DNA-Scheren mit Ultraschall

DNA-Scheren mit Ultraschall

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Lösungen für DNA-, RNA- und Chromatinscheren an. Wählen Sie zwischen Sonden-Ultraschallgeräten (z. B. UP100H) für die direkte Ultraschallbehandlung mit einer Mikrospitze, oder verwenden Sie das VialTweeeter oder das Ultraschallhorn für die indirekte DNA-Präparation verschiedener Proben gleichzeitig. Hielscher bietet das ideale Gerät für Ihre Bedürfnisse: Ob Sie 1 oder bis zu 10 Proben haben, Volumen von Mikroliter bis Liter – Hielscher-Ultraschallprozessoren sind für Ihre Anforderungen verfügbar, um DNA-, RNA- und Chromatinfragmente in der richtigen Länge herzustellen. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen eine zuverlässige Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung werden beim Ultraschallscheren reine mechanische Scherkräfte ohne Zugabe von Chemikalien angewendet. Durch die genaue Einstellung der Prozessparameter werden durch Ultraschallscheren DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht (Plasmid- und Genom-DNA) erzeugt.
Gereinigte Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Die Schallparameter (Leistung, Impulszyklus / Impuls, Zeit und Temperatur) können über Softwareeinstellungen sicher gesteuert werden.

Protokolle für das Ultraschall-DNA-Scheren

Für den Chromatin-Immunfällungsassay

Kurz gesagt, die Zellen wurden in Schalen mit einem Durchmesser von 60 mm (400.000 pro Schale) ausplattiert und mit RhoA-siRNA (wie beschrieben) transfiziert; Nach 72 h wurden sie 10 min bei 37 ° C mit Formaldehyd (Endkonzentration 1%) inkubiert, um Proteine mit DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe eines Zehntel Volumens 1,25 mol / l Glycin gestoppt, wobei 125 mmol / l Endkonzentration erhalten wurden. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in Radioimmunpräzipitationsassaypuffer [150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert )] mit 1 mmol / l Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag / ml Aprotinin und 1 Ag / ml Pepstatin A und 30 min auf Eis gehalten. Dann wurden Zelllysate mit Eis auf Eis beschallt Hielscher UP200S Ultraschall-Ultraschallgerät (3 × 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), bis vernetzte Chromatine geschert wurden, um DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 bp zu erhalten. Ein Zehntel des gesamten Lysats wurde verwendet, um die Menge der in verschiedenen Proben vorhandenen DNA zu quantifizieren und als zu betrachten „Gesamteingangs-DNA“. Die Überstände wurden mit Lachssperma-DNA / Proteinagarose-50% iger Aufschlämmung inkubiert, um den unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Die Immunfällung erfolgte dann über Nacht bei 4 ° C mit 5 Ag Anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (Negativkontrolle). Diese Überstände wurden mit 5 mol / l NaCl ergänzt und über Nacht bei 65 ° C erhitzt, um Protein-DNA-Vernetzungen umzukehren. Die Immunkomplexe wurden weiter mit DNase- und RNase-freier Proteinase K behandelt, und die DNA wurde durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, die einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des humanen iNOS-Gens entsprechen (p1-Primer: 5-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3;; p2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expressionsstudien

Für Expressionsstudien wurde der rekombinante Stamm L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), integriert in chromosomales SSU, in den verschiedenen Medien wie zuvor beschrieben kultiviert zusätzlich ergänzt mit 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland). Während der Kultivierung wurden 1 ml-Proben entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20 ° C, 10 min) und mit 0,9% iger NaCl-Lösung gewaschen. Das Pellet wurde in Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung mit dem Ultraschall-Prozessor desintegriert UP400S (Anwendung von Energie ∼ 400 Ws). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (6000 × g, 4 ° C, 5 min) entfernt und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) mit 12,5% Polyacralamidgelen analysiert . Die EGFP-Expression wurde in bewegter Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatin-Immunfällung

Der Chromatin-Immunopräzipitationsassay wurde unter Verwendung von ChIP-IT durchgeführt^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, differenzierte humane Podozyten wurden 10 min bei Raumtemperatur mit 1% Formaldehyd vernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fixierungsreaktion durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und von der Schale abgekratzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden pelletierte Kerne in dem Scherpuffer resuspendiert, 30 Minuten auf Eis inkubiert und das Chromatin wurde durch Ultraschall geschert, z UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland) bei 25% Leistung 5 Impulse von je 20 Sekunden auf Eis in Fragmente von etwa 200–600 bp. Das gescherte Chromatin wurde dann zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Für Immunpräzipitationen wurden 60 μl Chromatin mit 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornien, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) oder mit Kaninchen inkubiert IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, Kalifornien, USA) als negative Kontrolle über Nacht bei 4 ° C mit leichter Rotation. An Magnetic Beads gebundene Immunkomplexe wurden unter Verwendung eines Magnetstativs gesammelt, gründlich gewaschen und die Protein / DNA-Vernetzungen wurden umgekehrt und die DNA wurde für eine Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-Präparation für die Chip-Array-Analyse

Anordnung von Zelllysaten und extrahierten DNAs
Bakterienpellets, suspendiert in PBS bis zur gewünschten Endkonzentration, wurden mit behandelt Ultraschall-Disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland) mit einer Mikrospitze MS1 (1 mm Durchmesser) ausgestattet. Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung betrug 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für durchflusszytometrische Untersuchungen verwendet, während die Proben zur späteren Behandlung einer Wärmebehandlung (95 ° C, 5 min) unterzogen wurden. Die rohen Zelllysate wurden mit einer Mischung aus Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) verarbeitet. Ein gleiches Volumen dieser Mischung wurde zu der Lysatprobe gegeben, die Lösung wurde 15 Sekunden lang kräftig gewirbelt und bei 15.000 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT) um 22 ° C zentrifugiert. Die wässrige Kopfphase, die die genomische DNA enthielt, wurde sorgfältig getrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Röhrchen gesammelt.
Anschließend wurden die Proben mit Ultraschall behandelt, um die DNA zu fragmentieren. Der Ultraschallschritt wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Um die Fragmentierungseffekte auf die genomische DNA zu bewerten, wurden die Proben unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese analysiert.
(…) Die zuvor für 2,5 Minuten beschallten Proben wurden nach der Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einer Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Mischung extrahiert und anschließend einer zweiten Ultraschallbehandlung für 0 bis 15 Minuten unterzogen. Die Agarosegelelektrophorese wurde verwendet, um die Größenverteilung der DNA zu bestimmen, die einer Ultraschall-Fragmentierung nach der Extraktion unterworfen wurde (Abb. Rechts oben). Hoch fragmentierte DNA wurde aus der Anwesenheit eines DNA-Abstrichs und nicht aus Banden mit hohem Molekulargewicht ersichtlich, die aus Proben entfernt wurden, die für 2,5 Minuten oder länger mit Ultraschall behandelt wurden. Längere Beschallung reduzierte die Fragmentlänge allmählich auf etwa 150 - 600 bp, und eine 15-minütige Ultraschallbehandlung baute diese Fragmente weiter ab, wie dies vor allem am oberen Teil des Abstrichs erkennbar ist. Somit nahm die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße mit der Ultraschallzeit allmählich ab und die 5-minütige Behandlung erlaubte es, die Größen der DNA-Fragmente zu erhalten, die für Chip-Array-Assays am besten geeignet sind. Zuletzt wurde das Verfahren zur Herstellung des DNA-Analyten, bestehend aus den ersten 2 Minuten Ultraschallbehandlung, DNA-Extraktion (2 ×) und anschließender 5-minütiger Ultraschallbehandlung, festgelegt. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunfällung (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und 45 min bei Raumtemperatur mit 2 mM Disuccinimidylglutarat fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Chromatin wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1% (V / V) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskalter PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin bei einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Nach der Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen von der Zellkulturschale abgekratzt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (v / v) Nonidet P-40) resuspendiert, 10 Minuten auf Eis inkubiert und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Kerne durch Zentrifugation (3500 × g, 5 min, 4 ° C) pelletiert und in Keimpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (Gew./Vol.) SDS) resuspendiert. Die Kerne wurden durch Ultraschallbehandlung mit drei 20-Sekunden-Impulsen in einer Zelle unterbrochen UP50H Ultraschallgerät (Hielscher Ultraschall Technologie) mit einer Einstellung von 0,5 und einer Amplitude von 30%, wodurch genomische DNA-Fragmente mit einer Gesamtgröße von 200 - 1000 bp erhalten werden. Für ChIP wurden 50 g DNA 4-fach in Immunopräzipitationspuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 und 0,01% (w / m) verdünnt. v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histon-Modifikationsanalyse durch Chromatin-Immunfällung (ChIP)

Kurz gesagt, 6 x 10⁶ Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und auf der Kulturplatte 15 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 48 ° C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann abgekratzt. Gesammelte Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) gelöst und in einem kalten Ethanolbad für 10 Zyklen bei 100% Amplitude unter Verwendung von a beschallt UP50H Ultraschallgerät (Hielscher, Teltow, Deutschland). Die Chromatinfragmentierung wurde in 1% Agarosegel sichtbar gemacht. Erhaltene Fragmente lagen im Bereich von 200–500 pb. Lösliches Chromatin wurde durch Zentrifugieren der beschallten Proben bei 14.000 g für 10 Minuten bei 48 ° C erhalten. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl) verdünnt, dann aliquotiert und bis zur Verwendung bei 80ºC aufbewahrt. (Rodriguez et al. 2008)