DNA-Scheren mit Ultraschall

Beim Scheren von DNA und RNA werden lange DNA-Moleküle in kleinere Stücke zerlegt, ein entscheidender Schritt bei der Vorbereitung von Proben für die Erstellung von NGS-Bibliotheken (Next Generation Sequencing). Beim Ultraschall-DNA-Shearing werden akustische Kavitationskräfte eingesetzt, um DNA oder RNA in Fragmente von 100 bp bis 5 kb zu zerlegen. Diese Methode ermöglicht eine präzise Kontrolle der Fragmentgröße und erleichtert die Anpassung an die gewünschte DNA-Länge für optimale Sequenzierungsergebnisse.

DNA-Scheren durch Ultraschallbehandlung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Lösungen für das Scheren von DNA, RNA und Chromatin. Wählen Sie zwischen einem Sonden-Ultraschallgerät (z.B. UP100H) für die direkte Beschallung mit einer Mikrospitze, oder verwenden Sie den VialTweeeter oder das Ultraschall-Cuphorn für die indirekte DNA-Präparation verschiedener Proben gleichzeitig. Hielscher bietet das ideale Gerät für Ihre Bedürfnisse: ob 1 oder bis zu 10 Proben, Volumina von Mikroliter bis Liter – Hielscher Sonicators erfüllen Ihre Anforderungen zur Präparation von DNA-, RNA- und Chromatinfragmenten in der richtigen Länge. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen eine zuverlässige Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung werden beim Ultraschallscheren rein mechanische Scherkräfte ohne Zugabe von Chemikalien eingesetzt. Durch die präzise Einstellung der Prozessparameter entstehen beim Ultraschallscheren DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht (Plasmid und genomische DNA).
Gereinigte Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Die Beschallungsparameter (Leistung, Impulszyklus / Bursts, Zeit und Temperatur) können sicher über Softwareeinstellungen gesteuert werden.

Protokolle für das Scheren von DNA mit Ultraschall

Für Chromatin-Immunpräzipitations-Assay

Die Zellen wurden in Schalen mit einem Durchmesser von 60 mm (400.000 pro Schale) plattiert und mit RhoA siRNA transfiziert (wie beschrieben). Nach 72 Stunden wurden sie 10 Minuten lang bei 37 °C mit Formaldehyd (Endkonzentration 1 %) inkubiert, um die Proteine mit der DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe eines Zehntelvolumens von 1,25 mol/L Glycin abgeschwächt, was eine Endkonzentration von 125 mmol/L ergab. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, in Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer [150 mmol/L NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] mit 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL Aprotinin und 1 Ag/mL Pepstatin A resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis gehalten. Dann wurden die Zelllysate auf Eis mit einer Sonde Hielscher UP200S Ultraschallgerät (3 x 40 s, Amplitude 40 %, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), bis vernetzte Chromatine abgeschert wurden und DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 bp entstanden. Ein Zehntel des gesamten Lysats wurde zur Quantifizierung der in den verschiedenen Proben vorhandenen DNA-Menge verwendet und als „Gesamtinput-DNA“. Die Überstände wurden mit Lachssperma-DNA/Protein-Agarose-50%-Aufschlämmung inkubiert, um den unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Die Immunpräzipitation wurde dann über Nacht bei 4 °C mit 5 Ag Anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (negative Kontrolle) durchgeführt. Diese Überstände wurden mit 5 mol/L NaCl versetzt und über Nacht bei 65 °C erhitzt, um die Protein-DNA-Querverbindungen umzukehren. Die Immunkomplexe wurden mit DNase- und RNase-freier Proteinase K weiterbehandelt, und die DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, die einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des menschlichen iNOS-Gens entsprechen (p1-Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studien zur EGFP-Expression

Für Expressionsstudien wurde der rekombinante Stamm L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomal ssu integriert, in den verschiedenen Medien wie zuvor beschrieben kultiviert und zusätzlich mit 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland). Während der Kultivierung wurden 1 ml Proben entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20°C, 10 min) und mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen. Das Pellet wurde in Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendiert und durch Beschallung mit dem Ultraschallgerät aufgeschlossen UP400S (Anwendung von Energie ∼ 400 Ws). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (6000 × g, 4°C, 5 min) entfernt und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen nach der Methode von Laemmli (1970) mit 12,5%igen Polyacralamid-Gelen analysiert. Die EGFP-Expression wurde in bewegter Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatinimmunpräzipitation

Der Chromatin-Immunopräzipitationstest wurde mit dem ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, differenzierte menschliche Podozyten wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 % Formaldehyd quervernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fixierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und aus der Schale geschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Kerne im Scherungspuffer resuspendiert, 30 Minuten auf Eis inkubiert und das Chromatin durch Sonikation geschert, z. B. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland) bei 25 % Leistung und 5 Impulsen von je 20 Sekunden auf Eis in Fragmente von etwa 200-600 bp. Das gescherte Chromatin wurde anschließend zentrifugiert, und der Überstand wurde aufgefangen. Für die Immunpräzipitationen wurden 60 μl Chromatin mit 1 μg Sp1- (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65- (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50- (Abcam) Antikörpern oder mit Kaninchen-IgG (Zymed Laboratories) als Negativkontrolle über Nacht bei 4 °C unter leichter Rotation inkubiert. Die an die Magnetkügelchen gebundenen Immunkomplexe wurden mit Hilfe eines Magnetständers gesammelt, ausgiebig gewaschen, die Protein/DNA-Querverbindungen umgekehrt und die DNA für die Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

Vorbereitung der EHEC-DNA für die Chip-Array-Analyse

Anordnung von Zelllysaten und extrahierten DNAs
In PBS suspendierte Bakterienpellets in der gewünschten Endkonzentration wurden mit Ultraschall-Disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland), ausgestattet mit einer Mikrospitze MS1 (1 mm Durchmesser). Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für durchflusszytometrische Untersuchungen verwendet, während die Proben für die spätere Bearbeitung einer Wärmebehandlung (95°C, 5 min) unterzogen wurden. Die rohen Zelllysate wurden mit einer Mischung aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) behandelt. Ein gleiches Volumen dieser Mischung wurde der Lysatprobe zugesetzt, die Lösung wurde 15 s lang kräftig geschüttelt und 2 Minuten lang bei 15.000 x g bei Raumtemperatur (RT) um 22 °C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, die die genomische DNA enthielt, wurde sorgfältig abgetrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Röhrchen aufgefangen.
Anschließend wurden die Proben beschallt, um die DNA zu fragmentieren. Der Beschallungsschritt erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Um die Auswirkungen der Fragmentierung auf die genomische DNA zu bewerten, wurden die Proben mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
(…) Die zuvor 2,5 Minuten lang beschallten Proben wurden nach einer Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einem Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Gemisch extrahiert und anschließend einer zweiten Beschallung von 0-15 Minuten unterzogen. Mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese wurde die Größenverteilung der DNA bestimmt, die nach der Extraktion mit Ultraschall fragmentiert wurde (Abb. oben rechts). Stark fragmentierte DNA war durch das Vorhandensein eines DNA-Schmierens erkennbar und nicht durch hochmolekulare Banden, die bei Proben, die 2,5 Minuten oder länger beschallt wurden, eliminiert wurden. Bei längerer Beschallung verringerte sich die Länge der Fragmente allmählich auf etwa 150 bis 600 bp, und bei einer Beschallungsdauer von 15 Minuten wurden diese Fragmente weiter abgebaut, was vor allem am oberen Teil des Ausstrichs zu erkennen ist. Die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße nahm also mit der Dauer der Ultraschallbehandlung allmählich ab, und die 5-minütige Behandlung ermöglichte es, die für Chip-Array-Tests am besten geeigneten DNA-Fragmentgrößen zu erhalten. Schließlich wurde das Verfahren zur Vorbereitung der DNA-Analyten festgelegt, das zunächst eine 2-minütige Ultraschallbehandlung, eine DNA-Extraktion (2×) und anschließend eine 5-minütige Beschallung umfasst. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und mit 2 mM Disuccinimidyl-Glutarat für 45 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Das Chromatin wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% (v/v) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin in einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Nach der Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen aus der Zellkulturschale geschabt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (v/v) Nonidet P-40) resuspendiert, 10 Minuten auf Eis inkubiert und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Zellkerne durch Zentrifugation (3500 x g, 5 min, 4 °C) pelletiert und in Zellkernpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (w/v) SDS) resuspendiert. Die Kerne wurden durch Beschallung mit drei 20-s-Impulsen in einem UP50H-Sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bei einer Einstellung von Zyklus 0,5 und einer Amplitude von 30 %, wodurch genomische DNA-Fragmente mit einer Größe von 200 - 1000 bp erhalten wurden. Für ChIP wurden 50 g DNA vierfach in Immunpräzipitationspuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 und 0,01 % (w/v) SDS) verdünnt (Weiske et al. 2006).

Analyse der Histonveränderungen durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Kurz gesagt, 6 x 10⁶ Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5 % Formaldehyd auf der Kulturplatte vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 48°C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann ausgeschabt. Die gesammelten Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1 % SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) aufgelöst und in einem kalten Ethanolbad 10 Zyklen lang bei 100 % Amplitude mit einem Ultraschallgerät UP50H-Sonicator (Hielscher, Teltow, Deutschland). Die Chromatinfragmentierung wurde in einem 1%igen Agarosegel sichtbar gemacht. Die erhaltenen Fragmente lagen im Bereich von 200-500 pb. Lösliches Chromatin wurde durch Zentrifugieren der beschallten Proben bei 14.000 g für 10 Minuten bei 48 °C gewonnen. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) verdünnt, aliquotiert und bis zur Verwendung bei 80°C gelagert. (Rodriguez et al. 2008)