die Platte in das Ultraschallgerät UIP400MTP ein und stellen Sie sicher, dass Deckel und Platte korrekt ausgerichtet sind.
   Stellen Sie das Ultraschallgerät auf 70%–80% Amplitude ein und beschallen Sie für 3–4 Minuten im Zyklusbetrieb, um eine gleichmäßige Biofilmablösung ohne Zelllyse zu gewährleisten.
5. Bewertung der Biofilmviabilität
   Verarbeiten Sie nach der Beschallung das Rückgewinnungsmedium mit den abgelösten Biofilmzellen mithilfe mikrobiologischer oder analytischer Standardverfahren, wie beispielsweise:
   • Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (CFU): Führen Sie serielle Verdünnungen durch und plattieren Sie auf Agar aus, um die Anzahl lebensfähiger Zellen zu bestimmen.
   • Messungen der optischen Dichte (OD): Verwenden Sie eine spektrophotometrische Analyse zur Bestimmung der Zelldichte.
   • Fluoreszenzbasierte Viabilitätsassays: Quantifizieren Sie lebende und tote Zellen mithilfe fluoreszierender Farbstoffe.
6. Datenauswertung
   Vergleichen Sie die Viabilitätsdaten behandelter und unbehandelter Biofilme, um die Wirksamkeit der antimikrobiellen Wirkstoffe zu bestimmen.
   Berechnen Sie die minimale Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC) anhand der Konzentration, die zur Eliminierung lebensfähiger Biofilmzellen erforderlich ist.
7. Qualitätskontrolle
   Gewährleisten Sie gleichbleibende Beschallungsbedingungen, indem Sie den UIP400MTP regelmäßig kalibrieren und überprüfen, dass der Biofilmablösungsprozess nicht zu einer erheblichen Zelllyse oder Zellzerstörung führt.
   Beziehen Sie geeignete Kontrollen ein, etwa unbehandelte Biofilme und Leerproben, die ausschließlich Medium enthalten, um die Ergebnisse zu validieren.

Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch Beschallung (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Deutschland, UIP250MTP) für 5 min in 96-Well-Platten abgelöst, die frisches Kulturmedium zur Rückgewinnung der Zellen enthielten.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Durch die Integration des UIP400MTP in den Arbeitsablauf gemäß ASTM E2799-22 wird der Biofilmablösungsprozess hinsichtlich Gleichmäßigkeit, Effizienz und Hochdurchsatzanwendungen optimiert.