DNA-Scheren mit Ultraschall

• Beim Scheren von DNA und RNA werden die DNA-Moleküle in kleinere Stücke zerlegt. Die DNA-/RNA-Fragmentierung ist einer der wichtigen Probenvorbereitungsschritte, die zur Erstellung von Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) erforderlich sind.
• Ultraschall-DNA Scher nutzt die Kräfte der akustischen Kavitation der DNA oder RNA in Stücke von 100 zu brechen – 5KB bp.
• Ultraschallscher ermöglicht eine genaue DNA Fragmentierung und Anpassung an die gewünschte DNA-Länge.

DNA-Scheren durch Ultraschallbehandlung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschall-basierte Lösungen für DNA, RNA und Chromatin Scherung. Wählen zwischen einer Sondentyp ultrasonicators (z.B. UP100H) für direkte Beschallung einer microtip verwenden oder verwenden, um die VialTweeeter oder den Ultraschall cuphorn für indirekte DNA Herstellung verschiedener Proben gleichzeitig. Hielscher bietet das ideale Gerät, um Ihre Bedürfnisse Berücksichtigung, ob du 1 oder bis zu 10 Proben, Volumen von Mikroliter bis Liter Volumen – Hielscher Ultraschallprozessoren zur Verfügung Ihrer Anforderungen gerecht zu werden DNA, RNA und Chromatin-Fragmente an der richtigen Länge herzustellen. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen eine zuverlässige Bibliothek für die nächste Generation-Sequenzierung.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung, wendet Ultraschallscher rein mechanische Scherkräfte, ohne Zusatz von Chemikalien. Durch die genaue Einstellung der Prozessparameter, erzeugt Ultraschallscherhochmolekulare DNA-Fragmente (Plasmid und genomischer DNA).
Gereinigter Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Beschallen Parameter (Leistung, Pulszyklus / Bursts, Zeit und Temperatur) sicher über Software-Einstellungen gesteuert werden.

Protokolle für die Ultraschall-DNA Shearing

Für Chromatin Immunopräzipitation-Assay

Kurz gesagt, wurden die Zellen in Schalen mit 60 mm Durchmesser (400.000 pro Schale) beschichtet und mit RhoA siRNA transfiziert (wie beschrieben); nach 72 h wurden sie für 10 min bei 37°C mit Formaldehyd (Endkonzentration, 1%) inkubiert, um Proteine mit der DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe eines Zehntels Volumens von 1,25 mol/L Glycin mit 125 mmol/L Endkonzentration abgeschreckt. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, in Radioimmunpräzipitations-Assaypuffer[150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] mit 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL Aprotinin und 1 Ag/mL Pepstatin A resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis gehalten. Dann wurden Zelllysate auf Eis mit einem Ultraschall mit einem Hielscher UP200S Ultraschall-Beschallungsgerät (3 x 40 s, Amplitude 40%, 1 Zyklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), bis vernetztes chromatins wurde geschert um DNA-Fragment zwischen 200 und 1000 bp zu ergeben. Ein Zehntel des gesamten Lysat wurde verwendet, um die Menge an DNA, die in verschiedenen Proben zu quantifizieren und galt als „Gesamteingangs DNA“. Die Überstände wurden mit Lachsspermien-DNA / Protein-Agarose-50% Slurry inkubiert unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Immunpräzipitation wurde dann mit 5 Ag von anti-NF-nb p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (negative Kontrolle) bei 4 ° C über Nacht durchgeführt. Diese Überstände wurden mit 5 mol / L NaCl ergänzt und über Nacht bei 65 ° C erhitzt, Protein-DNA-Vernetzungen zurückzukehren. Die Immunkomplexe wurden weiter mit DNase- und RNase-freien Proteinase K behandelt, und die DNA wurde durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, um eine Sequenz innerhalb der Promotorregion des humanen iNOS-Gens entsprechen (P1-Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; P2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expressionsstudien

Für Expressionsstudien des rekombinante Stamm L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), SSU chromosomalen integriert, in den verschiedenen Medien kultiviert wurde, wie zuvor beschrieben, und zusätzlich mit 100 mg l supplementiert^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland). Während der Kultivierung wird 1 ml-Proben wurden entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20 ° C, 10 min) und mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen. Pellet wurde in Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) und zerfielen durch Sonifikation mit dem Ultraschallprozessor resuspendiert UP400S (Anwendung von Energie ~ 400 Ws). Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) mit 12.5% ​​polyacralamide Gele - Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (6000 × g, 4 ° C, 5 min) und analysiert durch Natriumdodecylsulfat entfernt . EGFP-Expression wurde in einer gerührten Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatinimmunpräzipitation

Der Chromatinimmunpräzipitation Test wurde durchgeführt, um den Chip-IT mit^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) nach Herstellerangaben mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, differenzierte humane Podozyten wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% Formaldehyd vernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fixierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und aus der Schale geschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Kerne im Scherpuffer resuspendiert, 30 min auf Eis inkubiert und das Chromatin durch Ultraschall geschoren, z.B. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland) bei 25% Leistung 5 Impulse von je 20 sec. auf Eis in Fragmente von ca. 200-600 bp. Das gescherte Chromatin wurde dann zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Für Immunpräzipitationen wurden 60 μl Chromatin mit 1 μg von Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) Antikörper oder mit Kaninchen-IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), als Negativkontrolle, über Nacht bei 4°C mit sanfter Rotation inkubiert. An magnetische Perlen gebundene Immunkomplexe wurden mit einem Magnetständer gesammelt, gründlich gewaschen und die Protein/DNA-Quervernetzungen umgekehrt und die DNA für die Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-Präparation für die Chip-Array-Analyse

Anordnung von Zelllysaten und extrahierte DNAs
Bakterienpellets in PBS auf die gewünschte Endkonzentration suspendiert wurden, behandelt mit Ultraschall-Disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland), ausgestattet mit einer Mikrospitze MS1 (1mm im Durchmesser). Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für durchflusszytometrische Studien verwendet, während sie für die spätere Handhabung einer Wärmebehandlung (95°C, 5 min) unterzogen wurden. Die Rohzelllysate wurden mit einer Mischung aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) verarbeitet. Ein gleiches Volumen dieser Mischung wurde der Lysatprobe zugegeben, die Lösung 15 s lang kräftig vortexed und 2 min bei Raumtemperatur (RT) um 22°C bei 15.000 x g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, die die genomische DNA enthält, wurde sorgfältig getrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Tube gesammelt.
Anschließend wurden die Proben sondiert, um die DNA zu fragmentieren. Der Sondierungsschritt wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Um die Fragmentierungseffekte auf die genomische DNA zu bewerten, wurden die Proben mittels Agarosegelelektrophorese analysiert.
(…) Die zuvor für 2,5 min sonifizierten Proben wurden nach der Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einem Phenol:Chloroform:isoamylalkoholgemisch extrahiert und anschließend für 0 - 15 min einer zweiten Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Agarosegelelektrophorese wurde verwendet, um die Größenverteilung der DNA zu bestimmen, die einer Ultraschallfragmentierung nach der Extraktion unterzogen wurde (Abb. oben rechts). Hochfragmentierte DNA war offensichtlich durch das Vorhandensein eines DNA-Abstreifens anstelle von hochmolekularen Gewichtsbändern, die aus Proben eliminiert wurden, die für 2,5 Minuten oder länger sondiert wurden. Längere Sondierung reduzierte die Fragmentlängen allmählich auf ca. 150 - 600 bp, und die Sondierung für 15 min führte zu einem weiteren Abbau dieser Fragmente, wie man vor allem am oberen Teil des Abstrichs erkennen kann. So sank die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente allmählich mit der Ultraschalldauer und die 5-minütige Behandlung erlaubte es, die Größen der DNA-Fragmente zu erhalten, die für Chip-Array-Assays am besten geeignet sind. Schließlich wurde das Verfahren zur Herstellung von DNA-Analyten, das die ersten 2 Minuten der Ultraschallbehandlung, die DNA-Extraktion (2×) und die anschließende 5-minütige Sondierung umfasst, etabliert. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und mit 2 mM Disuccinimidylglutarat für 45 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Chromatin wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% (v/v) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin bei einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Nach der Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen aus der Zellkulturschale geschabt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in einem Lysepuffer (5 mM Rohre, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (v/v) Nonidet P-40) resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und mit einem Dounce Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Kerne durch Zentrifugation pelletiert (3500 x g, 5 min, 4 °C) und im Kernpuffer resuspendiert (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (w/v) SDS). Die Kerne wurden durch Sondierung mit drei 20-er Pulsen in einem UP50H Beschallungsgerät (Hielscher Ultraschall Technologie) bei einer Einstellung von 0,5 Zyklus und Amplitude von 30%, wodurch man genomische DNA-Fragmente mit einer Volumengröße von 200 bis 1000 bp. Für CHIP, 50 g DNA wurde 4-fach in Immunpräzipitations-Puffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 und 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histon-Modifikations Analyse durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

Kurz gesagt, 6 x 10⁶ Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und auf der Kulturplatte für 15 min bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle weiteren Schritte wurden bei 48°C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann verschrottet. Gesammelte Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) gelöst und in einem kalten Ethanolbad für 10 Zyklen bei 100% Amplitude mit einem UP50H Beschallungsgerät (Hielscher, Teltow, Deutschland). Chromatin-Fragmentierung wurde in 1% Agarose-Gel sichtbar gemacht. Erhaltenen Fragmente wurden in den 200-500pb Bereich. Lösliche Chromatin wurde bei 48 ° C für 10 min mit Ultraschall behandelt, durch Zentrifugieren der Proben bei 14000 erhalten. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (8, 150 mM NaCl 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH) verdünnt, dann bei 80 ° C bis zur Verwendung in Aliquots aufgeteilt und gespeichert. (Rodriguez et al. 2008)