Extraktion der extrazellulären Matrix mit dem 96-Well-Ultraschallgerät UIP400MTP

Herkömmliche Methoden zur Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) umfassen häufig mehrere Schritte, um die Biofilmmatrix aufzubrechen. Diese Verfahren können jedoch zeitaufwendig sein und uneinheitlich ablaufen, was zu Schwankungen der Ergebnisse führt. Mit dem 96-Well-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP wird die EM-Extraktion erheblich erleichtert und ein hocheffizientes, präzises und gleichmäßiges Aufbrechen von Biofilmen in Hochdurchsatzformaten ermöglicht. Der UIP400MTP erzeugt mithilfe von fokussiertem Ultraschall kontrollierte Kavitation, die die Biofilmmatrix wirksam aufbricht und dabei die Lebensfähigkeit und Integrität der im Biofilm eingebetteten Zellen erhält. Der Einsatz des UIP400MTP verbessert die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit nachfolgender Assays, beispielsweise metabolomischer und proteomischer Analysen, Viabilitätstests und Untersuchungen zur Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen. Durch die Vereinfachung der EM-Extraktion ermöglicht der UIP400MTP Forschenden, konsistente und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen und tiefere Einblicke in die Biofilmdynamik und die Wechselwirkungen mit externen Substanzen zu gewinnen.

Extraktion der extrazellulären Matrix

Die extrazelluläre Matrix (EM) ist ein wesentlicher Bestandteil von Biofilmen, die von Mikroorganismen wie Candida albicans gebildet werden. Die EM besteht aus Polysacchariden, Proteinen, Lipiden und extrazellulärer DNA, verleiht dem Biofilm strukturelle Integrität, vermittelt die Adhäsion an Oberflächen und trägt wesentlich zur Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen bei. Die Extraktion und Analyse der EM ist unerlässlich, um die Biologie von Biofilmen zu verstehen, Mechanismen der Wirkstoffresistenz aufzuklären und neue therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren.

Protokoll zur Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) aus Biofilmen von Candida albicans mit dem UIP400MTP

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) aus statischen Biofilmen von Candida albicans. Das Ultraschallgerät UIP400MTP wird integriert, um herkömmliches Abschaben oder enzymbasierte Schritte zu ersetzen und so die Effizienz und Reproduzierbarkeit zu verbessern.

Benötigte Materialien

Schritt-für-Schritt-Anleitung zur EM-Extraktion

1. Bildung eines statischen Biofilms
   Zur Bildung statischer Biofilme inokulieren Sie die Wells einer 96-Well-Platte mit C. albicans in RPMI-1640-Medium. Jedes Well sollte das gleiche Volumen an Inokulum enthalten (z. B. 200 µL pro Well).
   Inkubieren Sie die Platte bei 37°C unter statischen Bedingungen für 24 Stunden, damit sich auf den Oberflächen der Wells Biofilme bilden können.
2. Vorbereitung des Biofilms für die Extraktion
   Saugen Sie nach der Inkubation das verbrauchte Medium vorsichtig aus jedem Well ab und verwerfen Sie es, ohne den Biofilm zu beeinträchtigen.
   Spülen Sie jedes Well vorsichtig mit sterilem PBS (z. B. 200 µL), um locker anhaftende Zellen und planktonische Rückstände zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   Geben Sie frisches PBS oder den Extraktionspuffer (z. B. 200 µL) in jedes Well, um die Ultraschallbehandlung vorzubereiten.
3. Ultraschallbehandlung mit dem UIP400MTP
   Setzen Sie die 96-Well-Platte mit PBS oder Extraktionspuffer in die Aufnahme des Ultraschallgeräts UIP400MTP ein. Befolgen Sie die Anweisungen im Handbuch, um die Multiwell-Platte korrekt zu platzieren.
   Beschallen Sie die Platte für 5–6 Minuten mit einer schonenden Einstellung (60% Amplitude, Pulsmodus) und stellen Sie dabei sicher, dass die Biofilmstruktur gleichmäßig aufgebrochen und die EM-Komponenten freigesetzt werden.
   Nutzen Sie die Temperaturregelung des Ultraschallgeräts UIP400MTP (Temperatursensor und Einstellungen), um übermäßige Erwärmung oder Probenschäden zu vermeiden.
4. Behandlung mit Kationenaustauscherharz (CER)
   Überführen Sie die beschallte Flüssigkeit aus jedem Well in eine neue 96-Well-Platte.
   Geben Sie in jedes Well das doppelte Volumen an CER-Suspension (in PBS oder Puffer hergestellt) hinzu (z. B. 400 µL Gesamtvolumen pro Well).
   Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie auf einem Plattenschüttler oder Rotator bei 400 rpm für 3 Stunden, um die Bindung und Isolierung der EM-Komponenten zu ermöglichen.
5. Trennung und Filtration
   Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 × g für 10 Minuten, um das Harz und die Zellen vom Überstand zu trennen.
   Überführen Sie den EM-haltigen Überstand aus jedem Well vorsichtig in eine neue 96-Well-Platte.
   Filtrieren Sie den Überstand mithilfe eines Vakuumverteilersystems für Platten oder eines gleichwertigen Systems durch einen Filter mit 0,22 µm Porengröße, um einen sauberen EM-Extrakt zu erhalten.
6. Analyse der EM
   Verwenden Sie Verfahren wie UPLC-Q-TOF-MS für eine ungezielte Metabolitenprofilierung oder setzen Sie spezifische Assays ein (z. B. BCA für Proteine sowie Kits zur Quantifizierung von Triglyceriden und Kohlenhydraten), um die EM-Komponenten zu charakterisieren.

Extraktion der extrazellulären Matrix im Hochdurchsatz

Die hohe Effizienz der Extraktion der extrazellulären Matrix (EM) mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP hat die Probenvorbereitung für Assays revolutioniert, die eine genaue Analyse der Biofilmeigenschaften erfordern. Der UIP400MTP nutzt Ultraschallwellen, um die Biofilmmatrix präzise und gleichmäßig aufzubrechen und so EM-Komponenten wirksam freizusetzen, während die Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen erhalten bleiben. Dieser Ansatz verbessert die Zuverlässigkeit von Assays wie Biofilm-Viabilitätstests, proteomischen und metabolomischen Studien sowie Bewertungen der Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen erheblich.

Bei Assays zur Rückgewinnung von Biofilmzellen, beispielsweise der Zählung koloniebildender Einheiten (CFU), gewährleistet die EM-Extraktion mit dem UIP400MTP den ungehinderten Zugang der Reagenzien zu den im Biofilm eingebetteten Zellen. Ebenso profitieren proteomische und metabolomische Analysen wie UPLC-Q-TOF-MS von der Isolierung von Proteinen, Lipiden und Metaboliten mit hoher Ausbeute. Der UIP400MTP unterstützt außerdem präzise Empfindlichkeitstests gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und ermöglicht so die genaue Bestimmung der MIC- und MBEC-Werte von Biofilmen. Darüber hinaus unterstützt die durch den UIP400MTP erleichterte effiziente Extraktion Enzymaktivitätsassays, die Quantifizierung von Komponenten und Strukturuntersuchungen und liefert wertvolle Einblicke in die Rolle extrazellulärer Matrizes bei der Biofilmarchitektur, Adhäsion und bei Resistenzmechanismen.

Diese reproduzierbare Extraktionsmethode mit hohem Probendurchsatz optimiert die EM-Aufbereitung und gewährleistet hervorragende Ergebnisse bei einer Vielzahl biofilmbezogener Assays.