DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall für Next-Generation-Sequencing
Next-Generation-Sequencing (NGS) erfordert eine zuverlässige Scherung und Fragmentierung genomischer DNA, um genomische DNA-Stränge zu sequenzieren und Genombibliotheken zu erstellen. Die kontrollierte Fragmentierung von DNA in DNA-Fragmente ist ein wesentlicher Schritt der Probenvorbereitung, der vor der DNA-Sequenzierung erforderlich ist. Die Ultraschallbehandlung hat sich als effiziente und zuverlässige Technik zur Erzeugung von DNA-Fragmenten bestimmter Länge bewährt. Protokolle zur DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall liefern reproduzierbare Fragmentierungsergebnisse. Die Ultraschallgeräte von Hielscher können ein breites Spektrum an Größenverteilungen genomischer DNA-Fragmente erzeugen, die über die Betriebsparameter präzise steuerbar sind. Da die Systeme von Hielscher zur DNA-Scherung mittels Ultraschall für einzelne und mehrere Probengefäße sowie für Mikroplatten verfügbar sind, wird die Probenvorbereitung hocheffizient.
Das Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP für die Probenvorbereitung mit hohem Probendurchsatz beschallt Proben in Multiwell-Platten, Mikrotiterplatten und 96-Well-Platten gleichmäßig
- wiederholbare / reproduzierbare Ergebnisse
- präzise einstellbar zur Erzeugung einer bestimmten Fragmentlänge
- schnelle Verarbeitung
- gleichbleibende Ergebnisse der DNA-Fragmentierung
- Geräte für beliebige Probenvolumina (z. B. mehrere Probengefäße oder Mikroplatten)
- hoher Probendurchsatz
- präzise Temperaturregelung
- einfache, benutzerfreundliche Bedienung
Next-Generation-Sequencing: DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall zur Bibliotheksvorbereitung
Zur Durchführung einer Next-Generation-Sequenzierung müssen die drei grundlegenden Schritte (1) Bibliotheksvorbereitung, (2) Sequenzierung und (3) Datenanalyse durchgeführt werden. Während der Bibliotheksvorbereitung wird die DNA fragmentiert. Anschließend werden die Fragmentenden durch Zugabe einer einzelnen Adeninbase repariert (geglättet), und die Zielfragmente werden in doppelsträngige DNA umgewandelt. Abschließend werden sogenannte Adapter durch Ligation, PCR oder Tagmentierung angefügt, sodass das endgültige DNA-Produkt der Bibliothek für die Sequenzierung quantifiziert werden kann.
DNA-Fragmentierung durch Beschallung: Insbesondere beim Einsatz von Short-Read-Sequenzierungstechnologien wie Illumina, die längere DNA-Fragmente nicht ohne Weiteres lesen können, müssen die DNA-Stränge auf eine bestimmte Größe fragmentiert werden. Dies lässt sich durch Ultraschallbehandlung zuverlässig erreichen.
Die Ultraschallbehandlung kann zuverlässig zur Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin eingesetzt werden.
Next-Generation-Sequencing – Bibliotheksvorbereitung
Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall wird häufig bei der Vorbereitung von DNA-Sequenzierungsbibliotheken für Next-Generation-Sequencing-Plattformen (NGS) eingesetzt. Mit dieser Technik werden DNA-Moleküle in kleinere Fragmente eines gewünschten Größenbereichs zerlegt, was die nachfolgenden Schritte der Bibliotheksvorbereitung erleichtert. Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall ist typischerweise während der Bibliotheksvorbereitung in NGS-Arbeitsabläufen erforderlich, um genomische DNA in kleinere Stücke zu fragmentieren, die für die nachfolgende Verarbeitung und Sequenzierung geeignet sind. Sie spielt eine entscheidende Rolle für den Erfolg des Sequenzierungsexperiments, indem sie DNA-Fragmente in einem Größenbereich erzeugt, der für die jeweils verwendete Sequenzierungsplattform geeignet ist.
Elektrophoretische Analysen genomischer DNA von E. coli EDL933 nach 0 – 15 min Ultraschallbehandlung. L kennzeichnet die DNA-Leiter. (Basselet et al. 2008)
Next-Generation-Sequencing – Prozessschritte:
- DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall: Vor der Erstellung der Bibliothek wird die genomische DNA in kleinere, leichter handhabbare Stücke fragmentiert. Bei der Ultraschallfragmentierung werden hochfrequente Schallwellen eingesetzt, um die DNA-Moleküle durch Scherung in Fragmente des gewünschten Größenbereichs zu zerlegen. Dieser Schritt ist entscheidend, da er dazu beiträgt, dass die später erzeugten Sequenzierungsreads eine für die verwendete Sequenzierungsplattform geeignete Länge aufweisen. Der Größenbereich der Fragmente kann an die spezifischen Anforderungen des Sequenzierungsexperiments angepasst werden.
- Klonale Amplifikation mittels PCR: Nach der Ultraschallfragmentierung werden die DNA-Fragmente einer Endreparatur, Adapterligation und PCR-Amplifikation unterzogen, um die endgültigen DNA-Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen. Diese Schritte bereiten die fragmentierten DNA-Moleküle auf die Sequenzierung vor, indem Adaptersequenzen angefügt werden, die für die Bindung an die Sequenzierungsplattform notwendig sind und Primerbindungsstellen für die PCR-Amplifikation bereitstellen.
- DNA-Sequenzierung durch Synthese: Sobald die Sequenzierungsbibliotheken vorbereitet sind, beginnt die DNA-Sequenzierung durch Synthese (SBS). Während der SBS wird die DNA-Sequenz durch die schrittweise Zugabe von Nukleotiden zum komplementären Strang bestimmt. Dieser Schritt umfasst zyklische Reaktionen des Nukleotideinbaus, der Bildaufnahme und der Abspaltung. Dadurch lässt sich die DNA-Sequenz anhand der Fluoreszenzsignale bestimmen, die von den eingebauten Nukleotiden ausgesendet werden.
- Massiv parallele Sequenzierung: Im letzten Schritt werden die räumlich getrennten, amplifizierten DNA-Matrizen gleichzeitig in massiv paralleler Weise sequenziert. Dieser Hochdurchsatz-Sequenzierungsansatz ermöglicht die Erzeugung von Millionen bis Milliarden Sequenzierungsreads in einem einzigen Sequenzierungslauf und damit eine effiziente und schnelle Bestimmung von DNA-Sequenzen.
Wie funktioniert die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall?
Die Beschallung, auch als akustische Probenverarbeitung bezeichnet, ist eine weit verbreitete Methode zur Fragmentierung von DNA. Für die DNA-Scherung mittels Ultraschall werden die Proben unter kontrollierten Bedingungen Ultraschallwellen ausgesetzt. Das Funktionsprinzip der DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall beruht auf den durch die Ultraschallwellen erzeugten Schwingungen und der Kavitation. Die aus der ultraschallinduzierten (akustischen) Kavitation resultierenden Scherkräfte zerlegen hochmolekulare DNA-Moleküle. Die Beschallungseinstellungen wie Intensität (Amplitude, Dauer), Pulsationsmodus und Temperatur ermöglichen eine präzise DNA-Fragmentierung auf eine bestimmte gewünschte Länge der DNA-Fragmente. Während DNA durch Ultraschallbehandlung häufig auf 100 bis 600 bp verkürzt wird, lassen sich bei milderen Ultraschallbedingungen längere DNA-Fragmente von bis zu 1300 bp gewinnen.
DNA-Scherung mittels Ultraschall bei ChIP – Chromatin-Immunpräzipitation
Adaptiert nach Jkwchui unter CC-BY-SA.03
Temperaturregelung zur Vermeidung von DNA-Abbau
Die doppelsträngige Molekülstruktur der DNA ist gegenüber erhöhten Temperaturen sehr empfindlich, sodass eine genaue Temperaturregelung während der Probenvorbereitung ein entscheidender Faktor für zuverlässige Analyseergebnisse ist.
Ob Sie die Sonotroden-Ultraschallgeräte von Hielscher, den VialTweeter oder den UIP400MTP verwenden – ein steckbarer Temperatursensor und die intelligente Gerätesoftware gewährleisten eine kontinuierliche Temperaturüberwachung und -regelung. Um die Temperatur innerhalb eines bestimmten Bereichs zu halten, können Sie eine obere und eine untere Temperaturgrenze einstellen. Das Ultraschallgerät pausiert daher, sobald diese Temperaturgrenze überschritten wird, und setzt die Beschallung automatisch fort, wenn die Temperatur um ein eingestelltes ∆T gesunken ist.
Die ausgereifte Software der Ultraschallgeräte von Hielscher gewährleistet die zuverlässige Einhaltung idealer Bedingungen für die Probenbehandlung.
DNA-Fragmentierung im Hochdurchsatz mit dem Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP
Die Probenzahlen in den Biowissenschaften sind im letzten Jahrzehnt erheblich gestiegen. Dies bedeutet, dass sehr große Probenzahlen (z. B. 384, 1536 oder 3456 Wells pro Mikroplatte) während der Probenvorbereitung und Analyse unter durchgehend gleichen Bedingungen verarbeitet werden müssen, um vergleichbare und valide Ergebnisse zu erhalten. Mit dem UIP400MTP folgt Hielscher Ultrasonics dem Trend zur Verarbeitung großer Probenzahlen. Der UIP400MTP ist ein Ultraschallgerät zur Probenvorbereitung mit Mikroplatten. Der UIP400MTP kann Platten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 oder 3456 Wells verarbeiten. Je nach Mikroplattentyp kann jedes Well typischerweise Probenvolumina von einigen zehn Nanolitern bis zu mehreren Millilitern aufnehmen. Der in der biowissenschaftlichen Forschung weit verbreitete UIP400MTP wird sehr häufig zur Probenvorbereitung vor Assays wie ELISA (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) oder PCR, vor der Proteinanalytik sowie zur Chromatinvorbereitung vor CHiP und CHiP-seq, zur Identifizierung von Histonmodifikationen und für weitere analytische Behandlungen (z. B. Gelelektrophorese, Massenspektrometrie) eingesetzt.
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Der VialTweeter zur Probenvorbereitung von bis zu 10 Probengefäßen
Der VialTweeter ist ein weit verbreitetes Labor-Ultraschallgerät VialTweeter, das die effektive und komfortable gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 Probengefäßen ermöglicht. Da die Probengefäße und Reagenzgläser (z. B. Eppendorf-Gefäße, Kryogefäße, Zentrifugenröhrchen) indirekt beschallt werden, wird jegliche Kreuzkontamination vermieden. Da jede Probe mit derselben Ultraschallintensität behandelt wird, sind alle Beschallungsergebnisse homogen und reproduzierbar. Der VialTweeter bietet alle intelligenten Funktionen unserer anderen digitalen Geräte (z. B. intelligentes Menü, programmierbare Einstellungen, Temperaturregelung, Fernsteuerung usw.), sodass höchster Bedienkomfort gewährleistet ist.
Mehrfingersonotroden für Mikrotiterplatten
Mehrfingersonotroden mit 4 oder 8 Fingern sind für die Sonotroden-Ultraschallhomogenisatoren UP200Ht und UP200St erhältlich und bieten eine komfortable Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig unter denselben Bedingungen zu beschallen. Die Sonotrode MTP-24-8-96 beispielsweise ist eine Achtfingersonotrode, die sich ideal für die Integration in automatisierte Systeme oder die effiziente manuelle Probenvorbereitung in den Wells von Multiwell-Platten eignet. Die Mehrfingersonotrode ist ideal für die Automatisierung in Laboren, in denen überwiegend Bechergläser und Reagenzgläser mit einer Standard-Ultraschallsonotrode behandelt werden. Die Mehrfinger- und Standardsonotroden lassen sich innerhalb weniger Minuten schnell gegeneinander austauschen, wodurch das Ultraschallgerät mit einer einzelnen Sonotrode zu einem Ultraschall-Zellaufschlussgerät mit mehreren Sonotroden wird.
Ultraschallgeräte von Hielscher zur DNA-Fragmentierung
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Plattformen zur Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin. Dazu gehören Ultraschallsonotroden, Lösungen zur indirekten Beschallung für die gleichzeitige Probenvorbereitung in mehreren Röhrchen oder Multiwell-Platten (z. B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten), Sonoreaktoren und Ultraschall-CupHorns. Alle Plattformen zur DNA-Scherung werden von frequenzabgestimmten Hochleistungs-Ultraschallprozessoren angetrieben, die präzise steuerbar sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.
Ultraschallprozessoren für jede Probenzahl und jedes Probenvolumen
Mit den Multiproben-Ultraschallgeräten von Hielscher, dem VialTweeter (für bis zu 10 Reagenzgläser) und dem UIP400MTP (für Mikroplatten / Multiwell-Platten), lässt sich die Probenverarbeitungszeit durch intensive und präzise steuerbare Ultraschallbehandlung einfach verkürzen, während die gewünschte Größenverteilung und Ausbeute der DNA-Fragmente erzielt wird. Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall macht die Probenvorbereitung effizient, zuverlässig und skalierbar. Durch den Einsatz kontinuierlich kontrollierten Ultraschalls lassen sich Protokolle linear von einer auf zahlreiche Proben skalieren.
Sonotroden-Ultraschallgeräte mit einem bis fünf Fingern sind ideal für die Vorbereitung kleinerer Probenzahlen. Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind in verschiedenen Größen erhältlich, sodass wir Ihnen das ideale Gerät für Ihre Anwendung und Anforderungen empfehlen können.
Präzise Prozesssteuerung
Präzise steuerbare Beschallungseinstellungen sind entscheidend, da eine übermäßige Beschallung DNA, RNA und Chromatin zerstören kann, während eine unzureichende Ultraschallscherung zu überlangen DNA- und Chromatinfragmenten führt. Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher lassen sich einfach auf präzise Beschallungsparameter einstellen. Spezifische Beschallungseinstellungen können auch als programmierte Einstellung gespeichert werden, um dasselbe Verfahren schnell zu wiederholen.
Alle Beschallungsdurchläufe werden automatisch protokolliert und als CSV-Datei auf einer integrierten SD-Karte gespeichert. Dies ermöglicht eine genaue Dokumentation der durchgeführten Versuche und eine einfache Überprüfung der Beschallungsläufe.
Über die Browser-Fernsteuerung lassen sich alle digitalen Ultraschallgeräte mit jedem gängigen Browser bedienen und überwachen. Die Installation zusätzlicher Software ist nicht erforderlich, da eine LAN-Verbindung eine sehr einfache Plug-and-Play-Einrichtung ermöglicht.
Höchste Benutzerfreundlichkeit bei der Probenvorbereitung mittels Ultraschall
Alle Ultraschallgeräte von Hielscher sind darauf ausgelegt, Hochleistungsultraschall bereitzustellen und dabei stets sehr benutzerfreundlich und einfach zu bedienen zu sein. Alle Einstellungen sind in einem übersichtlichen Menü klar strukturiert, auf das sich über ein Farb-Touchdisplay oder die Browser-Fernsteuerung einfach zugreifen lässt. Die intelligente Software mit programmierbaren Einstellungen und automatischer Datenaufzeichnung gewährleistet optimale Beschallungseinstellungen für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Die übersichtliche und einfach zu bedienende Menüführung macht die Ultraschallgeräte von Hielscher zu benutzerfreundlichen und effizienten Geräten.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Labor-Ultraschallgeräte, die sich ideal für Aufgaben der Probenvorbereitung wie DNA- und RNA-Fragmentierung, Zelllyse sowie Proteinextraktion eignen:
| Gerät | Leistung [W] | Typ | Volumen [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | für Mikroplatten | 6 – 3456 Wells | VialTweeter | 200 | für bis zu 10 Probengefäße, zusätzlich mit Anklemmmöglichkeit | 0,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | mit Sonotrode | 0,01 – 250 |
| UP100H | 100 | mit Sonotrode | 0,01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | mit Sonotrode | 0,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | mit Sonotrode | 0,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | mit Sonotrode | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, Sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | kontaminationsfreie Durchflusszelle |
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Die Ultraschalleinheit zur Vorbereitung mehrerer Proben VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 Probengefäßen. Mit der Klemmvorrichtung VialPress können bis zu 4 zusätzliche Röhrchen zur intensiven Beschallung an die Vorderseite gepresst werden.
Die Sonotrode MTP-24-8-96 besitzt acht Ultraschallspitzen zur Beschallung der Wells von Mikrotiterplatten.
Literatur / Referenzen
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Wissenswertes
Was ist Next-Generation-Sequencing?
Next-Generation-Sequencing, auch Next Gen Sequencing (NGS), Hochdurchsatzsequenzierung oder Sequenzierung der zweiten Generation genannt, bezeichnet den Ansatz der massiv parallelen Sequenzierung, bei dem pro Lauf sehr große (massive) DNA-Mengen aus Millionen von Fragmenten gleichzeitig parallel sequenziert werden.
Zur Durchführung einer Next-Generation-Sequenzierung sind die drei grundlegenden Schritte
- Bibliotheksvorbereitung,
- Sequenzierung und
- Datenanalyse
erforderlich.
Während der Bibliotheksvorbereitung müssen DNA-Stränge in DNA-Fragmente bestimmter Länge fragmentiert werden. Die Beschallung gehört zu den bevorzugten Techniken zur DNA-Fragmentierung.
Bei der DNA-Sequenzierung wird die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA – die sogenannte Nukleinsäuresequenz – bestimmt. Die Nukleinsäuresequenz setzt sich aus vier Nukleotidbasen – Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin – zusammen, die Informationen codieren.
Next-Generation-Sequencing treibt die Forschung in den Biowissenschaften und der personalisierten Medizin voran, da DNA- und RNA-Sequenzierung in der Genomforschung, Krebsforschung, Erforschung seltener und komplexer Erkrankungen, mikrobiellen Forschung, Agrigenomik und vielen weiteren Forschungsbereichen intensiv eingesetzt werden.
Next-Generation-Sequencing im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung
Während sich mit Next-Generation-Sequencing (NGS) sehr große Zahlen genomischer Proben sequenzieren lassen, kann die Sanger-Sequenzierung (auch als Kettenabbruchmethode oder Sequenzierung der ersten Generation bekannt) nur kleine Probenzahlen sequenzieren. Die Sanger-Sequenzierung sequenziert jeweils nur ein einzelnes DNA-Fragment und kann innerhalb eines einzigen Tages durchgeführt werden. Aufgrund ihrer Genauigkeit gilt die Sanger-Sequenzierung auch als Goldstandard-Technologie, mit der Ergebnisse aus der Next-Generation-Sequenzierung überprüft werden.
Die Sanger-Sequenzierung erreicht Leselängen von ungefähr 800bp (typischerweise 500–600bp bei nicht angereicherter DNA). Die längeren Leselängen der Sanger-Sequenzierung bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Sequenzierungsmethoden, insbesondere bei der Sequenzierung repetitiver Genomregionen. Die mit Short-Read-Sequenzdaten verbundene Herausforderung ist besonders bei der Sequenzierung neuer Genome (de novo) und stark umgelagerter Genomabschnitte relevant, wie sie typischerweise in Krebsgenomen oder in Chromosomenregionen mit strukturellen Variationen vorkommen. [vgl. Morozova und Marra, 2008]
DNA – Desoxyribonukleinsäure – ihre Formen und Funktionen
Jede DNA-Form besitzt einzigartige Eigenschaften und Anwendungen und trägt zu einem breiten Spektrum von Forschungsbereichen bei, darunter Onkologie, Genetik, Forensik und Evolutionsbiologie. Die Ultraschallgeräte von Hielscher sind eine hocheffiziente und zuverlässige Lösung zur Isolierung und Fragmentierung von DNA und RNA für Ihre Analysezwecke. In der folgenden Liste erläutern wir Ihnen die spezifischen DNA-Formen und ordnen sie nach ihrem biologischen Kontext und ihren Funktionen ein:
- Genomische DNA (gDNA)
Genomische DNA (gDNA): Die Gesamtheit der DNA in einem Organismus, einschließlich sowohl codierender (Gene) als auch nicht codierender Regionen. - Extrazelluläre DNA
Zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA): DNA-Fragmente, die von Tumorzellen in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
Zellfreie DNA (cfDNA): DNA-Fragmente, die frei im Blutkreislauf zirkulieren und aus verschiedenen Geweben stammen. - Extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA): Zirkuläre DNA-Moleküle, die sich in eukaryotischen Zellen außerhalb der Chromosomen befinden.
Virale DNA: Von Viren stammende DNA, die entweder in das Wirtsgenom integriert ist oder als episomale DNA vorliegt. - Mitochondriale DNA
Mitochondriale DNA (mtDNA): DNA, die sich in den Mitochondrien befindet, mütterlich vererbt wird und an der Energieproduktion beteiligt ist. - Plasmid-DNA
Plasmid-DNA: Kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die sich unabhängig von der chromosomalen DNA replizieren, häufig in Bakterien vorkommen und in der Gentechnik eingesetzt werden. - Kern-DNA
Kern-DNA (nDNA): DNA im Zellkern eukaryotischer Zellen, die den Großteil des genetischen Materials eines Organismus ausmacht. - Einzelzell-DNA
Einzelzell-DNA (scDNA): DNA, die aus einer einzelnen Zelle extrahiert wird und für detaillierte Genomanalysen auf Einzelzellebene eingesetzt wird. - Rekombinante DNA
Rekombinante DNA (rDNA): DNA-Moleküle, die durch Labormethoden der genetischen Rekombination gebildet werden, um genetisches Material aus mehreren Quellen zusammenzuführen. - Spezialisierte Formen
Umwelt-DNA (eDNA): DNA, die aus Umweltproben (Boden, Wasser) gewonnen wird, ohne die Ursprungsorganismen zu isolieren.
Antike DNA (aDNA): DNA, die aus alten Proben extrahiert wird und Einblicke in die Evolutionsbiologie und frühere Populationen ermöglicht. - Chromosomale DNA
Chromosomale DNA: DNA, die die Chromosomen im Zellkern bildet und sowohl codierende als auch nicht codierende Regionen umfasst. - Virale und synthetische Formen
Virale DNA: Von Viren stammende DNA, die entweder in Wirtsgenome integriert sein oder als eigenständige Einheiten vorliegen kann.
Synthetische DNA: Künstlich synthetisierte DNA-Sequenzen, die durch chemische Prozesse erzeugt werden und häufig in der Forschung und Biotechnologie eingesetzt werden.
Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren vom Laborgerät bis zum Industriegerät.