Ultraschall-Lyse von Drosophila-Proben

Drosophila melanogaster wird in Laboratorien häufig als Modellorganismus verwendet. Daher fallen regelmäßig präanalytische Vorbereitungsschritte wie Lyse, Zellaufschluss, Proteinextraktion und DNA-Scherung von Drosophila melanogaster-Proben durchgeführt werden. Ultraschall-Dismembratoren sind zuverlässig und effizient und können verschiedene Aufgaben wie Lyse, Proteinextraktion oder DNA-Fragmentierung problemlos und zuverlässig erledigen. Für die unterschiedlichen Anwendungen müssen nur die Ultraschall-Prozessparameter entsprechend angepasst werden. Ultraschall-Homogenisatoren sind damit flexible Probenvorbereitungsgeräte mit einem breiten Anwendungsspektrum.

Ultraschall-Lyse und Proteinextraktion

Lyse, Zellsolubilisierung, Gewebehomogenisierung und Proteinextraktion sind typische Aufgaben für Ultraschalldismembratoren in biologischen Laboratorien. Ultraschalldismembratoren und Zelldisruptoren sind gut geeignet, um tierisches Gewebe, Insekten (z.B. Drosophila melanogaster, C. elegans) oder Pflanzenzellen zu homogenisieren. Nachgelagerte Anwendungen bei der ultraschall-gestützten Probenvorbereitung sind die Lyse von Zellsuspensionen und Pellets sowie die Extraktion intrazellulärer Proteine.
Die ultraschall-gestützte Lyse und Protein-Extraktion sind sehr zuverlässige und reproduzierbare Verfahren, welche auf Grundlage etablierter Protokolle durchgeführt werden können. Da die Intensität des Ultraschallprozesses über Beschallungsparameter wie Amplitude, Zyklus-/Pulsmodus, Temperatur und Probenvolumen exakt eingestellt werden kann, können einmal erprobte Protokolle immer wieder mit dem gleichen Ergebnis wiederholt werden.

Ultraschall-DNA- und RNA-Fragmentierung

Anschließend an den Zellaufschluss und die Proteinextraktion gehören die Scherung und Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin häufig zu den notwendigen Schritten der Probenvorbereitung, z.B. vor der Chromatin Immunopräzipitation (ChIP). Die Fragmentierung von DNA und RNA wird erreicht, indem die kovalenten Bindungen, welche die DNA zusammenhalten, durch physikalische Kräfte aufgebrochen werden. Durch den Einsatz von mechanischen Scherkräften des Ultraschalls werden zuerst die DNA-Stränge voneinander getrennt; anschließend werden diese Stränge in kleinere Fragmente zerbrochen.
Die Ultraschall-DNA-Fragmentierung ist zuverlässig und effizient beim Scheren der DNA auf eine bestimmte Zielgröße, z.B. 500bp (Basenpaare). Zu den Hauptvorteilen der ultraschall-gestützten DNA-Fragmentierung gehört die präzise Kontrolle der Prozessparameter und Intensität des Ultraschalls. Die Ultraschallprozessparameter können durch eine genaue Abstimmung von Beschallungsintensität, Zyklen und Zeit eingestellt werden. Dadurch ist es möglich, gewünschte DNA-Fragmentlängen zu erzeugen und diese gewisse DNA-Länge kann zuverlässig produziert und reproduziert werden. Das ultraschall-gestützte DNA-Scheren ist auch ideal, um DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht zu erzeugen.

Protokolle für die Ultraschall-Lyse von Drosophila melanogaster

Nachstehend finden Sie verschiedene Protokolle für die ultraschall-gestützte Lyse, Proteinextraktion und DNA- sowie Chromatin-Fragmentierung von Drosophila-Proben.

Ultraschall-Lyse für den Cross Linking-Immunpräzipitation (CLIP) Assay

Für den CLIP Assay wurden ca. 20 mg Eierstöcke von 0- bis 1-Tag-alten Wildtypweibchen mit UV vernetzt (3 × 2000 μJ/cm2) und dann auf Eis in 1 mL RCB Pufferlösung (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) unter Zugabe von 300 U RNAseOUT homogenisiert und für 30 Min. auf Eis gelegt. Das Homogenat wurde auf Eis bei 80% Leistung und fünfmal mit 20s langen Ultrascahllpulsen mit jeweils 60s Pause dazwischen beschallt. Für die Beschallung wurde ein Hielscher Ultraschallprozessor UP100H (100 W, 30 kHz) verwendet. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (16000 × g für 5 min bei 4°C). Das lösliche Extrakt wurde mit 20 μl Protein-G-Dynabeads für 20 min bei 4°C vorgereinigt. Nach Entfernung der Proben für das Immunoblotting und Quantifizierung des RNA-Inputs (1 %) wurde HP1 mit dem anti-HP1 9A9-Antikörper aus 450 μl vorgereinigten Extrakt durch Inkubation für 4 h mit 50 μl Protein-G-Dynabeads immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden 4-mal mit RCB gewaschen. Um die immunpräzipitierten RNAs zu eluieren, wurden die pelletierten Beads in 100 μL von ultrareinem DEPC-behandeltem Wasser für 5 min gekocht. 900 μL Qiazol-Reagenz wurde dem Überstand, der für die RNA-Präparation gewonnenen wurde, hinzugefügt. Die gereinigte RNA wurde als Vorlage zur Synthese von cDNA unter Verwendung von Oligo-dT, Random-Hexameren und SuperScript Reverse Transkriptase III gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet.
(Cassale et al. 2019)

Ultraschall-Lyse für Chromatin-Immunpräzipitations-Assay

Die Chromatin-Immunpräzipitation wurde gemäß dem von Menet beschriebenen Verfahren mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Ungefähr 20 mg Eierstöcke von 0 bis 1 Tag alten Wildtyp-Weibchen wurden in 1 ml NEB-Puffer (10 mM HEPES-Na bei pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bei pH 8, 0,5 mM homogenisiert EDTA-Na bei pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1 × EDTA-freie vollständige Proteaseinhibitoren) mit einem Homogenisator / Immersionsdispergierer 1 min lang (bei 3000 U/min) homogenisiert. Das Homogenisat wurde in eine vorgekühlte Dounce-Glasgefäß überführt und 15 volle Stöße wurden mit eine dichten Pistille eingetragen. Freie Kerne wurden dann 10 min bei 4°C mit 6000 × g zentrifugiert. Die nuclei-haltigen Pellets wurden in 1 ml NEB resuspendiert und 20 min bei 20000 × g auf einem Saccharosegradienten zentrifugiert (0,65 ml 1,6 M Saccharose in NEB, 0,35 ml 0,8 M Saccharose in NEB). Das Pellet wurde in 1 ml NEB und Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1% resuspendiert. Die Nuklei wurden 10 min bei Raumtemperatur vernetzt und durch Zugabe von 1/10 Vol. 1,375 M Glycin gequencht. Die Nuklei wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 6000 × g geerntet. Die Nuklei wurden zweimal in 1 ml NEB gewaschen und in 1 ml Lysepuffer (15 mM HEPES-Na bei pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bei pH 8, 1% Triton X-100, 0,5) resuspendiert mM DTT, 0,1% Na-Desoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% N-Lauroylsarcosin und 1 × EDTA-freie vollständige Proteaseinhibitoren). Die Nuklei wurden unter Verwendung eines Hielscher Ultraschallprozessors UP100H (100 W, 30 kHz) sechs Mal für 20 s auf und einmal für 1 min auf Eis beschallt. Beschallte Nuklei wurden bei 13000 × g für 4 min bei 4°C zentrifugiert. Die Mehrheit des beschallten Chromatins war 500 bis 1000 Basenpaare (bp) lang. Für jede Immunpräzipitation wurden 15 μg Chromatin in Gegenwart von 10 μg monoklonalen Antikörpern HP1 9A9 inkubiert (3 h bei 4°C in einem Revolver-Schüttler). Dann wurden 50 μl von Dynabeads Protein G hinzugefügt und die Inkubation über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Die Überstände wurden verworfen, und die Proben wurden zweimal in Lysepuffer (jeweils 15 min bei 4°C) und zweimal in TE-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bei pH 8) gewaschen. Chromatin wurde von den Beads in zwei Schritten eluiert; zuerst in 100 μl von Elutionspuffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bei pH 8) bei 65°C für 15 min, gefolgt von Zentrifugation und Rückgewinnung des Überstandes. Das Beads-Material wurde in 100 μl von TE + 0,67% SDS re-extrahiert. Das kombinierte Eluat (200 μl) wurde über Nacht bei 65°C inkubiert, um die Quervernetzungen umzukehren, und mit 50 μg/ml RNaseA für 15 min bei 65°C und mit 500 μg/ml Proteinase K für 3 h bei 65°C behandelt. Die Proben wurden in Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde in 25 μl Wasser resuspendiert. Um die molekularen Analysen mit immunpräzipitierter DNA zu maximieren, wurden Kandidatengene paarweise durch ein optimiertes Duplex-PCR-Protokoll amplifiziert, indem zwei verschiedene Sätze von Primern mit ähnlichen Schmelztemperaturen in einer einzigen Reaktion verwendet wurden.
(Casale et al. 2019)
 

Leistungsstarker Ultraschall-Dismembrator für biologische Proben

Hielscher Ultrasonics ist Ihr langjährig erfahrener Partner, wenn es um Hochleistungs-Ultraschallgeräte für Zellaufschluss, Lyse, Proteinextraktion, DNA-, RNA- und Chromatin-Fragmentierung sowie andere präanalytische Probenvorbereitungsschritte geht. Mit einem umfassenden Portfolio an Ultraschall-Laborhomogenisatoren und Probenvorbereitungsgeräten hat Hielscher das ideale Ultraschallgerät für Ihre biologische Anwendung und Ihre Anforderungen.
Klassische Ultraschallstabschwinger mit Mikrospitze wie der UP200St (200W; siehe Bild links) oder eine der Ultraschall-Probenpräparationseinheiten VialTweeter oder UP200ST_TD_CupHorn mit VialHolder sind beliebte Modelle in Forschungs- und Analyselabors. Die klassische Ultraschallsonotrode ist ideal, wenn bei der Präparation weniger Proben lysiert, extrahiert oder fragmentiert werden müssen. Die Probenvorbereitungseinheiten VialTweeter und UP200St_TD_CupHorn ermöglichen die gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 bzw. 5 Fläschchen.
Wenn hohe Probenzahlen (z.B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten usw.) verarbeitet werden müssen, ist der UIP400MTP das ideale Ultraschallgerät. Der UIP400MTP funktioniert wie ein größeres Cuphorn, das mit Wasser gefüllt ist und genügend Platz für eine Mikrotiterplatte bietet. Angetrieben von einem 400 Watt starken Ultraschallprozessor liefert der UIP400MTP eine sehr gleichmässige und intensive Beschallung von Multiwell-Platten, um Zellen aufzubrechen, Proben zu lysieren, Pellets zu lösen, Proteine zu extrahieren oder DNA zu scheren.

Präzise Steuerung durch intelligente Software

Alle Hielscher Ultraschallgeräte ab 200 Watt sind mit einem digitalen Farb-Touchscreen und einer intelligenten Software ausgestattet. Über die intelligente Datenprotokollierung werden alle Ultraschall-Prozessparameter automatisch als CSV-Datei auf einer eingebauten SD-Karte gespeichert, sobald das Ultraschallgerät gestartet wird. Dies macht die Datenaufnahme und Protokollierung von Versuchsergebnissen so viel komfortabler. Nach den Beschallungsversuchen oder der Probenvorbereitung können Sie einfach die Beschallungsparameter der einzelnen Beschallungsläufe überprüfen und vergleichen.
Über das intuitiv bedienbare Menü können zahlreiche Parameter vor der Beschallung vorausgewählt werden: Um beispielsweise die Temperatur in der Probe zu kontrollieren und ihren thermische Zersetzung zu verhindern, kann eine Temperaturobergrenze eingestellt werden. Ein steckbare Temperatursensor, der mit der Ultraschalleinheit geliefert wird, gibt dem Ultraschallprozessor permanent Rückmeldung über die aktuelle Probentemperatur. Wenn die obere Temperaturgrenze erreicht ist, pausiert das Ultraschallgerät, bis die untere Grenze des eingestellten ∆T erreicht ist, und beginnt dann automatisch wieder mit der Beschallung.
Wenn eine Beschallung mit einem bestimmten Energieeintrag erforderlich ist, können Sie die Ultraschall-Gesamtenergie der Beschallung voreinstellen. Natürlich können auch Ultraschallpulsation und Zyklusmodi individuell eingestellt werden.
Um Ihre erfolgreichsten Beschallungsparameter wiederzuverwenden, können Sie verschiedene Beschallungsmodi (z.B. Beschallungszeit, Intensität, Zyklusmodus usw.) als voreingestellte Modi speichern, so dass sie einfach und schnell wieder gestartet werden können.
Für mehr Bedienungskomfort können alle digitalen Ultraschallgeräte über eine Browser-Fernbedienung in jedem gängigen Browser (z.B. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.) bedient werden. Die LAN-Verbindung ist eine einfache Plug-n-Play-Einrichtung und erfordert keine zusätzliche Software-Installation.
Wir bei Hielscher wissen, dass die erfolgreiche Beschallung von biologischen Proben Präzision und Wiederholbarkeit erfordert. Deshalb haben wir unsere Ultraschallgeräte als intelligente Geräte mit allen Eigenschaften konzipiert, welche eine effiziente, zuverlässige, reproduzierbare und bequeme Probenvorbereitung ermöglichen.

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Hinweis auf die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme, von Ultraschall-Mikrospitzen und klassischen Ultraschallhomogenisatoren bis hin zu MultiSample-Ultraschallgeräten für die bequeme und zuverlässige Vorbereitung zahlreicher Proben: