DNA-Fragmentierung für die Next-Generation-Sequenzierung

Die Probenvorbereitung für Next Generation Sequencing (NGS) erfordert eine zuverlässige Scherung und Fragmentierung der genomischen DNA, um genomische DNA-Stränge zu sequenzieren und Genombibliotheken zu erstellen. Die kontrollierte Fragmentierung der DNA in DNA-Fragmente ist ein wesentlicher Schritt der Probenvorbereitung, der vor der Sequenzierung der DNA erforderlich ist. Die Ultraschallfragmentierung hat sich als effiziente und zuverlässige Technik für die Fragmentierung von DNA einer bestimmter Länge erwiesen. Protokolle zur DNA-Fragmentierung mit Ultraschall erzielen reproduzierbare Fragmentierungsergebnisse. Hielscher Ultraschallgeräte sind in der Lage, eine breite Palette genomischer DNA-Fragmentgrößen zu erzeugen. Die gewünschte DNA-Länge kann über die Ultraschallparameter präzise gesteuert sindwerden Da Hielscher Ultraschallgeräte sowohl für die DNA-Fragmentierung für Einzelproben als auch simultane mehrfache Probenvorbereitung wie auch für Mikrotiterplatten erhältlich sind, ist eine effiziente Probenvorbereitung einzelner wie auch sehr vieler Proben effizient möglich.

Next-Gen Sequenzierung: DNA-Fragmentierung mit Ultraschall für die Erstellung von Genbibliotheken

Um eine Next-Generation-Sequenzierung durchzuführen, müssen folgende drei Schritte durchgeführt werden: (1) Bibliotheksvorbereitung, (2) Sequenzierung und (3) Datenanalyse . Bei der Bibliotheksvorbereitung wird die DNA fragmentiert, dann werden die Fragmentenden durch Hinzufügen einer einzelnen Adenin-Base repariert und die Fragmente in doppelsträngige DNA umgewandelt. Schließlich werden sogenannte Adapter durch Ligation, PCR oder Tagmentierung angehängt, so dass das DNA-Endprodukt der Bibliothek für die Sequenzierung quantifiziert werden kann.
DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall: Insbesondere bei Short-Read-Sequenzierungstechnologien wie Illumina, welche längere DNA-Fragmente nicht ohne weiteres lesen können, müssen die DNA-Bestände auf eine bestimmte Größe fragmentiert werden. Zur Fragmentierung der DNA-Stränge wird Ultraschall als zuverlässige Technologie eingesetzt.
Die Ultraschallbehandlung wird erfolgreich zur Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin eingesetzt.

Sequenzierung der nächsten Generation – Bibliotheksvorbereitung

Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall wird häufig bei der Vorbereitung von DNA-Sequenzierungsbibliotheken für Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation (NGS) eingesetzt. Diese Technik wird eingesetzt, um DNA-Moleküle in kleinere Fragmente eines gewünschten Größenbereichs zu zerlegen, was die nachfolgenden Schritte der Bibliotheksvorbereitung erleichtert. Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall ist in der Regel während der Bibliotheksvorbereitung von NGS-Workflows erforderlich, um genomische DNA in kleinere Stücke zu fragmentieren, die für die nachfolgende Verarbeitung und Sequenzierung geeignet sind. Sie spielt eine entscheidende Rolle für den Erfolg des Sequenzierungsexperiments, indem sie DNA-Fragmente in dem für die jeweilige Sequenzierungsplattform geeigneten Größenbereich erzeugt.

Sequenzierung der nächsten Generation – Prozess-Schritte:

• DNA-Fragmentierung mit Ultraschall: Vor dem Aufbau der Bibliothek wird die genomische DNA in kleinere, besser handhabbare Stücke fragmentiert. Bei der Ultraschallfragmentierung werden die DNA-Moleküle mit Hilfe von Hochfrequenz-Schallwellen in Fragmente des gewünschten Größenbereichs zerlegt. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da er dazu beiträgt, dass die später erzeugten Sequenzierungs-Reads eine für die verwendete Sequenzierungsplattform geeignete Länge aufweisen. Der Größenbereich der Fragmente kann je nach den spezifischen Anforderungen des Sequenzierungsexperiments angepasst werden.
• Klonale Amplifikation durch PCR: Nach der Ultraschallfragmentierung werden die DNA-Fragmente einer Endreparatur, einer Adapterligierung und einer PCR-Amplifikation unterzogen, um die endgültigen DNA-Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen. Diese Schritte bereiten die fragmentierten DNA-Moleküle für den Sequenzierungsprozess vor, indem sie Adaptersequenzen hinzufügen, die für die Bindung an die Sequenzierungsplattform erforderlich sind, und Priming-Stellen für die PCR-Amplifikation bereitstellen.
• DNA-Sequenzierung durch Synthese: Sobald die Sequenzierungsbibliotheken vorbereitet sind, beginnt der Prozess der DNA-Sequenzierung durch Synthese (SBS). Bei der SBS wird die DNA-Sequenz durch die sequentielle Anlagerung von Nukleotiden an den komplementären Strang bestimmt. Dieser Schritt umfasst zyklische Reaktionen des Nukleotideinbaus, der Bildgebung und der Abspaltung, die die Bestimmung der DNA-Sequenz auf der Grundlage der von den eingebauten Nukleotiden abgegebenen Fluoreszenzsignale ermöglichen.
• Massiv parallele Sequenzierung: Im letzten Schritt werden die räumlich getrennten, amplifizierten DNA-Vorlagen gleichzeitig und massiv parallel sequenziert. Dieser Hochdurchsatz-Sequenzierungsansatz ermöglicht die Generierung von Millionen bis Milliarden von Sequenzierlesungen in einem einzigen Sequenzierungslauf, was eine effiziente und schnelle Bestimmung von DNA-Sequenzen ermöglicht.

Wie funktioniert die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall?

Die Beschallung, auch bekannt als Sonifizierung oder akustische Probenverarbeitung, ist eine weit verbreitete Methode zur Fragmentierung von DNA. Beim Scheren der DNA mit Ultraschall werden die Proben unter kontrollierten Bedingungen intensiven Ultraschallwellen ausgesetzt. Das Funktionsprinzip der ultraschall-gestützten DNA-Fragmentierung basiert auf den durch die Ultraschallwellen erzeugten Vibrationen und Kavitation. Die Scherkräfte, welche durch die Ultraschallkavitation (akustische Kavitation) entstehen, brechen die DNA-Moleküle mit hohem Molekulargewicht auf. Die Einstellungen der Beschallung wie Intensität (Amplitude, Dauer), Pulsationsmodus und Temperatur ermöglichen eine präzise DNA-Fragmentierung bis zu einer bestimmten gewünschten Länge der DNA-Fragmente. Während DNA mittels Ultraschall häufig auf 100 bis 600 bp reduziert wird, können bei milderen Ultraschallbedingungen auch längere DNA-Fragmente von bis zu 1300 bp produziert werden.

Temperaturkontrolle zur Verhinderung ungewollter DNA-Denaturierung

Die doppelsträngige Molekülform der DNA reagiert sehr empfindlich auf erhöhte Temperaturen und kann durch Hitze schnell zerstört werden, so dass die genaue Kontrolle der Temperatur während der Probenvorbereitung ein entscheidender Faktor für zuverlässige Analyseergebnisse ist.
Unabhängig davon ob Sie ein Hielscher Ultraschallgerät mit Sonotrode, den VialTweeter (für die simultane Beschallung mehrerer Vial) oder den UIP400MTP (für Multi-Well-Platten) einsetzen – die kontinuierliche Temperaturüberwachung und -regelung ist immer durch einen steckbaren Temperatursensor und die intelligente Gerätesoftware gewährleistet. Um die Temperatur in einem bestimmten Bereich zu halten, können Sie eine obere und untere Temperaturgrenze einstellen. Das Ultraschallgerät pausiert daraufhin, sobald diese Temperaturgrenze überschritten wird, und setzt die Beschallung automatisch fort, wenn die Temperatur wieder um ein bestimmtes ∆T gesunken ist.
Die ausgefeilte Software der Hielscher Ultraschallgeräte sorgt für die zuverlässige Einhaltung idealer Beschallungsbedingungen Ihrer biologischen Proben.

DNA-Fragmentierung im Hochdurchsatz mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multi-Well-Platten

Das Probenaufkommen in den Biowissenschaften ist in den letzten zehn Jahren erheblich gestiegen. Das bedeutet, dass eine sehr hohe Anzahl von Proben (z.B. 384, 1536 oder 3456 Wells pro Mikrotiterplatte) bei der Probenvorbereitung und Analyse unter gleichbleibenden Bedingungen bearbeitet werden müssen, um vergleichbare und valide Ergebnisse zu erhalten. Mit dem UIP400MTP folgt Hielscher Ultrasonics dem Trend zur Massenprobenverarbeitung. Das UIP400MTP ist ein Ultraschallgerät für die Probenvorbereitung von Mikrotiterplatten. Der UIP400MTP kann Platten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 oder 3456 Wells bearbeiten. Je nach Mikroplattentyp kann jede Vertiefung typischerweise Probenvolumina zwischen einigen zehn Nanolitern und mehreren Millilitern aufnehmen. Der UIP400MTP wird in der biowissenschaftlichen Forschung häufig für die Probenvorbereitung vor Assays wie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder PCR (polymerase chain reaction), vor der Proteinanalytik sowie für die Chromatinvorbereitung vor CHiP und CHiP-seq, sowie vor der Identifizierung von Histonmodifikationen und anderen analytischen Behandlungen (z. B. Gelelektrophorese, Massenspektrometrie) verwendet.

Der VialTweeter für die Probenvorbereitung von bis zu 10 Vials

Der VialTweeter ist ein weit verbreitetes Labor-Ultraschallgerät, das eine effektive und komfortable Beschallung von bis zu 10 Teströhrchen (z.B. Eppendorf Tubes, CryoVials, Zentrifugenröhrchen etc.) gleichzeitig ermöglicht. Da die Fläschchen und Testgefäße indirekt beschallt werden, wird jegliche Kreuzkontamination vermieden. Da jede Probe mit der gleichen Ultraschallintensität beschallt wird, sind alle Beschallungsergebnisse homogen und reproduzierbar. Der VialTweeter bietet alle intelligenten Funktionen wie all unsere anderen digitalen Geräte (z.B. intelligentes Menü, programmierbare Einstellungen, Temperaturkontrolle, Fernbedienung usw.), so dass höchster Benutzerkomfort gewährleistet ist.

Mehrfachfinger-Sonotroden für Mikrotiterplatten

Die für die Ultraschallhomogenisatoren UP200Ht und UP200St erhältlichen Mehrfingersonotroden mit 4 oder 8 Fingern (auch Ultraschallspitzen genannt) sind eine komfortable Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig unter gleichen Bedingungen zu beschallen. Die Sonotrode MTP-24-8-96 zum Beispiel ist eine Acht-Finger-Sonde, die sich ideal für die Integration in automatisierte Systeme sowie die effiziente manuelle Probenvorbereitung von Multi-Well-Platten eignet. Die Mehrfingersonotrode ist ideal für automatisierte Labore, in denen meist Becher und Reagenzgläser mit einer Standard-Ultraschallsonotrode bearbeitet werden. Die Mehrfingersonde und die Standardsonotrodenden können innerhalb weniger Minuten ausgetauscht werden, so dass aus dem Ultraschallgerät mit einer Sonotrodenspitze ein Ultraschallgerät mit Multi-Sonotrode wird.

Hielscher Ultraschallgeräte für die DNA-Fragmentierung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Plattformen für die Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin an. Zu diesen verschiedenen Plattformen gehören Ultraschallsonotroden (Ultraschallstabschwinger), indirekte Beschallungslösungen für die gleichzeitige Probenvorbereitung von mehreren Gefäßen sowie Multiwell-Platten (z.B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten), Sonoreaktoren und Ultraschall-Cuphörner. Alle Plattformen für das Scheren von DNA werden von niederfrequenten Hochleistungs-Ultraschallprozessoren angetrieben, die präzise steuerbar sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Ultraschallprozessoren für jede Probenanzahl und -größe

Mit Hielscher's Multiproben-Ultraschallgeräten VialTweeter (für bis zu 10 Reagenzröhrchen) und UIP400MTP (für Mikrotiterplatten/Multiwellplatten) ist es problemlos möglich, die Verarbeitungsdauer der Proben durch eine intensive und präzise kontrollierbare Ultraschallbehandlung zu reduzieren und dabei eine gewünschte DNA-Fragmentgröße zu erzielen. Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall macht die Probenvorbereitung effizient, zuverlässig und skalierbar. Protokolle können durch die Anwendung von konstant kontrolliertem Ultraschall linear von einer auf zahlreiche Proben skaliert werden.
Sonotroden-Ultraschallgeräte mit einem bis fünf Fingern sind ideal für die Aufbereitung einer kleineren Probenanzahl. Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind in verschiedenen Größen erhältlich, so dass wir Ihnen das ideale Gerät für Ihre Anwendung und Anforderungen empfehlen können.

Präzise Prozesssteuerung

Präzise steuerbare Beschallungseinstellungen sind entscheidend, da übermäßige Beschallung DNA, RNA und Chromatin zerstören kann, eine unzureichende Ultraschallscherung jedoch zu lange DNA- und Chromatinfragmente zur Folge hat. Bei den digitalen Hielscher Ultraschallgeräten lassen sich problemlos präzise Beschallungsparameter einstellen. Spezifische Beschallungseinstellungen können auch als programmierte Einstellung gespeichert werden, um eine schnelle Wiederholung desselben Verfahrens zu ermöglichen.
Alle Beschallungsdurchläufe werden automatisch protokolliert und als CSV-Datei auf einer eingebauten SD-Karte gespeichert. Dies ermöglicht eine genaue Dokumentation der durchgeführten Versuche und macht es möglich, Beschallungsdurchgänge gegebenfalls zu optimieren.
Per Browser-Fernsteuerung können alle digitalen Ultraschallgeräte über jeden Standard-Browser bedient und überwacht werden. Die Installation von zusätzlicher Software ist nicht erforderlich, da eine LAN-Verbindung eine sehr einfache Plug-and-Play-Einrichtung ermöglicht.

Höchste Benutzerfreundlichkeit in der Ultraschall-Probenvorbereitung

Alle Hielscher Ultraschallgeräte sind dafür konstruiert, Hochleistungs-Ultraschall zu liefern, dabei aber immer auch sehr benutzerfreundlich und einfach zu bedienen. Alle Einstellungen sind in einem übersichtlichen Menü strukturiert, das über ein farbiges Touch-Display oder die Browser-Fernbedienung leicht zugänglich ist. Die intelligente Software mit programmierbaren Einstellungen und automatischer Datenaufzeichnung gewährleistet optimale Beschallungsregulierung für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Die übersichtliche und einfach zu bedienende Menüführung macht die Hielscher Ultraschallgeräte zu äußerst benutzerfreundlichen und effizienten Geräten.
Die nachstehende Tabelle gibt Ihnen Hinweise bezüglich der ungefähren Verarbeitungskapazität unserer Labor-Ultraschallgeräte, welche sich ideal für Probenvorbereitungsaufgaben wie DNA- und RNA-Fragmentierung, Zelllyse sowie Proteinextraktion eignen: