Lyse von BL21-Zellen mittels Ultraschall
BL21-Zellen gehören zu einem E. coli-Stamm, der aufgrund seiner Fähigkeit zur hocheffizienten Proteinexpression in Forschungslaboren, in der Biotechnologie und in der industriellen Produktion weit verbreitet ist. Zellaufschluss, Lyse und Proteinextraktion mittels Ultraschall sind die gängige Methode, um die gewünschten Proteine aus dem Zellinneren von BL21-Zellen zu isolieren und zu gewinnen. Die Ultraschallbehandlung schließt die Zelle vollständig auf und setzt alle eingeschlossenen Proteine frei, sodass 100% des Proteins verfügbar werden.
BL21-Zellen für die Proteinexpression
BL21 ist ein chemisch kompetenter E. coli-Bakterienstamm, der sich für die Transformation und eine hohe Proteinexpression mithilfe eines T7-RNA-Polymerase-IPTG-Induktionssystems eignet. BL21-Zellen ermöglichen die hocheffiziente Proteinexpression jedes Gens, das unter der Kontrolle eines T7-Promotors steht. Der E. coli-Stamm BL21(DE3) ist ein auf T7-RNA-Polymerase basierender Stamm zur Proteinproduktion, der mit T7-Promotor-basierten Expressionsvektoren kombiniert wird und in Laboren und in der Industrie häufig zur Herstellung rekombinanter Proteine eingesetzt wird. In BL21(DE3) wird die Expression des Gens, das für das rekombinante Protein kodiert, durch die chromosomal kodierte T7-RNA-Polymerase (T7 RNAP) transkribiert, die achtmal schneller transkribiert als die herkömmliche E. coli-RNAP. Dadurch ist der Stamm BL21(DE3) hocheffizient und zählt zu den bevorzugten Zellsystemen für die Proteinexpression.
Protokoll für die Ultraschalllyse und Proteinextraktion aus BL21-Zellen
Die Zelllyse von BL21-Zellen erfolgt meist durch Ultraschallbehandlung in Kombination mit Natriumlauroylsarcosinat (auch als Sarkosyl bekannt) als Lysepuffer. Die Vorteile des Zellaufschlusses und der Proteinextraktion mittels Ultraschall liegen in der Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit sowie der einfachen, sicheren und schnellen Bedienung der Ultraschallgeräte. Das folgende Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung für die Ultraschalllyse von BL21-Zellen:
- Zur Entfernung der Chaperon-Proteine wurden BL21-Bakterienpellets in 50 ml eiskaltem Natrium-Tris-EDTA-Puffer (STE) resuspendiert (bestehend aus 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, ergänzt durch 100 mM PMSF).
- Anschließend werden 500 ul Lysozym (10 mg/ml) zugegeben und die Zellen für 15 min auf Eis inkubiert.
- Danach werden 500 ul DTT und 7 ml Sarkosyl (10% (w/v), angesetzt in STE-Puffer) zugegeben.
- Alle Reinigungspuffer müssen unbedingt eiskalt gehalten werden, und die Proben müssen durchgehend auf Eis bleiben. Alle Reinigungsschritte sollten nach Möglichkeit im Kühlraum durchgeführt werden.
- Für die Ultraschalllyse und Proteinextraktion werden die Proben im VialTweeter-Mehrproben-Ultraschallgerät für 4 x 30 sec bei 100% Amplitude mit einer Pause von 2 min zwischen den einzelnen Beschallungen beschallt. Alternativ kann ein Ultraschallhomogenisator mit Sonotrode und Mikrospitze, beispielsweise der UP200Ht mit S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. Pause zwischen den Ultraschallzyklen, 80% Amplitude), verwendet werden.
- Für weitere Reinigungsschritte müssen die Proben auf Eis gehalten oder alternativ bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C gelagert werden.
Ultraschall-Zellaufschlussgerät UP200St mit Mikrospitze S26d2 für die Lyse und Proteinextraktion
Ultraschalllyse unter präziser Temperaturkontrolle
Eine präzise und zuverlässige Temperaturkontrolle ist beim Umgang mit biologischen Proben entscheidend. Hohe Temperaturen lösen einen thermisch induzierten Proteinabbau in den Proben aus.
Wie alle mechanischen Verfahren zur Probenvorbereitung erzeugt auch die Beschallung Wärme. Bei Verwendung des VialTweeter lässt sich die Temperatur der Proben jedoch gut kontrollieren. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben zu überwachen und zu kontrollieren, während Sie diese mit dem VialTweeter und dem VialPress für die Analyse vorbereiten.
- Überwachung der Probentemperatur: Der Ultraschallprozessor UP200St, der den VialTweeter antreibt, ist mit einer intelligenten Software und einem steckbaren Temperatursensor ausgestattet. Schließen Sie den Temperatursensor an den UP200St an und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touchdisplay können Sie im Menü des UP200St einen bestimmten Temperaturbereich für die Beschallung Ihrer Proben einstellen. Das Ultraschallgerät stoppt automatisch, sobald die maximale Temperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den unteren Wert der eingestellten Temperatur ∆ gesunken ist. Anschließend beginnt die Beschallung automatisch erneut. Diese intelligente Funktion verhindert einen wärmebedingten Abbau.
- Der VialTweeter-Block kann vorgekühlt werden. Legen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühl- oder Gefrierschrank, um den Titanblock vorzukühlen und so den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Nach Möglichkeit kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
- Verwenden Sie Trockeneis zur Kühlung während der Beschallung. Füllen Sie eine flache Schale mit Trockeneis und stellen Sie den VialTweeter auf das Eis, damit die Wärme schnell abgeführt werden kann.
Kunden weltweit verwenden den VialTweeter und den VialPress für ihre tägliche Probenvorbereitung in biologischen, biochemischen, medizinischen und klinischen Laboren. Die intelligente Software und die Temperaturregelung des UP200St-Prozessors kontrollieren die Temperatur zuverlässig und verhindern einen wärmebedingten Abbau der Proben. Die Probenvorbereitung mittels Ultraschall mit dem VialTweeter und dem VialPress liefert äußerst zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse!
Finden Sie das optimale Ultraschall-Zellaufschlussgerät für Ihre Lyseanwendung
Hielscher Ultrasonics ist ein Hersteller mit langjähriger Erfahrung in der Herstellung leistungsstarker Ultraschall-Zellaufschlussgeräte und Ultraschallhomogenisatoren für den Einsatz im Labor, als Tischgeräte und im industriellen Maßstab. Die Größe Ihrer Bakterienzellkultur, Ihr Forschungs- oder Produktionsziel und das pro Stunde oder Tag zu verarbeitende Zellvolumen sind wesentliche Faktoren bei der Auswahl des passenden Ultraschall-Zellaufschlussgeräts für Ihre Anwendung.
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Lösungen für die gleichzeitige Beschallung mehrerer Proben (bis zu 10 Probengefäße mit dem VialTweeter) und für die Beschallung zahlreicher Proben im Hochdurchsatz (d. h. Mikrotiterplatten / ELISA-Platten mit dem UIP400MTP). Das Angebot reicht zudem vom klassischen Labor-Ultraschallgerät mit Sonotrode in verschiedenen Leistungsstufen von 50 bis 400 Watt bis hin zu Ultraschallprozessoren für den industriellen Einsatz mit bis zu 16.000 Watt pro Gerät für den kommerziellen Zellaufschluss und die Proteinextraktion in der Großproduktion. Alle Ultraschallgeräte von Hielscher sind für den 24/7/365-Betrieb unter Volllast ausgelegt. Robustheit und Zuverlässigkeit sind zentrale Eigenschaften unserer Ultraschallgeräte.
Alle digitalen Ultraschallhomogenisatoren sind mit intelligenter Software, einem Farb-Touchdisplay und automatischer Datenprotokollierung ausgestattet. Dadurch wird das Ultraschallgerät zu einem komfortablen Arbeitsmittel in Laboren und Produktionsstätten.
Teilen Sie uns mit, welche Zellarten Sie in welchem Volumen, wie häufig und mit welchem Ziel verarbeiten müssen. Wir empfehlen Ihnen das am besten geeignete Ultraschall-Zellaufschlussgerät für Ihre Prozessanforderungen.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme, von kompakten Handhomogenisatoren und Mehrproben-Ultraschallgeräten bis hin zu industriellen Ultraschallprozessoren für kommerzielle Anwendungen:
| Chargenvolumen | Volumenstrom | Empfohlene Geräte |
|---|---|---|
| 96-Well-Platten / Mikrotiterplatten | n.a. | UIP400MTP |
| 10 Probengefäße à 0,5 bis 1,5 mL | n.a. | VialTweeter am UP200St |
| 0,01 bis 250 mL | 5 bis 100 mL/min | UP50H |
| 0,01 bis 500 mL | 10 bis 200 mL/min | UP100H |
| 10 bis 2000 mL | 20 bis 400 mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 bis 20 L | 0,2 bis 4 L/min | UIP2000hdT |
| 10 bis 100 L | 2 bis 10 L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 bis 100 L/min | UIP16000 |
| n.a. | höher | Verbund aus UIP16000 |
Kontaktieren Sie uns! / Fragen Sie uns!
UIP400MTP-Ultraschallgerät für Platten für den Zellaufschluss mit hohem Probendurchsatz in 96-Well-Platten
Ultraschallgerät UP200Ht mit 2 mm Mikrospitze S26d2 für die Beschallung kleiner Proben
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Wissenswertes
Escherichia coli-Bakterien
Escherichia coli ist eine nicht sporenbildende, gramnegative Bakterienart, die durch ihre gerade Stäbchenform gekennzeichnet ist. E. coli-Bakterien kommen in der Umwelt, in Lebensmitteln und im Darm von Menschen und Tieren vor. E. coli ist in der Regel peritrich begeißelt und dadurch beweglich, es gibt jedoch auch unbewegliche Typen. E. coli sind sogenannte fakultativ anaerobe, chemoorganotrophe Organismen. Das bedeutet, dass sie sowohl zu einem respiratorischen als auch zu einem fermentativen Stoffwechsel fähig sind. Die meisten E. coli-Typen sind harmlos und erfüllen nützliche Funktionen im Körper, z. B. die Unterdrückung des Wachstums schädlicher Bakterienarten, die Synthese von Vitaminen usw.
Escherichia coli-Bakterienzellen des sogenannten B-Typs bilden eine besondere Kategorie von E. coli-Stämmen, die in der Forschung häufig zur Untersuchung von Mechanismen wie der Empfindlichkeit gegenüber Bakteriophagen oder von Restriktions-Modifikationssystemen eingesetzt werden. Darüber hinaus werden E. coli-Bakterien als zuverlässiges Zellsystem für die Proteinexpression in biotechnologischen und biowissenschaftlichen Laboren geschätzt. Beispielsweise wird E. coli zur Synthese von Verbindungen wie Proteinen und Oligosacchariden im industriellen Maßstab eingesetzt. Aufgrund spezifischer Eigenschaften wie Proteasemangel, geringer Acetatproduktion bei hohem Glucosegehalt und erhöhter Permeabilität sind E. coli-B-Zellen die am häufigsten verwendeten Wirtszellen für die Herstellung gentechnisch erzeugter Proteine.
Rekombinantes Protein
Rekombinante Proteine (rProt) gewinnen in zahlreichen Bereichen erheblich an Bedeutung, darunter in der chemischen Produktion, der Pharma- und Kosmetikindustrie, der Human- und Veterinärmedizin, der Landwirtschaft, der Lebensmittelindustrie sowie der Abfallbehandlung.
Die Herstellung rekombinanter Proteine erfordert den Einsatz eines Expressionssystems. Als exprimierende Zellsysteme für die Herstellung rekombinanter DNA können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen verwendet werden. Während Bakterienzellen aufgrund von Faktoren wie niedrigen Kosten, einfacher Skalierbarkeit und einfachen Anforderungen an die Kulturmedien am häufigsten für die Proteinexpression eingesetzt werden, sind Systeme auf Basis von Säugetierzellen, Hefen, Algen oder Insekten sowie zellfreie Systeme etablierte Alternativen. Die Art des Proteins, seine funktionelle Aktivität sowie die erforderliche Ausbeute an exprimiertem Protein beeinflussen die Auswahl des für die Proteinexpression eingesetzten Zellsystems.
Zur Expression eines rekombinanten Proteins muss eine bestimmte Zelle mit einem DNA-Vektor transfiziert werden, der die Matrize der rekombinanten DNA enthält. Die mit der Matrize transfizierten Zellen werden anschließend kultiviert. Infolge des zellulären Mechanismus transkribieren und translatieren die Zellen das gewünschte Protein und produzieren dadurch das Zielprotein.
Da die exprimierten Proteine in der Zellmatrix eingeschlossen sind, muss die Zelle lysiert (aufgeschlossen und aufgebrochen) werden, um die Proteine freizusetzen. In einem anschließenden Reinigungsschritt wird das Protein abgetrennt und gereinigt.
Das erste rekombinante Protein, das therapeutisch eingesetzt wurde, war rekombinantes Humaninsulin im Jahr 1982. Heute werden weltweit mehr als 170 Arten rekombinanter Proteine für medizinische Behandlungen hergestellt. Zu den häufig in der Medizin eingesetzten rekombinanten Proteinen zählen beispielsweise rekombinante Hormone, Interferone, Interleukine, Wachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, thrombolytische Arzneimittel und Enzyme zur Behandlung schwerwiegender Erkrankungen wie Diabetes, Kleinwuchs, Myokardinfarkt, kongestiver Herzinsuffizienz, Schlaganfall, multipler Sklerose, Neutropenie, Thrombozytopenie, Anämie, Hepatitis, rheumatoider Arthritis, Asthma und Morbus Crohn sowie zur Krebstherapie. (vgl. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatur / Quellen
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter-Ultraschallgerät für die gleichzeitige Beschallung von 10 Proben, z. B. zum Aufschluss von BL21-Zellen
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