Extrazelluläre Matrix Extraktion mit dem 96-Well Sonicator UIP400MTP

Herkömmliche Verfahren für die Extraktion extrazellulärer Matrix (EM) umfassen oft mehrere Schritte, um die Biofilm-Matrix aufzubrechen. Diese Techniken sind zudem zeitaufwändig und non-uniform sein, was zu unterschiedlichen Ergebnissen führt. Mit dem 96-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP wird der EM-Extraktionsprozess erheblich vereinfacht, da er eine hocheffiziente, präzise und gleichmäßige Zerstörung des Biofilms in Hochdurchsatzformaten ermöglicht. Der UIP400MTP nutzt fokussierten Ultraschall, um kontrollierte Kavitation zu erzeugen, die die Biofilm-Matrix effektiv aufbricht und gleichzeitig die Lebensfähigkeit und Integrität der in den Biofilm eingebetteten Zellen erhält. Die Verwendung des UIP400MTP verbessert die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit nachgeschalteter Tests, wie z. B. metabolomische und proteomische Analysen, Lebensfähigkeitstests und Studien zur Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Substanzen. Durch die Rationalisierung der EM-Extraktion ermöglicht das UIP400MTP den Forschern, konsistente und hochwertige Ergebnisse zu erzielen, die tiefere Einblicke in die Dynamik des Biofilms und in die Interaktionen mit externen Substanzen ermöglichen.

Extraktion extrazellulärer Matrix

Die extrazelluläre Matrix (EM) ist ein wichtiger Bestandteil von Biofilmen, die von Mikroorganismen wie Candida albicans gebildet werden. Sie besteht aus Polysacchariden, Proteinen, Lipiden und extrazellulärer DNA. Die EM sorgt für strukturelle Integrität, vermittelt die Adhäsion an Oberflächen und trägt wesentlich zur antimikrobiellen Resistenz bei. Die Extraktion und Analyse des EM ist für das Verständnis der Biologie des Biofilms, die Aufklärung der Mechanismen der Arzneimittelresistenz und die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele von entscheidender Bedeutung.

Protokoll zur Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) aus Candida albicans-Biofilmen mit dem UIP400MTP

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) von statischen Candida albicans-Biofilmen. Die Integration des UIP400MTP-Sonicators ersetzt herkömmliches Abschaben oder enzymbasierte Schritte für eine verbesserte Effizienz und Reproduzierbarkeit.

Benötigte Materialien

Schritt-für-Schritt-Protokoll für die EM-Extraktion

1. Bildung eines statischen Biofilms
   Für statische Biofilme inokulieren Sie C. albicans in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit RPMI-1640-Medium. Jedes Well sollte ein gleichmäßiges Volumen an Inokulum enthalten (z.B. 200 µL pro Well).
   Die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C unter statischen Bedingungen inkubieren, damit sich auf den Oberflächen der Wells ein Biofilm bilden kann.
2. Vorbereitung des Biofilms für die Extraktion
   Nach der Inkubation wird das verbrauchte Medium aus jedem Well vorsichtig aspirieren und entleeren, ohne den Biofilm zu stören.
   Spülen Sie jedes Well sorgfältig mit sterilem PBS (z. B. 200 µl), um lose anhaftende Zellen und planktonische Ablagerungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   Geben Sie frisches PBS oder den Extraktionspuffer (z.B. 200 µl) in jedes Well, um so für die Beschallung vorzubereiten.
3. Beschallung mit dem Microplate Sonicator UIP400MTP
   Positionieren Sie die 96-Well-Platte mit PBS oder Extraktionspuffer im UIP400MTP Sonicator. Um die Multi-Well-Platte richtig zu platzieren, folgen Sie den Anweisungen des Handbuchs.
   5-6 Minuten lang bei einer Einstellung von 60 % Amplitude im Pulsmodus beschallen, um eine gleichmäßige Zerstörung der Biofilmstruktur und die Freisetzung von EM-Komponenten zu gewährleisten.
   Verwenden Sie die Temperaturkontrolle des UIP400MTP-Sonicators (Temperatursensor und -einstellungen), um eine übermäßige Erwärmung und thermische Beschädigung der Probe zu vermeiden.
4. Behandlung mit Kationenaustauschharzen (CER)
   Übertragen Sie die beschallte Flüssigkeit aus jedem Well in eine neue 96-Well-Platte.
   In jedes Well das doppelte Volumen der CER-Suspension (in PBS oder Puffer) geben (z. B. 400 µl Gesamtvolumen pro Well).
   Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 3 Stunden lang auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler oder Rotator bei 400 U/min, um die Bindung und Isolierung der EM-Komponenten zu ermöglichen.
5. Abtrennung und Filtration
   Zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 2.000 × g, um das Harz und die Zellen vom Überstand zu trennen.
   Überführen Sie den EM-haltigen Überstand aus jedem Well vorsichtig in eine neue 96-Well-Platte.
   Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-µm-Filter unter Verwendung eines plattenbasierten Vakuumverteilersystems oder eines gleichwertigen Systems, um einen sauberen EM-Extrakt zu erhalten.
6. Analyse der Extrazellulären Matrix
   Verwenden Sie Techniken wie UPLC-Q-TOF-MS für die ungezielte Erstellung von Metabolitenprofilen oder verwenden Sie spezifische Assays (z. B. BCA für Proteine, Triglycerid- und Kohlenhydratquantifizierungskits), um EM-Komponenten zu charakterisieren.

Extraktion der Extrazellulärmatrix im Hochdurchsatzverfahren

Die hohe Effizienz der Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) mit dem UIP400MTP-Sonicator hat die Probenvorbereitung für Assays, die eine genaue Analyse der Biofilmeigenschaften erfordern, revolutioniert. Der UIP400MTP nutzt fokussierte Ultraschallwellen, um die Biofilmmatrix präzise und gleichmäßig zu aufzubrechen und ermöglicht so die effektive Freisetzung von EM-Komponenten, während die Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen erhalten bleibt. Dieser Ansatz erhöht die Zuverlässigkeit von Tests wie Biofilm-Lebensfähigkeitstests, Proteom- und Metabolom-Studien und antimikrobiellen Empfindlichkeitsuntersuchungen erheblich.

Bei Biofilm-Recovery-Assays wie der Zählung koloniebildender Einheiten (CFU) gewährleistet die EM-Extraktion mit dem UIP400MTP einen ungehinderten Zugang der Reagenzien zu den in den Biofilm eingebetteten Zellen. Auch proteomische und metabolomische Analysen, wie UPLC-Q-TOF-MS, profitieren von der Isolierung von Proteinen, Lipiden und Metaboliten mit hoher Ausbeute. Der UIP400MTP unterstützt auch präzise antimikrobielle Empfindlichkeitstests und ermöglicht die genaue Bestimmung von Biofilm-MIC- und MBEC-Werten. Darüber hinaus unterstützt die effiziente Extraktion mit dem UIP400MTP Enzymaktivitätstests, die Quantifizierung von Bestandteilen und Strukturstudien, die wertvolle Einblicke in die Rolle der extrazellulären Matrizen bei der Biofilmarchitektur, der Adhäsion und den Resistenzmechanismen bieten.

Diese reproduzierbare Extraktionsmethode mit hohem Durchsatz optimiert die EM-Präparation und gewährleistet hervorragende Ergebnisse bei einer Reihe von biofilmbezogenen Tests.