Protokoll zur Verwendung von Multi-Sample Sonicators in der Biofilm- und Proteomanalyse

Der Einsatz von Sonicators für mehrere Proben, wie dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator und dem UIP400MTP Microplate Sonicator, rationalisiert die Arbeitsabläufe im Labor für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Beide Geräte ermöglichen eine präzise und einheitliche Ultraschallverarbeitung mehrerer Proben, wodurch die Variabilität minimiert und die Reproduzierbarkeit verbessert wird. Dies ist besonders vorteilhaft bei Experimenten, die eine konsistente Probenlyse, Biofilmablösung, Proteinextraktion oder einen proteolytischen Verdau erfordern, wo manuelle Methoden oder Methoden für eine einzelne Probe weniger effizient und anfällig für Inkonsistenzen sind.

Optimierte Arbeitsabläufe mit Multi-Sample Sonicators

Der UIP400MTP beispielsweise ermöglicht die gleichzeitige Ultraschallbehandlung von Mikroplatten-Vertiefungen und sorgt für ein gleichmäßiges Ablösen von Biofilmen oder zellulärem Material. Der VialTweeter hingegen ermöglicht die präzise Lyse und Homogenisierung von Proben in mehreren Röhrchen ohne Kreuzkontamination. Diese Ultraschallgeräte verkürzen die Bearbeitungszeiten erheblich, verbessern die Reproduzierbarkeit von Experimenten und gewährleisten eine hohe Probenintegrität, was sie zu unverzichtbaren Werkzeugen in der Mikrobiologie, Proteomik und molekularbiologischen Forschung macht.
Nachfolgend finden Sie ein detailliertes Protokoll, das den Einsatz der beiden Hielscher Multi-Sample-Sonicator-Modelle - des VialTweeter Multi-Tube Sonicator und des Microplate Sonicator UIP400MTP - zur Ablösung eines E. coli-Biofilms und der anschließender Proteomanalyse veranschaulicht.

Protokoll: Biofilmbildung, Ablösung und Proteomanalyse mit Hielscher Multi-Sample Sonicators

1. Vorbereitung der Bakterienkulturen

• Kultivieren Sie E. coli-Bakterien (Stamm W3110) bei 30°C, einer für die E. coli-Biofilmbildung günstigen Temperatur, in Tryptonbouillon (TB)-Medium, das Folgendes enthält
  – 10 g/L Trypton
  – 5 g/L NaCl
• Geben Sie bei Bedarf Antibiotika hinzu, um den Erhalt des Plasmids zu gewährleisten.
• Für Mikroskopie- und Promotoraktivitätsstudien verwenden Sie den E. coli-Stamm W3110 mit einem genomischen Enhanced GFP (eGFP)-Reporter unter der Kontrolle des rplL-Promotors.
• Verwenden Sie GFP-Reporter-Plasmide für verschiedene Promotoren (z. B., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) zur Messung der Promotoraktivitäten.

2. Biofilm-Kultivierung und Ablösung

• 1,5 mL der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte (CellStar 12-Well-Platten, Greiner Bio-One) geben.
• Inkubieren Sie die Zellkultur, damit sich ein Biofilm bilden kann.
• Entfernen Sie die planktonische (nicht haftende) Kultur vorsichtig.

– Jedes Well mit 500 µl PBS waschen.
– Lösen Sie anhaftende Zellen durch Beschallen der 12-Well-Platte im Mikroplatten-Sonicator UIP400MTP. Der UIP400MTP sorgt für ein gleichmäßiges Ablösen des Biofilms, indem er über alle Wells hinweg eine gleichmäßige Ultraschallenergie abgibt.
– Einstellungen für die Beschallung: 60% Amplitude, Zyklusmodus: 60 Sekunden EIN / 30 Sekunden AUS.

3. Zellernte und Lyse

• Zentrifugieren Sie die abgelöste Biofilmzellen 5 Minuten lang bei 4.500 g.
• Waschen Sie die pelletierten Zellen mit PBS.
• Eesuspendieren Sie die Zellen in 100 µl 2% Natriumlauroylsarkosinat (SLS) und Inkubieren Sie diese für 15 Minuten bei 95°C.
• Beschallen Sie die Proben mit dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator für eine vollständige Zelllyse.
  – Einstellungen für die Beschallung: 100 % Amplitude, 50 s EIN / 10 s AUS bei einer Gesamtlaufzeit von 10 Minuten; Proben auf Eis lagern.

4. Reduktion und Alkylierung

• Fügen Sie 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) hinzu, um die Disulfidbindungen zu reduzieren, und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 95°C.
• Alkylieren Sie die Proteine mit 10 mM Iodacetamid für 30 Minuten bei 25°C.

5. Quantifizierung und Verdauung der Proteine

• Lysate zentrifugieren, um Zelltrümmer zu entfernen.
• Quantifizieren Sie den Gesamtproteingehalt mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Lassen Sie 50 µg Gesamtprotein mit 1 µg Trypsin in einer Lösung mit 2% SLS und 100 mM Ammoniumbicarbonat verdauen.
• Die Verdauungsreaktion über Nacht bei 30°C inkubieren.

6. Peptid-Aufreinigung

• Fällen Sie SLS durch Zugabe von 1,5 % Trifluoressigsäure (TFA) aus, anschließend zentrifugieren.
• Aufreinigung von Peptiden mit C18-Mikrospin-Säulen.
• Trocknen Sie die aufgereinigten Peptide und resuspendieren Sie diese in 0,1 % TFA.

7. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)

• Analysieren Sie die Peptide mit einem Q-Exactive Plus Massenspektrometer, das mit einem Ultimate 3000 RSLC-Nanosystem gekoppelt ist.
• Trennen Sie die Peptide mit einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (75 µm × 42 cm), die mit C18-Harz (2,4 µm) gepackt ist.
• Verwenden Sie einen Gradienten von 2 % bis 35 % Lösungsmittel B (Acetonitril mit 0,15 % Ameisensäure) über 140 Minuten.
• Erfassen Sie Daten mit hochauflösenden MS-Scans, gefolgt von Tandem-MS/MS-Scans der 10 intensivsten Ionen.

8. Datenanalyse

• Die Verarbeitung von LC-MS-Rohdaten erfolgt mit der Progenesis-Software.
• Exportieren Sie .mgf-Dateien und analysieren Sie diese mit MASCOT.
• Führen Sie die Peptidquantifizierung mit SafeQuant für die Qualitätskontrolle und eine False Discovery -Anpassung durch.
• Führen Sie alle Experimente in doppelter oder dreifacher Ausführung durch, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Multi-Sample Sonicators für die Probenvorbereitung im Hochdurchsatzverfahren

Die Multi-Sample Sonicator-Modelle VialTweeter und UIP400MTP verbessern die Präzision und Effizienz experimenteller Arbeitsabläufe erheblich, so z.B. in der Biofilmforschung und Proteomik. Ihre Fähigkeit, mehrere Proben gleichmäßig zu verarbeiten, gewährleistet eine hohe Durchsatzkapazität ohne Beeinträchtigung der Datenqualität. Diese Vorteile in Verbindung mit den oben beschriebenen optimierten Arbeitsabläufen machen Hielscher Multi-Sample Sonicators zu unverzichtbaren Werkzeugen für die moderne biologische Forschung.

Design, Herstellung und Beratung – Qualität Made in Germany

Hielscher Ultraschallgeräte sind bekannt für höchste Qualität und Designstandards. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die problemlose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen sind für Hielscher Ultraschallgeräte kein Problem.

Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Sonicators CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.