DNA-Fragmentierung für die Next-Generation-Sequenzierung

Die Probenvorbereitung für Next Generation Sequencing (NGS) erfordert eine zuverlässige Scherung und Fragmentierung der genomischen DNA, um genomische DNA-Stränge zu sequenzieren und Genombibliotheken zu erstellen. Die kontrollierte Fragmentierung der DNA in DNA-Fragmente ist ein wesentlicher Schritt der Probenvorbereitung, der vor der Sequenzierung der DNA erforderlich ist. Die Ultraschallfragmentierung hat sich als effiziente und zuverlässige Technik für die Fragmentierung von DNA einer bestimmter Länge erwiesen. Protokolle zur DNA-Fragmentierung mit Ultraschall erzielen reproduzierbare Fragmentierungsergebnisse. Hielscher Ultraschallgeräte sind in der Lage, eine breite Palette genomischer DNA-Fragmentgrößen zu erzeugen. Die gewünschte DNA-Länge kann über die Ultraschallparameter präzise gesteuert sindwerden Da Hielscher Ultraschallgeräte sowohl für die DNA-Fragmentierung für Einzelproben als auch simultane mehrfache Probenvorbereitung wie auch für Mikrotiterplatten erhältlich sind, ist eine effiziente Probenvorbereitung einzelner wie auch sehr vieler Proben effizient möglich.

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Ultrasonic DNA fragmentation is frequently used as sample preparation step in Next Generation Sequencing (NGS)

Elektrophoretische Analyse genomischer DNA von E. coli EDL933, die mit 0 - 15 min Ultraschall behandelt wurden. L gibt die DNA-Leiter an. (Basselet et al. 2008)

Vorteile der DNA-Fragmentierung mit Ultraschall

  • wiederholbare / reproduzierbare Ergebnisse
  • präzise einstellbar, um eine bestimmte Fragmentlänge zu erhalten
  • Schnelle Verarbeitung
  • konsistente DNA-Fragmentierungsergebnisse
  • Geräte für jede beliebige Probenanzahl (z.B. mehrere Vials oder Mikrotiterplatten)
  • hoher Durchsatz
  • präzise Temperaturkontrolle
  • einfache, benutzerfreundliche Bedienung

Next-Gen Sequenzierung: DNA-Fragmentierung mit Ultraschall für die Erstellung von Genbibliotheken

Um eine Next-Generation-Sequenzierung durchzuführen, müssen folgende drei Schritte durchgeführt werden: (1) Bibliotheksvorbereitung, (2) Sequenzierung und (3) Datenanalyse . Bei der Bibliotheksvorbereitung wird die DNA fragmentiert, dann werden die Fragmentenden durch Hinzufügen einer einzelnen Adenin-Base repariert und die Fragmente in doppelsträngige DNA umgewandelt. Schließlich werden sogenannte Adapter durch Ligation, PCR oder Tagmentierung angehängt, so dass das DNA-Endprodukt der Bibliothek für die Sequenzierung quantifiziert werden kann.
DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall: Insbesondere bei Short-Read-Sequenzierungstechnologien wie Illumina, welche längere DNA-Fragmente nicht ohne weiteres lesen können, müssen die DNA-Bestände auf eine bestimmte Größe fragmentiert werden. Zur Fragmentierung der DNA-Stränge wird Ultraschall als zuverlässige Technologie eingesetzt.
Die Ultraschallbehandlung wird erfolgreich zur Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin eingesetzt.

Wie funktioniert die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall?

Die Beschallung, auch bekannt als Sonifizierung oder akustische Probenverarbeitung, ist eine weit verbreitete Methode zur Fragmentierung von DNA. Beim Scheren der DNA mit Ultraschall werden die Proben unter kontrollierten Bedingungen intensiven Ultraschallwellen ausgesetzt. Das Funktionsprinzip der ultraschall-gestützten DNA-Fragmentierung basiert auf den durch die Ultraschallwellen erzeugten Vibrationen und Kavitation. Die Scherkräfte, welche durch die Ultraschallkavitation (akustische Kavitation) entstehen, brechen die DNA-Moleküle mit hohem Molekulargewicht auf. Die Einstellungen der Beschallung wie Intensität (Amplitude, Dauer), Pulsationsmodus und Temperatur ermöglichen eine präzise DNA-Fragmentierung bis zu einer bestimmten gewünschten Länge der DNA-Fragmente. Während DNA mittels Ultraschall häufig auf 100 bis 600 bp reduziert wird, können bei milderen Ultraschallbedingungen auch längere DNA-Fragmente von bis zu 1300 bp produziert werden.

Ultrasonic homogenizers are reliable for DNA shearing

Scheren der DNA mit Ultraschall für ChIP – Chromatinimmunpräzipitation
Modifizierte Version von Jkwchui gemäß CC-BY-SA.03

Temperaturkontrolle zur Verhinderung ungewollter DNA-Denaturierung

Die doppelsträngige Molekülform der DNA reagiert sehr empfindlich auf erhöhte Temperaturen und kann durch Hitze schnell zerstört werden, so dass die genaue Kontrolle der Temperatur während der Probenvorbereitung ein entscheidender Faktor für zuverlässige Analyseergebnisse ist.
Unabhängig davon ob Sie ein Hielscher Ultraschallgerät mit Sonotrode, den VialTweeter (für die simultane Beschallung mehrerer Vial) oder den UIP400MTP (für Multi-Well-Platten) einsetzen – die kontinuierliche Temperaturüberwachung und -regelung ist immer durch einen steckbaren Temperatursensor und die intelligente Gerätesoftware gewährleistet. Um die Temperatur in einem bestimmten Bereich zu halten, können Sie eine obere und untere Temperaturgrenze einstellen. Das Ultraschallgerät pausiert daraufhin, sobald diese Temperaturgrenze überschritten wird, und setzt die Beschallung automatisch fort, wenn die Temperatur wieder um ein bestimmtes ∆T gesunken ist.
Die ausgefeilte Software der Hielscher Ultraschallgeräte sorgt für die zuverlässige Einhaltung idealer Beschallungsbedingungen Ihrer biologischen Proben.

DNA-Fragmentierung im Hochdurchsatz mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multi-Well-Platten

Ultrasonic Multi-Sample Preparation Unit UIP400MTP for multi-well plate sonicationDas Probenaufkommen in den Biowissenschaften ist in den letzten zehn Jahren erheblich gestiegen. Das bedeutet, dass eine sehr hohe Anzahl von Proben (z.B. 384, 1536 oder 3456 Wells pro Mikrotiterplatte) bei der Probenvorbereitung und Analyse unter gleichbleibenden Bedingungen bearbeitet werden müssen, um vergleichbare und valide Ergebnisse zu erhalten. Mit dem UIP400MTP folgt Hielscher Ultrasonics dem Trend zur Massenprobenverarbeitung. Das UIP400MTP ist ein Ultraschallgerät für die Probenvorbereitung von Mikrotiterplatten. Der UIP400MTP kann Platten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 oder 3456 Wells bearbeiten. Je nach Mikroplattentyp kann jede Vertiefung typischerweise Probenvolumina zwischen einigen zehn Nanolitern und mehreren Millilitern aufnehmen. Der UIP400MTP wird in der biowissenschaftlichen Forschung häufig für die Probenvorbereitung vor Assays wie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder PCR (polymerase chain reaction), vor der Proteinanalytik sowie für die Chromatinvorbereitung vor CHiP und CHiP-seq, sowie vor der Identifizierung von Histonmodifikationen und anderen analytischen Behandlungen (z. B. Gelelektrophorese, Massenspektrometrie) verwendet.

Der VialTweeter für die Probenvorbereitung von bis zu 10 Vials

Komplettes VialTweeter-Set: VialTweeter-Sonotrode am Ultraschallprozessor UP200StDer VialTweeter ist ein weit verbreitetes Labor-Ultraschallgerät, das eine effektive und komfortable Beschallung von bis zu 10 Teströhrchen (z.B. Eppendorf Tubes, CryoVials, Zentrifugenröhrchen etc.) gleichzeitig ermöglicht. Da die Fläschchen und Testgefäße indirekt beschallt werden, wird jegliche Kreuzkontamination vermieden. Da jede Probe mit der gleichen Ultraschallintensität beschallt wird, sind alle Beschallungsergebnisse homogen und reproduzierbar. Der VialTweeter bietet alle intelligenten Funktionen wie all unsere anderen digitalen Geräte (z.B. intelligentes Menü, programmierbare Einstellungen, Temperaturkontrolle, Fernbedienung usw.), so dass höchster Benutzerkomfort gewährleistet ist.

Mehrfachfinger-Sonotroden für Mikrotiterplatten

4 probe heads or 4 sonotrodes for simultaneous sonication of 4 samples at the same intensity with the Hielscher 200 watts ultrasonicator models UP200ST and UP200HTDie für die Ultraschallhomogenisatoren UP200Ht und UP200St erhältlichen Mehrfingersonotroden mit 4 oder 8 Fingern (auch Ultraschallspitzen genannt) sind eine komfortable Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig unter gleichen Bedingungen zu beschallen. Die Sonotrode MTP-24-8-96 zum Beispiel ist eine Acht-Finger-Sonde, die sich ideal für die Integration in automatisierte Systeme sowie die effiziente manuelle Probenvorbereitung von Multi-Well-Platten eignet. Die Mehrfingersonotrode ist ideal für automatisierte Labore, in denen meist Becher und Reagenzgläser mit einer Standard-Ultraschallsonotrode bearbeitet werden. Die Mehrfingersonde und die Standardsonotrodenden können innerhalb weniger Minuten ausgetauscht werden, so dass aus dem Ultraschallgerät mit einer Sonotrodenspitze ein Ultraschallgerät mit Multi-Sonotrode wird.

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Hielscher Ultraschallgeräte für die DNA-Fragmentierung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Plattformen für die Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin an. Zu diesen verschiedenen Plattformen gehören Ultraschallsonotroden (Ultraschallstabschwinger), indirekte Beschallungslösungen für die gleichzeitige Probenvorbereitung von mehreren Gefäßen sowie Multiwell-Platten (z.B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten), Sonoreaktoren und Ultraschall-Cuphörner. Alle Plattformen für das Scheren von DNA werden von niederfrequenten Hochleistungs-Ultraschallprozessoren angetrieben, die präzise steuerbar sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Ultraschallprozessoren für jede Probenanzahl und -größe

Mit Hielscher's Multiproben-Ultraschallgeräten VialTweeter (für bis zu 10 Reagenzröhrchen) und UIP400MTP (für Mikrotiterplatten/Multiwellplatten) ist es problemlos möglich, die Verarbeitungsdauer der Proben durch eine intensive und präzise kontrollierbare Ultraschallbehandlung zu reduzieren und dabei eine gewünschte DNA-Fragmentgröße zu erzielen. Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall macht die Probenvorbereitung effizient, zuverlässig und skalierbar. Protokolle können durch die Anwendung von konstant kontrolliertem Ultraschall linear von einer auf zahlreiche Proben skaliert werden.
Sonotroden-Ultraschallgeräte mit einem bis fünf Fingern sind ideal für die Aufbereitung einer kleineren Probenanzahl. Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind in verschiedenen Größen erhältlich, so dass wir Ihnen das ideale Gerät für Ihre Anwendung und Anforderungen empfehlen können.

Präzise Prozesssteuerung

Hielscher ultrasonicators can be remotely controlled via browser control. Sonication parameters can be monitored and adjusted precisely to the process requirements.Präzise steuerbare Beschallungseinstellungen sind entscheidend, da übermäßige Beschallung DNA, RNA und Chromatin zerstören kann, eine unzureichende Ultraschallscherung jedoch zu lange DNA- und Chromatinfragmente zur Folge hat. Bei den digitalen Hielscher Ultraschallgeräten lassen sich problemlos präzise Beschallungsparameter einstellen. Spezifische Beschallungseinstellungen können auch als programmierte Einstellung gespeichert werden, um eine schnelle Wiederholung desselben Verfahrens zu ermöglichen.
Alle Beschallungsdurchläufe werden automatisch protokolliert und als CSV-Datei auf einer eingebauten SD-Karte gespeichert. Dies ermöglicht eine genaue Dokumentation der durchgeführten Versuche und macht es möglich, Beschallungsdurchgänge gegebenfalls zu optimieren.
Per Browser-Fernsteuerung können alle digitalen Ultraschallgeräte über jeden Standard-Browser bedient und überwacht werden. Die Installation von zusätzlicher Software ist nicht erforderlich, da eine LAN-Verbindung eine sehr einfache Plug-and-Play-Einrichtung ermöglicht.

Höchste Benutzerfreundlichkeit in der Ultraschall-Probenvorbereitung

Alle Hielscher Ultraschallgeräte sind dafür konstruiert, Hochleistungs-Ultraschall zu liefern, dabei aber immer auch sehr benutzerfreundlich und einfach zu bedienen. Alle Einstellungen sind in einem übersichtlichen Menü strukturiert, das über ein farbiges Touch-Display oder die Browser-Fernbedienung leicht zugänglich ist. Die intelligente Software mit programmierbaren Einstellungen und automatischer Datenaufzeichnung gewährleistet optimale Beschallungsregulierung für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Die übersichtliche und einfach zu bedienende Menüführung macht die Hielscher Ultraschallgeräte zu äußerst benutzerfreundlichen und effizienten Geräten.
Die nachstehende Tabelle gibt Ihnen Hinweise bezüglich der ungefähren Verarbeitungskapazität unserer Labor-Ultraschallgeräte, welche sich ideal für Probenvorbereitungsaufgaben wie DNA- und RNA-Fragmentierung, Zelllyse sowie Proteinextraktion eignen:

Gerät Leistung [W] Typ Volumen [ml]
UIP400MTP 400 für Mikrotiterplatten 6 – 3456 Wells
VialTweeter 200 für bis zu 10 Vials plus Anpressmöglichkeit 0,5 – 1,5
UP50H 50 Sonotrode 0,01 – 250
UP100H 100 Sonotrode 0,01 – 500
UP200Ht 200 Sonotrode 0,1 – 1000
UP200St 200 Sonotrode 0,1 – 1000
UP400St 400 Sonotrode 5,0 – 2000
CupHorn 200 CupHorn, Reaktor 10 – 200
GDmini2 200 Kontaminationsfreie Durchflusszelle

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The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Die Ultraschall-MultiProbenPräparationsgerät VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 Röhrchen. Mit der Aufspannvorrichtung VialPress können bis zu 4 zusätzliche Röhrchen für eine intensive Beschallung an der Stirnseite angedrückt werden.


Die Sonotrode MTP-24-8-96 verfügt über acht Ultraschallspitzen zur Beschallung der Wells von Mikrotiterplatten.

Die Sonotrode MTP-24-8-96 verfügt über acht Ultraschallspitzen zur Beschallung der Wells von Mikrotiterplatten.



Literatur / Literaturhinweise

Wissenswertes

Was ist Next Generation Sequencing?

Next-Generation Sequencing, auch Next Gen Sequencing (NGS), Hochdurchsatzsequenzierung oder Sequenzierung der zweiten Generation, bezeichnet den Ansatz der massiv-parallelen Sequenzierung, bei dem sehr große (massive) DNA-Mengen von Millionen von Fragmenten gleichzeitig und parallel pro Durchlauf sequenziert werden.
Um eine Next Generation Sequenzierung durchzuführen, müssen die drei grundlegenden Schritte (1) Bibliotheksvorbereitung, (2) Sequenzierung und (3) Datenanalyse durchgeführt werden. Bei der Bibliotheksvorbereitung müssen die DNA-Stränge in DNA-Fragmente einer bestimmten Länge aufgespalten werden. Die Beschallung (Sonifizierung) ist eine der bevorzugten Techniken zur Fragmentierung der DNA.
Bei der DNA-Sequenzierung wird die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA – bekannt als Nukleinsäuresequenz - bestimmt. Die Nukleinsäuresequenz setzt sich aus vier Nukleotidbasen zusammen - Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin – welche Informationen kodieren.
Die Next Generation Sequenzierung treibt die Forschung in den Biowissenschaften und der personalisierten Medizin voran, da die DNA- und RNA-Sequenzierung in der Genomforschung, der Krebsforschung, der Erforschung seltener und komplexer Krankheiten, der mikrobiellen Forschung, der Agrigenomik und vielen anderen Forschungsbereichen intensiv genutzt wird.

Next Generation Sequenzierung vs. Sanger-Sequenzierung

Während mit der Next Generation Sequenzierung (NGS) eine hohe Anzahl von Genomproben sequenziert werden kann, können mit der Sanger-Sequenzierung (auch bekannt als Kettenabbruchmethode oder First Generation Sequenzierung) nur kleine Probenmengen sequenziert werden. Bei der Sanger-Sequenzierung wird jeweils nur ein einziges DNA-Fragment sequenziert, was an einem einzigen Tag möglich ist. Aufgrund ihrer Genauigkeit gilt die Sanger-Sequenzierung auch als Goldstandard-Technologie, die zur Überprüfung der mit der Next Generation Sequenzierung erzielten Ergebnisse verwendet wird.
Bei der Sanger-Sequenzierung werden Leselängen von etwa 800bp erreicht (typischerweise 500-600bp bei nicht angereicherter DNA). Die größeren Leselängen bei der Sanger-Sequenzierung bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Sequenzierungsmethoden, insbesondere bei der Sequenzierung repetitiver Bereiche des Genoms. Eine Herausforderung für Sequenzdaten mit kurzer Leselänge stellt sich insbesondere bei der Sequenzierung neuer Genome (de novo) und bei der Sequenzierung hochgradig rearrangierter Genomsegmente, wie sie typischerweise bei Krebsgenomen oder in Regionen von Chromosomen mit struktureller Variation vorkommen. (vgl. Morozova und Marra, 2008)


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Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.