DNA-Scheren mit Ultraschall

DNA-Scheren mit Ultraschall

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Lösungen für die DNA-, RNA- und Chromatinscherung an. Wählen Sie zwischen einem sondenartigen Ultraschallgerät (z.B. UP100H) für die direkte Beschallung mit einer Mikrospitze oder verwenden Sie den VialTweeeter oder das Ultraschall-Cuphorn für die indirekte DNA-Vorbereitung verschiedener Proben gleichzeitig. Hielscher bietet für Ihre Bedürfnisse das ideale Gerät: Ob 1 oder bis zu 10 Proben, Volumen vom Mikroliter bis zum Liter-Volumen. – Hielscher Ultraschallprozessoren sind verfügbar, um Ihre Anforderungen zu erfüllen und DNA-, RNA- und Chromatinfragmente in der richtigen Länge herzustellen. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen eine zuverlässige Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung übt das Ultraschallscheren reine mechanische Scherkräfte ohne Zugabe von Chemikalien aus. Durch die präzise Einstellung der Prozessparameter erzeugt das Ultraschallscheren hochmolekulare DNA-Fragmente (Plasmid und genomische DNA).
Gereinigte Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Die Beschallungsparameter (Leistung, Impulszyklus / Bursts, Zeit und Temperatur) können über Software-Einstellungen sicher gesteuert werden.

Protokolle für die Ultraschall-DNA-Scherung

Für den Chromatin Immunpräzipitations-Assay

Kurz gesagt, wurden die Zellen in Schalen mit 60 mm Durchmesser (400.000 pro Schale) beschichtet und mit RhoA siRNA transfiziert (wie beschrieben); nach 72 h wurden sie für 10 min bei 37°C mit Formaldehyd (Endkonzentration, 1%) inkubiert, um Proteine mit der DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe eines Zehntels Volumens von 1,25 mol/L Glycin mit 125 mmol/L Endkonzentration abgeschreckt. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, in Radioimmunpräzipitations-Assaypuffer[150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] mit 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL Aprotinin und 1 Ag/mL Pepstatin A resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis gehalten. Dann wurden Zelllysate auf Eis mit einem Ultraschall mit einem Hielscher UP200S Ultraschallsonicator (3 x 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), bis vernetzte Chromatine geschert wurden, um DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 bp zu erhalten. Ein Zehntel des gesamten Lysats wurde verwendet, um die Menge der in verschiedenen Proben vorhandenen DNA zu quantifizieren und als „Gesamtinput DNA“. Überstände wurden mit Lachssperma-DNA/Protein-Agarose inkubiert - 50 % Gülle, um unspezifische Hintergründe zu reduzieren. Die Immunpräzipitation erfolgte dann über Nacht bei 4°C mit 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (Negativkontrolle). Diese Überstände wurden mit 5 mol/L NaCl ergänzt und über Nacht auf 65°C erhitzt, um Protein-DNA-Vernetzungen rückgängig zu machen. Die Immunkomplexe wurden weiter mit DNase- und RNase-freier Proteinase K behandelt, und die DNA wurde durch Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, die einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des menschlichen iNOS-Gens entsprechen (p1 Primer: 5¶-GAGGGCTTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 Primer: GCTGGCTACTGACCCAG- CAGTTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expressionsstudien

Für Expressionsstudien wurde der rekombinante Stamm L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomal ssu integriert, wie zuvor beschrieben in den verschiedenen Medien angebaut und zusätzlich mit 100 mg l ergänzt.^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland). Während der Kultivierung wurden 1 ml Proben entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20°C, 10 min) und mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen. Das Pellet wurde im Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendiert und durch Sonifikation mit dem Ultraschallprozessor aufgelöst. UP400S (Energieeintrag ∼ 400 Ws). Zellablagerungen wurden durch Zentrifugation entfernt (6000 × g, 4°C, 5 min) und durch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen nach der Methode von Laemmli (1970) mit 12,5% Polyacralamidgelen analysiert. Die EGFP-Expression wurde in agitierter Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatin-Immunpräzipitation

Der Chromatin-Immunpräzipitationstest wurde mit dem ChIP-IT durchgeführt.^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) nach Herstellerangaben mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, differenzierte humane Podozyten wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% Formaldehyd vernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fixierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und aus der Schale geschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Kerne im Scherpuffer resuspendiert, 30 min auf Eis inkubiert und das Chromatin durch Ultraschall geschoren, z.B. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland) bei 25% Leistung 5 Impulse von je 20 sec. auf Eis in Fragmente von ca. 200-600 bp. Das gescherte Chromatin wurde dann zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Für Immunpräzipitationen wurden 60 μl Chromatin mit 1 μg von Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) Antikörper oder mit Kaninchen-IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), als Negativkontrolle, über Nacht bei 4°C mit sanfter Rotation inkubiert. An magnetische Perlen gebundene Immunkomplexe wurden mit einem Magnetständer gesammelt, gründlich gewaschen und die Protein/DNA-Quervernetzungen umgekehrt und die DNA für die Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA-Präparation für die Chip-Array-Analyse

Anordnung von Zelllysaten und extrahierten DNAs
Bakterienpellets, die in PBS bis zur gewünschten Endkonzentration suspendiert sind, wurden behandelt mit Ultraschalldisruptor UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland), ausgestattet mit einer Mikrospitze MS1 (1mm im Durchmesser). Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für durchflusszytometrische Studien verwendet, während sie für die spätere Handhabung einer Wärmebehandlung (95°C, 5 min) unterzogen wurden. Die Rohzelllysate wurden mit einer Mischung aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) verarbeitet. Ein gleiches Volumen dieser Mischung wurde der Lysatprobe zugegeben, die Lösung 15 s lang kräftig vortexed und 2 min bei Raumtemperatur (RT) um 22°C bei 15.000 x g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, die die genomische DNA enthält, wurde sorgfältig getrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Tube gesammelt.
Anschließend wurden die Proben sondiert, um die DNA zu fragmentieren. Der Sondierungsschritt wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Um die Fragmentierungseffekte auf die genomische DNA zu bewerten, wurden die Proben mittels Agarosegelelektrophorese analysiert.
(…) Die zuvor für 2,5 min sonifizierten Proben wurden nach der Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einem Phenol:Chloroform:isoamylalkoholgemisch extrahiert und anschließend für 0 - 15 min einer zweiten Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Agarosegelelektrophorese wurde verwendet, um die Größenverteilung der DNA zu bestimmen, die einer Ultraschallfragmentierung nach der Extraktion unterzogen wurde (Abb. oben rechts). Hochfragmentierte DNA war offensichtlich durch das Vorhandensein eines DNA-Abstreifens anstelle von hochmolekularen Gewichtsbändern, die aus Proben eliminiert wurden, die für 2,5 Minuten oder länger sondiert wurden. Längere Sondierung reduzierte die Fragmentlängen allmählich auf ca. 150 - 600 bp, und die Sondierung für 15 min führte zu einem weiteren Abbau dieser Fragmente, wie man vor allem am oberen Teil des Abstrichs erkennen kann. So sank die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente allmählich mit der Ultraschalldauer und die 5-minütige Behandlung erlaubte es, die Größen der DNA-Fragmente zu erhalten, die für Chip-Array-Assays am besten geeignet sind. Schließlich wurde das Verfahren zur Herstellung von DNA-Analyten, das die ersten 2 Minuten der Ultraschallbehandlung, die DNA-Extraktion (2×) und die anschließende 5-minütige Sondierung umfasst, etabliert. (Basselet et al. 2008)

Chromatin Immunpräzipitation (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und mit 2 mM Disuccinimidylglutarat für 45 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Chromatin wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1% (v/v) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin bei einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Nach der Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen aus der Zellkulturschale geschabt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in einem Lysepuffer (5 mM Rohre, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (v/v) Nonidet P-40) resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und mit einem Dounce Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Kerne durch Zentrifugation pelletiert (3500 x g, 5 min, 4 °C) und im Kernpuffer resuspendiert (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (w/v) SDS). Die Kerne wurden durch Sondierung mit drei 20-er Pulsen in einem UP50H Sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bei einer Einstellung von Zyklus 0,5 und Amplitude 30%, was genomische DNA-Fragmente mit einer Schüttgröße von 200 - 1000 bp ergibt. Für ChIP wurden 50 g DNA 4-fach im Immunpräzipitationspuffer verdünnt (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 und 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonmodifikationsanalyse durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Kurz gesagt, 6 x 10⁶ Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und auf der Kulturplatte für 15 min bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle weiteren Schritte wurden bei 48°C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann verschrottet. Gesammelte Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) gelöst und in einem kalten Ethanolbad für 10 Zyklen bei 100% Amplitude mit einem UP50H Sonicator (Hielscher, Teltow, Deutschland). Die Chromatinfragmentierung wurde in 1% Agarosegel visualisiert. Die erhaltenen Fragmente lagen im Bereich von 200-500pb. Lösliches Chromatin wurde durch Zentrifugieren der beschallten Proben bei 14.000g für 10 min bei 48°C erhalten. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) verdünnt, dann aliquotiert und bis zur Verwendung bei 80°C gelagert. (Rodriguez et al. 2008)