Protokoll zur Verwendung von Hielscher Mehrproben-Ultraschallgeräten bei der Biofilm- und Proteomanalyse

Der Einsatz von Mehrproben-Ultraschallgeräten wie dem VialTweeter Ultraschallgerät für mehrere Probenröhrchen und dem UIP400MTP Ultraschallgerät für Mikrotiterplatten vereinfacht Laborabläufe für Hochdurchsatzanwendungen. Beide Geräte ermöglichen eine präzise und gleichmäßige Ultraschallbehandlung mehrerer Proben, wodurch die Variabilität minimiert und die Reproduzierbarkeit verbessert wird. Dies ist besonders vorteilhaft bei Experimenten, die eine einheitliche Probenlyse, Biofilmablösung, Proteinextraktion oder einen einheitlichen proteolytischen Verdau erfordern und bei denen manuelle Verfahren oder Verfahren zur Einzelprobenbehandlung weniger effizient und anfällig für uneinheitliche Ergebnisse sind.

Arbeitsabläufe mit Mehrproben-Ultraschallgeräten vereinfachen

Der UIP400MTP ermöglicht beispielsweise die gleichzeitige Ultraschallbehandlung der Wells von Mikrotiterplatten und gewährleistet dabei eine gleichmäßige Ablösung von Biofilmen oder Zellmaterial. Der VialTweeter bietet eine präzise Lyse und Homogenisierung mehrerer Proben in Röhrchen ohne Kreuzkontamination. Diese Ultraschallgeräte verkürzen die Bearbeitungszeiten erheblich, verbessern die Reproduzierbarkeit von Experimenten und erhalten eine hohe Probenintegrität. Dadurch sind sie unverzichtbare Werkzeuge für die Forschung in Mikrobiologie, Proteomik und Molekularbiologie.
Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Verwendung der Hielscher Mehrproben-Ultraschallgeräte, des VialTweeter Ultraschallgeräts für mehrere Probenröhrchen und des Ultraschallgeräts für Mikrotiterplatten UIP400MTP, in einer Studie zur Biofilmbildung von E. coli und anschließenden Proteomanalyse veranschaulicht.

Protokoll: Biofilmbildung, Ablösung und Proteomanalyse mit Hielscher Mehrproben-Ultraschallgeräten

1. Vorbereitung der Bakterienkultur

• Kultivieren Sie E. coli-Bakterien (Stamm W3110) bei 30°C, einer für die Biofilmbildung von E. coli günstigen Temperatur, in Trypton-Bouillon (TB) mit folgender Zusammensetzung:
  – 10 g/L Trypton
  – 5 g/L NaCl
• Setzen Sie bei Bedarf Antibiotika zu, um den Erhalt der Plasmide sicherzustellen.
• Verwenden Sie für Mikroskopie und Untersuchungen der Promotoraktivität den E. coli-Stamm W3110 mit einem genomischen Enhanced-GFP-Reporter (eGFP) unter der Kontrolle des rplL-Promotors.
• Verwenden Sie GFP-Reporterplasmide für verschiedene Promotoren (z. B. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD), um die Promotoraktivitäten zu messen.

2. Biofilmkultivierung und Ablösung

• Geben Sie pro Well 1,5 mL verdünnte Bakterienkultur in eine 12-Well-Platte (CellStar 12-Well-Platten, Greiner Bio-One).
• Inkubieren Sie die Kultur, um die Biofilmbildung zu ermöglichen.
• Entfernen Sie vorsichtig die planktonische (nicht adhärente) Kultur.

– Waschen Sie jedes Well mit 500 µL PBS.
– Lösen Sie die anhaftenden Zellen ab, indem Sie die 12-Well-Platte im UIP400MTP Ultraschallgerät für Mikrotiterplatten beschallen. Der UIP400MTP gewährleistet eine gleichmäßige Ablösung, indem er allen Wells gleichmäßig Ultraschallenergie zuführt.
– Beschallungseinstellungen: 60% Amplitude, Zyklusbetrieb: 60 sec EIN / 30 sec AUS.

3. Zellernte und Lyse

• Zentrifugieren Sie die abgelösten Biofilmzellen bei 4.500 g für 5 Minuten.
• Waschen Sie die pelletierten Zellen mit PBS.
• Resuspendieren Sie die Zellen in 100 µL einer 2%igen Natriumlauroylsarkosinat-Lösung (SLS) und inkubieren Sie sie bei 95°C für 15 Minuten.
• Beschallen Sie die Proben mit dem VialTweeter Ultraschallgerät für mehrere Probenröhrchen, um eine vollständige Zelllyse sicherzustellen.
  – Beschallungseinstellungen: 100% Amplitude, 50 s EIN / 10 s AUS bei einer Gesamtlaufzeit von 10 min; halten Sie die Proben auf Eis.

4. Reduktion und Alkylierung

• Geben Sie 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) zur Reduktion der Disulfidbindungen hinzu und inkubieren Sie bei 95°C für 15 Minuten.
• Alkylieren Sie die Proteine mit 10 mM Iodacetamid für 30 Minuten bei 25°C.

5. Proteinquantifizierung und Verdau

• Zentrifugieren Sie die Lysate, um Zelltrümmer zu entfernen.
• Quantifizieren Sie den Gesamtproteingehalt mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Verdauen Sie 50 µg Gesamtprotein mit 1 µg Trypsin in einer Lösung mit 2% SLS und 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat.
• Inkubieren Sie den Verdauansatz über Nacht bei 30°C.

6. Peptidreinigung

• Fällen Sie SLS durch Zugabe von 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) aus und zentrifugieren Sie anschließend.
• Reinigen Sie die Peptide mit C18-Microspin-Säulen.
• Trocknen Sie die gereinigten Peptide und resuspendieren Sie sie in 0,1% TFA.

7. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)

• Analysieren Sie die Peptide mit einem Q-Exactive Plus Massenspektrometer, das mit einem Ultimate 3000 RSLC nano System gekoppelt ist.
• Trennen Sie die Peptide mit einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (75 µm × 42 cm), die mit C18-Harz (2,4 µm) gepackt ist.
• Wenden Sie über 140 Minuten einen Gradienten von 2% bis 35% Lösungsmittel B (Acetonitril mit 0,15% Ameisensäure) an.
• Erfassen Sie die Daten mittels hochauflösender MS-Scans, gefolgt von Tandem-MS/MS-Scans der 10 Ionen mit der höchsten Intensität.

8. Datenanalyse

• Verarbeiten Sie die LC-MS-Rohdaten mit der Progenesis-Software.
• Exportieren Sie .mgf-Dateien und analysieren Sie diese mit MASCOT.
• Führen Sie die Peptidquantifizierung mit SafeQuant zur Qualitätskontrolle und zur Anpassung hinsichtlich falsch positiver Ergebnisse durch.
• Führen Sie alle Experimente in Doppel- oder Dreifachbestimmungen durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Mehrproben-Ultraschallgeräte für die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung

Die Mehrproben-Ultraschallgeräte VialTweeter und UIP400MTP verbessern die Präzision und Effizienz experimenteller Arbeitsabläufe erheblich, insbesondere in der Biofilmforschung und Proteomik. Ihre Fähigkeit, mehrere Proben gleichmäßig zu behandeln, gewährleistet einen hohen Probendurchsatz, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. Diese Vorteile machen die Hielscher Mehrproben-Ultraschallgeräte zusammen mit den oben beschriebenen optimierten Arbeitsabläufen zu unverzichtbaren Werkzeugen für die moderne biologische Forschung.

Entwicklung, Fertigung und Beratung – Qualität Made in Germany

Hielscher Ultraschallgeräte sind für ihre höchsten Qualitäts- und Konstruktionsstandards bekannt. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Hielscher Ultraschallgeräte bewältigen auch raue Bedingungen und anspruchsvolle Einsatzumgebungen problemlos.

Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt besonderen Wert auf leistungsstarke Ultraschallgeräte mit modernster Technologie und hoher Benutzerfreundlichkeit. Selbstverständlich sind Hielscher Ultraschallgeräte CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.