Lyse von BL21-Zellen mittels Ultraschall
BL21-Zellen sind ein E. coli-Stamm, der aufgrund seiner Fähigkeit, Proteine hocheffizient zu exprimieren, in Forschungslabors, in der Biotechnologie und in der industriellen Produktion weit verbreitet ist. Der Zellaufschluss, die Lyse und Proteinextraktion mittels Ultraschall sind zuverlässige und weitverbreitete Methoden, um die Proteine aus der Zellmatrix von BL21-Zellen zu isolieren. Der Ultraschall zertrümmert die Zelle vollständig und setzt dadurch alle eingeschlossenen Proteine frei, so dass 100 % des Proteins verfügbar sind.
BL21 Zellen für die Proteinexpression
Die BL21-Zelle ist ein chemisch kompetenter E. coli-Bakterienstamm, der vor allem für die Transformation und effiziente Proteinexpression durch T7-RNA-Polymerase-IPTG-Induktion eingesetzt wird. BL21-Zellen ermöglichen eine hocheffiziente Proteinexpression jedes Gens, das unter Kontrolle eines T7-Promotors steht. Der E. coli-Stamm BL21(DE3) ist ein T7-RNA-Polymerase-basierter Proteinproduktionsstamm, der mit T7-Promotor-basierten Expressionsvektoren kombiniert wird und in Laboratorien und Industrie zur Herstellung rekombinanter Proteine weit verbreitet ist. In BL21(DE3) wird die Expression des für das rekombinante Protein kodierenden Gens durch die chromosomal kodierte T7-RNA-Polymerase (T7 RNAP) transkribiert, die achtmal schneller transkribiert als herkömmliche E. coli RNAP. Dies macht den BL21(DE3)-Stamm hocheffizient und damit zu einem der präferierten Proteinexpressions-Zellsysteme.
Protokoll für die Ultraschall-Lyse und Proteinextraktion aus BL21-Zellen
Die Zelllyse von BL21-Zellen erfolgt meist mittels Ultraschall in Kombination mit Natriumlauroylsarkosinat (auch Sarkosyl genannt) als Lysepuffer. Die Vorteile des Ultraschall-Zellaufschlusses und der -Proteinextraktion liegen in der Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit sowie in der einfachen, sicheren und schnellen Bedienung der Ultraschallgeräte. Das folgende Protokoll gibt eine schrittweise Anleitung für die ultraschall-gestützte BL21-Zelllyse:
- Um die Chaperon-Proteine zu entfernen, werden BL21-Bakterienpellets in 50 ml eiskaltem Natrium Tris-EDTA (STE)-Puffer (bestehend aus 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, ergänzt mit 100 mM PMSF) resuspendiert.
- Es werden 500 ul Lysozym (10 mg/ml) hinzugefügt, und die Zellen werden 15 Minuten lang auf Eis inkubiert.
- Danach werden 500 ul DTT und 7 ml Sarkosyl (10% (w/v) in STE-Puffer) hinzugefügt.
- Für eine erfolgreiche Proteinextraktion is es unerlässlich, alle Reinigungspuffer eiskalt zu halten und die Proben ständig auf Eis zu lagern. Alle Reinigungsschritte sollten nach Möglichkeit im Kühlraum durchgeführt werden.
- Für die Ultraschall-Lyse und Protein-Extraktion werden die Proben in dem VialTweeter MultiSample-Ultraschallgerät für 4 x 30 Sekunden bei 100% Amplitude beschallt. Zwischen den einzelnen Beschallungen liegt jeweils eine 2-minütige Pause. Alternativ kann auch ein Ultraschall-Homogenisator mit Mikrospitze, wie z.B. der UP200Ht mit S26d2 (3 x 30 sec, 2 Min. Pause zwischen den Ultraschallzyklen, 80% Amplitude) verwendet werden.
- Für weitere Reinigungsschritte müssen die Proben bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis oder alternativ bei -80°C gelagert werden.
Ultraschall-Zelldisruptor UP200St mit Mikrospitze S26d2 für Lyse und Proteinextraktion
Ultraschall-Lyse unter präziser Temperaturkontrolle
Die präzise und zuverlässige Temperaturkontrolle ist bei der Verarbeitung von biologischen Proben entscheidend. Hohe Temperaturen initiieren den thermisch induzierten Proteinabbau in Proben.
Wie alle mechanischen Probenpräparationstechniken erzeugt auch die Beschallung Wärme. Die Temperatur der Proben kann jedoch gut kontrolliert werden, wenn z.B. der VialTweeter oder ein anderes digitales Hielscher Ultrasachllgerät verwendet wird. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben zu überwachen und zu kontrollieren, während Sie diese z.B. mit dem VialTweeter und VialPress für die Analyse vorbereiten.
- Überwachung der Probentemperatur: Der Ultraschallprozessor UP200St, der den VialTweeter ansteuert, ist mit einer intelligenten Software und einem steckbaren Temperatursensor ausgestattet. Stecken Sie den Temperatursensor in den UP200St und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touch-Display können Sie im Menü des UP200St einen bestimmten Temperaturbereich für Ihre Probenbeschallung einstellen. Das Ultraschallgerät stoppt automatisch, wenn die maximale Temperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den niedrigeren Wert der eingestellten Temperatur gesunken ist ∆. Dann beginnt die Beschallung automatisch wieder. Diese intelligente Funktion verhindert wärmeinduzierte Probenzersetzung.
- Der VialTweeter-Block kann vorgekühlt werden. Legen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühl- oder Gefrierschrank, um den Titanblock vorzukühlen und so den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Wenn möglich, kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
- Verwenden Sie Trockeneis zur Kühlung während der Sonifizierung. Verwenden Sie eine flache, mit Trockeneis gefüllte Schale und platzieren Sie den VialTweeter auf dem Trockeneis, so dass die Wärme schnell abgeführt werden kann.
Kunden auf der ganzen Welt verwenden den VialTweeter und VialPress für ihre tägliche Probenvorbereitung in biologischen, biochemischen, medizinischen und klinischen Labors. Dank der intelligenten Software und der Temperaturregelung des UP200St-Prozessors wird die Temperatur zuverlässig geregelt und ein hitzeinduzierter Probenzersetzung vermieden. Die ultraschall-gestützte Probenvorbereitung mit dem VialTweeter und VialPress liefert höchst zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse!
Finden Sie den optimalen Ultraschall-Disruptor für Ihre Lyseanwendung
Hielscher Ultrasonics ist ein langjährig erfahrener Hersteller von Hochleistungs-Ultraschall-Zelldisruptoren und -Homogenisatoren für Laboratorien, Bench-Top- und Industrieanlagen. Die Größe Ihrer bakteriellen Zellkultur, Ihr Forschungs- oder Produktionsziel und das Volumen der pro Stunde oder Tag zu verarbeitenden Zellsuspensionen sind wesentliche Faktoren, um den richtigen Ultraschall-Zelldisruptor für Ihre Anwendung zu finden.
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Lösungen für die gleichzeitige Beschallung von mehreren Proben (bis zu 10 Fläschchen mit dem VialTweeter) und 96-Well Plates (z.B. Mikrotiterplatten / ELISA-Platten mit dem UIP400MTP), sowie das klassische Sonotroden-Ultraschallgerät mit verschiedenen Leistungsstufen von 50 bis 400 Watt bis hin zu vollindustriellen Ultraschallprozessoren mit bis zu 16.000 Watt pro Einheit für den kommerziellen Zellaufschluss und die Proteinextraktion in der Großproduktion. Alle Hielscher-Ultraschallgeräte sind für den 24/7/365-Betrieb unter Volllast gebaut. Robustheit und Zuverlässigkeit sind Kernmerkmale unserer Ultraschallgeräte.
Alle digitalen Ultraschall-Homogenisatoren sind mit intelligenter Software, farbigem Touch-Display und automatischer Datenprotokollierung ausgestattet, wodurch Hielscher Ultraschallgeräte zu einem komfortablen Arbeitsinstrument in Labor- und Produktionsanlagen werden.
Lassen Sie uns wissen, welche Art von Zellen, welches Volumen, mit welcher Häufigkeit und mit welchem Ziel Sie Ihre biologischen Proben verarbeiten müssen. Wir werden Ihnen den für Ihre Prozessanforderungen am besten geeigneten Ultraschall-Zelldisruptor empfehlen.
Die nachstehende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme, von kompakten, handgehaltenen Homogenisatoren und MultiSample-Ultraschallgeräten bis hin zu industriellen Ultraschallprozessoren für kommerzielle Anwendungen:
| Batch-Volumen | Durchfluss | Empfohlenes Ultraschallgerät |
|---|---|---|
| 96-Well Plates / Mikrotiterplatten | n.a. | UIP400MTP |
| 10 Vials à 0,5 bis 1,5mL | n.a. | VialTweeter + UP200St |
| 0.01 bis 250mL | 5 bis 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 bis 500mL | 10 bis 200ml/min | UP100H |
| 10 bis 2000ml | 20 bis 400ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 bis 20l | 0,2 bis 4l/min | UIP2000hdT |
| 10 bis 100l | 2 bis 10l/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 bis 100l/min | UIP16000 |
| n.a. | größere | Cluster aus UIP16000 |
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Wissenswertes
Escherichia Coli-Bakterien
Escherichia coli ist eine Bakterienart, welche säurebildend, nicht sporenbildend und gramnegativ ist und die Form eines geraden Stäbchens aufweist. E.soli gehört dementsprechend zu den sogenannten Stäbchenbakterien. E.coli-Bakterien kommen in der Umwelt, in Lebensmitteln und im Darm von Menschen und Tieren vor. E. coli ist in der Regel peritrich begeißelt und dadurch beweglich, es gibt aber auch nicht-bewegliche Typen. E.coli sind so genannte fakultativ anaerobe chemoorganotrophe Organismen, d.h. sie sind sowohl zum respiratorischen als auch zum fermentativen Stoffwechsel fähig. Die meisten E.coli-Typen sind gutartig und erfüllen nützliche Funktionen im Körper, z.B. die Unterdrückung des Wachstums schädlicher Bakterienarten, die Synthese von Vitaminen etc.
Escherichia-coli-Bakterienzellen des so genannten B-Typs sind eine besondere Kategorie von E.coli-Stämmen, die in der Forschung zur Untersuchung von Mechanismen wie Bakteriophagen-Sensitivität oder Restriktions-Modifikationssystemen weit verbreitet sind. Darüber hinaus werden E.coli-Bakterien als zuverlässiges Zellsystem für die Proteinexpression in biotechnologischen und biowissenschaftlichen Labors geschätzt. Beispielsweise werden E.coli zur Synthese von Verbindungen wie Proteinen und Oligosacchariden im industriellen Maßstab verwendet. Aufgrund spezifischer Merkmale wie Proteasemangel, geringer Acetatproduktion bei hohem Glukosegehalt und erhöhter Permeabilität sind E.coli B-Zellen die am häufigsten verwendeten Wirtszellen für die Produktion gentechnisch hergestellter Proteine.
Rekombinantes Protein
Rekombinante Proteine (rProt) gewinnen in vielfältigen Branchen an Bedeutung, unter anderem in der chemischen Produktion, der pharmazeutischen, kosmetischen, human- und tiermedizinischen Industrie, der Landwirtschaft, der Lebensmittelindustrie sowie der Abfallbehandlung.
Die Herstellung von rekombinantem Protein erfordert die Verwendung eines Expressionssystems. Als exprimierende Zellsysteme für die Herstellung rekombinanter DNA können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen verwendet werden. Während bakterielle Zellen aufgrund von Faktoren wie geringe Kosten, leichte Skalierbarkeit und einfache Medienbedingungen am häufigsten für die Proteinexpression verwendet werden, sind auch Säugetier-, Hefe-, Algen-, Insekten- und zellfreie Systeme etablierte Alternativen. Der Proteintyp, die funktionelle Aktivität sowie die angestrebte Ausbeute des exprimierten Proteins beeinflussen die Auswahl des für die Proteinexpression verwendeten Zellsystems.
Um rekombinantes Protein zu exprimieren, muss eine bestimmte Zelle mit einem DNA-Vektor transfiziert werden, welcher die Vorlage der rekombinanten DNA enthält. Die mit der Matrize transfizierten Zellen werden dann kultiviert. Als Folge des zellulären Mechanismus transkribieren und übersetzen die Zellen das spezifische Protein und produzieren so das rekombinante Protein.
Da die exprimierten Proteine in der zellulären Matrix eingeschlossen sind, muss die Zelle lysiert werden (Lyse = Aufbrechen der Zellwände und Zellaufschluss), um die Proteine freizusetzen. In einem anschließenden Reinigungsschritt wird das Protein abgetrennt und gereinigt.
Im Jahr 1982 wurde rekombinantes Humaninsulin als erstes rekombinante Protein in der medizinischen Behandlung eingesetzt. Heute werden weltweit mehr als 170 Arten rekombinanter Proteine für medizinische Behandlungen hergestellt. Häufig verwendete rekombinante Proteine in der Medizin sind zum Beispiel rekombinante Hormone, Interferone, Interleukine, Wachstumsfaktoren, Tumor-Nekrose-Faktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Thrombolytika und Enzyme zur Behandlung schwerer Krankheiten wie Diabetes, Zwergwuchs, Myokardinfarkt, kongestive Herzinsuffizienz, Hirnschlag, Multiple Sklerose, Neutropenie, Thrombozytopenie, Anämie, Hepatitis, rheumatoide Arthritis, Asthma, Morbus Crohn und Krebstherapien. (vgl. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatur / Literaturhinweise
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter-Sonicator für die gleichzeitige Beschallung von 10 Proben, z. B. zum Aufbrechen von BL21-Zellen
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