Ultraschalllyse von Drosophila-melanogaster-Proben

Drosophila melanogaster wird in Laboratorien häufig als Modellorganismus eingesetzt. Daher müssen präanalytische Vorbereitungsschritte wie Lyse, Zellaufschluss, Proteinextraktion und DNA-Scherung bei Drosophila-melanogaster-Proben regelmäßig durchgeführt werden. Ultraschall-Zelldisruptoren sind zuverlässig und effizient. Durch einfaches Anpassen der Ultraschallprozessparameter lassen sich damit verschiedene Aufgaben wie Lyse, Proteinextraktion oder DNA-Fragmentierung problemlos durchführen. Ultraschallhomogenisatoren sind somit flexible Werkzeuge mit einem breiten Anwendungsspektrum.

Ultraschalllyse und Proteinextraktion

Lyse, Zellsolubilisierung, Gewebehomogenisierung und Proteinextraktion sind typische Aufgaben für Ultraschall-Zelldisruptoren in biologischen Laboratorien. Ultraschall-Zelldisruptoren und Zellaufschlussgeräte eignen sich gut zur Homogenisierung von tierischem Gewebe, Insekten (z.B. Drosophila melanogaster, C. elegans) oder Pflanzenproben. Weitere Anwendungen der Ultraschallbehandlung sind die Lyse von Zellsuspensionen und Pellets sowie die Extraktion intrazellulärer Proteine.
Ultraschalllyse und Proteinextraktion sind äußerst zuverlässige und reproduzierbare Verfahren, die auf Grundlage etablierter Protokolle durchgeführt werden können. Da sich die Intensität des Ultraschallprozesses über Beschallungsparameter wie Amplitude, Zyklus- / Pulsmodus, Temperatur und Probenvolumen exakt einstellen lässt, können einmal bewährte Protokolle immer wieder mit demselben Ergebnis wiederholt werden.

DNA- und RNA-Fragmentierung mit Ultraschall

Nach der Zelllyse und Proteinextraktion ist die Scherung und Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin ein häufig erforderlicher Schritt der Probenvorbereitung, z.B. vor der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Die Fragmentierung von DNA und RNA lässt sich zuverlässig erreichen, indem die kovalenten Bindungen, die die DNA zusammenhalten, durch physikalische Kräfte aufgebrochen werden. Bei der physikalischen Scherung, beispielsweise durch Beschallung, werden zunächst die DNA-Stränge aufgebrochen und anschließend wird die DNA in kleinere Stücke fragmentiert.
Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall ermöglicht eine zuverlässige und effiziente Scherung der DNA auf eine angestrebte Länge, z.B. 500bp (Basenpaare). Zu den wesentlichen Vorteilen der DNA-Fragmentierung mit Ultraschall gehört die präzise Kontrolle der Ultraschallprozessparameter und der Intensität. Die Ultraschallprozessparameter lassen sich durch präzises Einstellen von Beschallungsintensität, Zyklen und Dauer anpassen. Dadurch können die gewünschten DNA-Fragmentgrößen erzeugt und die angestrebte DNA-Länge zuverlässig erreicht und reproduziert werden. Die DNA-Scherung mit Ultraschall eignet sich auch ideal zur Herstellung hochmolekularer DNA-Fragmente.

Protokolle zur Ultraschalllyse von Drosophila melanogaster

Nachfolgend finden Sie verschiedene Protokolle für die ultraschallunterstützte Lyse, Proteinextraktion sowie DNA- oder Chromatinfragmentierung von Drosophila-Proben.

Ultraschalllyse für den Cross-linking-Immunpräzipitations-Assay (CLIP)

Der CLIP-Assay wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Änderungen durchgeführt. Etwa 20 mg Ovarien von 0 bis 1 Tage alten Wildtyp-Weibchen wurden durch UV-Bestrahlung quervernetzt (3 × 2000 μJ/cm2), auf Eis in 1 mL RCB-Puffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 1× EDTA-freie Complete-Proteaseinhibitoren, 1 mM PMSF) mit Zusatz von 300 U RNAseOUT homogenisiert und für 30 min auf Eis gestellt. Das Homogenat wurde auf Eis bei 80% Leistung fünfmal für jeweils 20 s mit einer Pause von 60 s zwischen den Beschallungsintervallen mit dem Hielscher-Ultraschallprozessor UP100H (100 W, 30 kHz) beschallt und zentrifugiert (16.000 × g für 5 min bei 4°C). Der lösliche Extrakt wurde mit 20 μl Protein-G-Dynabeads für 20 min bei 4°C vorgereinigt. Nach Entnahme von Proben für das Immunoblotting und die Quantifizierung des RNA-Inputs (1%) wurde HP1 mit dem Anti-HP1-9A9-Antikörper aus 450 μl vorgereinigtem Extrakt durch Inkubation für 4 h mit 50 μl Protein-G-Dynabeads immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden 4-mal mit RCB gewaschen. Zur Elution der immunpräzipitierten RNAs wurden die pelletierten Beads in 100 μL UltraPure DEPC-behandeltem Wasser für 5 min gekocht. Dem zur RNA-Präparation gewonnenen Überstand wurden 900 μL Qiazol-Reagenz zugesetzt. Die gereinigte RNA wurde als Matrize für die cDNA-Synthese mit Oligo-dT, zufälligen Hexameren und SuperScript Reverse Transkriptase III gemäß dem Herstellerprotokoll verwendet.
(Cassale et al. 2019)

Ultraschalllyse für den Chromatin-Immunpräzipitations-Assay

Die Chromatin-Immunpräzipitation wurde nach der von Menet beschriebenen Methode mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Etwa 20 mg Ovarien von 0 bis 1 Tage alten Wildtyp-Weibchen wurden in 1 mL NEB-Puffer (10 mM HEPES-Na bei pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bei pH 8, 0,5 mM EDTA-Na bei pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1× EDTA-freie Complete-Proteaseinhibitoren) mit einem Homogenisator / Eintauchdispergierer für 1 min bei 3000 rpm homogenisiert. Das Homogenat wurde in einen vorgekühlten Dounce-Homogenisator aus Glas überführt und mit einem eng anliegenden Stempel durch 15 vollständige Hübe homogenisiert. Freie Zellkerne wurden anschließend bei 6000xg für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Die zellkernhaltigen Pellets wurden in 1 mL NEB resuspendiert und bei 20.000 × g für 20 min auf einem Saccharosegradienten (0,65 mL 1,6 M Saccharose in NEB, 0,35 mL 0,8 M Saccharose in NEB) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 mL NEB resuspendiert und Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1% zugesetzt. Die Zellkerne wurden für 10 min bei Raumtemperatur quervernetzt; die Reaktion wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 1,375 M Glycin gestoppt. Die Zellkerne wurden durch Zentrifugation bei 6000 × g für 5 min gesammelt. Sie wurden zweimal in 1 mL NEB gewaschen und in 1 mL Lysepuffer (15 mM HEPES-Na bei pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bei pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% N-Lauroylsarcosin und 1× EDTA-freie Complete-Proteaseinhibitoren) resuspendiert. Die Zellkerne wurden mit dem Hielscher-Ultraschallprozessor UP100H (100 W, 30 kHz) sechsmal für jeweils 20 s beschallt und jeweils für 1 min auf Eis gehalten. Die beschallten Zellkerne wurden bei 13.000 × g für 4 min bei 4°C zentrifugiert. Der größte Teil des beschallten Chromatins hatte eine Länge von 500 bis 1000 Basenpaaren (bp). Für jede Immunpräzipitation wurden 15 μg Chromatin in Gegenwart von 10 μg des monoklonalen HP1-9A9-Antikörpers inkubiert (3 h bei 4°C auf einem Rotationsrad). Anschließend wurden 50 μl Dynabeads Protein G zugesetzt und die Inkubation über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Die Überstände wurden verworfen und die Proben zweimal in Lysepuffer (jeder Waschschritt 15 min bei 4 °C) sowie zweimal in TE-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bei pH 8) gewaschen. Das Chromatin wurde in zwei Schritten von den Beads eluiert: zunächst in 100 μl Elutionspuffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bei pH 8) bei 65°C für 15 min, gefolgt von Zentrifugation und Gewinnung des Überstands. Das Bead-Material wurde in 100 μl TE + 0,67% SDS erneut extrahiert. Das vereinigte Eluat (200 μl) wurde über Nacht bei 65°C inkubiert, um die Quervernetzungen aufzuheben, und mit 50 μg/ml RNaseA für 15 min bei 65°C sowie mit 500 μg/ml Proteinase K für 3 h bei 65°C behandelt. Die Proben wurden mit Phenol–Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde in 25 μl Wasser resuspendiert. Um die molekularen Analysen mit der immunpräzipitierten DNA zu maximieren, wurden Kandidatengene paarweise nach einem optimierten Duplex-PCR-Protokoll amplifiziert. Dabei wurden zwei unterschiedliche Primersätze mit ähnlichen Schmelztemperaturen in einer einzigen Reaktion verwendet.
(Casale et al. 2019)
 

Leistungsstarke Ultraschall-Zellaufschlussgeräte für biologische Proben

Hielscher Ultrasonics ist Ihr Partner mit langjähriger Erfahrung, wenn es um leistungsstarke Ultraschallgeräte für Zellaufschluss, Lyse, Proteinextraktion, DNA-, RNA- und Chromatinfragmentierung sowie weitere präanalytische Schritte der Probenvorbereitung geht. Mit einem umfassenden Angebot an Ultraschall-Laborhomogenisatoren und Geräten zur Probenvorbereitung bietet Hielscher das ideale Ultraschallgerät für Ihre biologische Anwendung und Ihre Anforderungen.
Klassische Ultraschallgeräte mit Mikrospitzen-Sonotrode wie das UP200St (200W; siehe Abbildung links) oder eines der Ultraschallgeräte zur Probenvorbereitung VialTweeter oder UP200ST_TD_CupHorn mit VialHolder sind beliebte Modelle in Forschungs- und Analyselaboratorien. Die klassische Ultraschallsonotrode ist ideal, wenn eine geringe Anzahl von Proben lysiert, extrahiert oder fragmentiert werden muss. Die Geräte zur Probenvorbereitung VialTweeter und UP200St_TD_CupHorn ermöglichen die gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 bzw. 5 Probengefäßen.
Wenn große Probenzahlen (z.B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten usw.) verarbeitet werden müssen, ist das UIP400MTP das ideale Beschallungssystem. Das UIP400MTP funktioniert wie ein größerer CupHorn, der mit Wasser gefüllt ist und ausreichend Platz für Mikrotiterplatten bietet. Angetrieben von einem Ultraschallprozessor mit einer Leistung von 400 Watt ermöglicht das UIP400MTP eine sehr gleichmäßige und intensive Beschallung von Multiwell-Platten, um Zellen aufzuschließen, Proben zu lysieren, Pellets zu solubilisieren, Proteine zu extrahieren oder DNA zu scheren.

Präzise Steuerung durch intelligente Software

Alle Beschallungslösungen von Hielscher ab 200 Watt sind mit einem digitalen Farb-Touchscreen und intelligenter Software ausgestattet. Die intelligente Datenprotokollierung speichert alle Ultraschallprozessparameter automatisch als CSV-Datei auf einer integrierten SD-Karte, sobald das Ultraschallgerät gestartet wird. Das erleichtert Forschung und Protokollierung erheblich. Nach den Beschallungsversuchen oder der Probenvorbereitung können Sie die Beschallungsparameter jedes Durchlaufs einfach überprüfen und miteinander vergleichen.
Über das intuitive Menü lassen sich zahlreiche Parameter vor der Beschallung voreinstellen: Um beispielsweise die Temperatur in der Probe zu kontrollieren und einen thermischen Abbau zu verhindern, kann eine Obergrenze für die Probentemperatur festgelegt werden. Ein ansteckbarer Temperatursensor, der mit dem Ultraschallgerät geliefert wird, meldet dem Ultraschallprozessor die tatsächliche Beschallungstemperatur. Wenn die obere Temperaturgrenze erreicht ist, pausiert das Ultraschallgerät, bis die untere Grenze des eingestellten ∆T erreicht ist, und setzt die Beschallung anschließend automatisch fort.
Wenn eine Beschallung mit einem bestimmten Energieeintrag erforderlich ist, können Sie die insgesamt einzutragende Ultraschallenergie für den Beschallungsdurchlauf voreinstellen. Selbstverständlich lassen sich auch Ultraschallpulsation und Zyklusmodus individuell einstellen.
Um Ihre erfolgreichsten Beschallungsparameter erneut zu verwenden, können Sie verschiedene Beschallungsmodi (z.B. Beschallungsdauer, Intensität, Zyklusmodus usw.) als Voreinstellungen speichern, sodass sie sich einfach und schnell wieder starten lassen.
Für zusätzlichen Bedienkomfort können alle digitalen Ultraschallgeräte per Browser-Fernsteuerung in jedem gängigen Browser (z.B. InternetExplorer, Safari, Chrome usw.) bedient werden. Die LAN-Verbindung lässt sich einfach per Plug-and-play einrichten und erfordert keine zusätzliche Softwareinstallation.
Wir bei Hielscher wissen, dass die erfolgreiche Beschallung biologischer Proben Präzision und Wiederholbarkeit erfordert. Deshalb haben wir unsere Ultraschallgeräte als intelligente Geräte mit allen Funktionen konzipiert, die eine effiziente, zuverlässige, reproduzierbare und komfortable Probenvorbereitung ermöglichen.

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme – von Ultraschall-Mikrospitzen und klassischen Ultraschallhomogenisatoren bis hin zu MultiSample-Ultraschallgeräten für die komfortable und zuverlässige Vorbereitung zahlreicher Proben: