ASTM E2799-22 Protokoll für das Testen antimikrobieller Wirkung

Das Hielscher UIP400MTP ist ein leistungsstarkes und effizientes Multiwell-Plattenbeschallungsgerät, das den Beschallungsschritt im ASTM E2799-22-Protokoll vereinfacht. Durch die Abgabe gleichmäßiger Ultraschallenergie über die gesamte Mikrotiterplatte gewährleistet das UIP400MTP eine konsistente und zuverlässige Ablösung von Biofilmen von den Deckeln, ohne die Zellen zu beschädigen oder die Probenintegrität zu beeinträchtigen. Durch die hohe Durchsatzleistung und die benutzerfreundliche Bedienung wird die Verarbeitungszeit erheblich reduziert und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit verbessert, was das Gerät zu einer idealen Lösung für Labors macht, die Tests zur Lebensfähigkeit von Biofilmen und zur antimikrobiellen Wirksamkeit durchführen.

ASTM E2799

ASTM E2799 ist ein standardisiertes Prüfverfahren zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Mittel gegen Biofilme, wobei der Schwerpunkt auf Pseudomonas aeruginosa liegt. Biofilme sind komplexe mikrobielle Gemeinschaften, die an Oberflächen haften und eine erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Behandlungen aufweisen, was sie zu einer großen Herausforderung im Gesundheitswesen, in der Industrie und im Umweltbereich macht. Diese Methode verwendet den Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) Assay, um einen zuverlässigen und reproduzierbaren Rahmen für die Prüfung von Desinfektionsmitteln unter realistischen Biofilm-Bedingungen zu schaffen.

Wie trägt die Beschallung zur ASTM E2799 bei?

Die Beschallung spielt im ASTM E2799-Protokoll eine entscheidende Rolle, da sie die Ablösung von Biofilmen von Testoberflächen erleichtert und so eine genaue Bewertung der mikrobiellen Lebensfähigkeit nach der Behandlung gewährleistet. Durch den Einsatz kontrollierter Ultraschallenergie erzielt das Protokoll eine effiziente und konsistente Zerstörung des Biofilms, ohne die Zellen zu beschädigen, und ermöglicht so präzise und reproduzierbare Ergebnisse. Dies macht die ASTM E2799 zu einem unverzichtbaren Instrument für die Weiterentwicklung der Biofilmforschung und die Entwicklung wirksamer antimikrobieller Strategien.

Durchführung des MBEC-Tests gemäß ASTM E2799-22

Das ASTM E2799-22-Protokoll beschreibt die Schritte zur Bewertung der Wirksamkeit antimikrobieller Mittel gegen Biofilme. Bei Verwendung des Hielscher UIP400MTP-Mikrotiterplatten-Sonicators kann das Protokoll angepasst werden, um diese fortschrittliche Sonikationsmethode für die Biofilmablösung einzubeziehen. Im Folgenden werden die Schritte beschrieben, die auf die Verwendung des Mikrotiterplatten-Sonicators UIP400MTP zugeschnitten sind:

1. Herstellung von Biofilmen
   Bereiten Sie eine sterile 96-Well-Mikrotiterplatte mit abnehmbaren Deckeln vor.
   Die Vertiefungen mit einer standardisierten Bakteriensuspension in einem geeigneten Wachstumsmedium beimpfen.
   Setzen Sie den Stiftdeckel auf die Platte und achten Sie darauf, dass die Stifte vollständig in die Bakteriensuspension eingetaucht sind.
   Bebrüten Sie die Platte unter kontrollierten Bedingungen (z. B. Temperatur und Zeit), damit sich ein Biofilm auf den Stiften bilden kann.
2. Behandlung mit antimikrobiellen Wirkstoffen
   Nach der Biofilmbildung wird das Medium durch frisches Medium ersetzt, das die antimikrobiellen Prüfsubstanzen in unterschiedlichen Konzentrationen enthält.
   Bringen Sie den Deckel des Stifts wieder an und bebrüten Sie ihn unter den in der Versuchsanordnung angegebenen Bedingungen.
3. Vorbereitung für die Ablösung des Biofilms
   Nach der Behandlung den Stöpseldeckel durch Eintauchen in eine sterile Spüllösung abspülen, um Reste von antimikrobiellen Wirkstoffen und lose anhaftende planktonische Zellen zu entfernen.
4. Ablösung von Biofilmen mit dem Sonicator UIP400MTP
   Bereiten Sie eine neue 96-Well-Mikrotiterplatte vor, die ein Wiederfindungsmedium (z. B. Neutralisationsbouillon) enthält.
   Lösen Sie die Biofilme ab, indem Sie den Stöpseldeckel in die Vertiefungen der Rückgewinnungsmediumplatte setzen.
   Setzen Sie die Platte in den UIP400MTP-Sonicator ein und achten Sie darauf, dass der Deckel und die Platte richtig ausgerichtet sind.
   Stellen Sie den Sonicator auf 70-80 % Amplitude ein und beschallen Sie ihn 3-4 Minuten lang im Zyklusmodus, um eine gleichmäßige Ablösung des Biofilms ohne Zelllyse zu gewährleisten.
5. Bewertung der Lebensfähigkeit von Biofilmen
   Nach der Beschallung wird das Rückgewinnungsmedium, das die abgelösten Biofilmzellen enthält, mit mikrobiologischen oder analytischen Standardverfahren verarbeitet, z. B:
   • Auszählung koloniebildender Einheiten (KBE): Führen Sie serielle Verdünnungen durch und legen Sie eine Platte auf Agar für die Auszählung lebensfähiger Zellen an.
   • Messungen der optischen Dichte (OD): Verwenden Sie die spektrophotometrische Analyse zur Bewertung der Zelldichte.
   • Lebensfähigkeitstests auf Fluoreszenzbasis: Quantifizierung lebender und toter Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen.
6. Datenanalyse
   Vergleichen Sie die Lebensfähigkeitsdaten von behandelten und unbehandelten Biofilmen, um die Wirksamkeit der antimikrobiellen Mittel zu bestimmen.
   Berechnen Sie die minimale Biofilm-Eradikationskonzentration (MBEC) auf der Grundlage der Konzentration, die erforderlich ist, um lebensfähige Biofilmzellen zu eliminieren.
7. Qualitätskontrolle
   Stellen Sie gleichbleibende Beschallungsbedingungen sicher, indem Sie das UIP400MTP regelmäßig kalibrieren und überprüfen, dass der Biofilmablösungsprozess nicht zu einer signifikanten Zelllyse oder -zerstörung führt.
   Fügen Sie zur Validierung der Ergebnisse geeignete Kontrollen, wie unbehandelte Biofilme und Nur-Medium-Rohlinge, bei.

Die auf den Stiften gebildeten Biofilmzellen wurden durch 5-minütige Beschallung (Hielscher Ultraschalltechnik, Teltow, Deutschland, UIP250MTP) in 96-Well-Platten mit frischem Kulturmedium zur Rückgewinnung der Zellen abgelöst.
(Bild und Studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Durch die Integration des UIP400MTP in den ASTM E2799-22-Workflow wird der Prozess der Biofilmablösung für Konsistenz, Effizienz und Anwendungen mit hohem Durchsatz optimiert.