DNA-Scherung mit Ultraschall

Bei der DNA- und RNA-Scherung werden lange DNA-Moleküle in kleinere Stücke fragmentiert – ein entscheidender Schritt bei der Probenvorbereitung zur Erstellung von Bibliotheken für die Next-Generation-Sequenzierung (NGS). Die DNA-Scherung mit Ultraschall nutzt die Kräfte der akustischen Kavitation, um DNA oder RNA in Fragmente von 100 bp bis 5 kb zu zerlegen. Diese Methode ermöglicht eine präzise Kontrolle der Fragmentgröße und damit die Anpassung an die gewünschte DNA-Länge für optimale Sequenzierungsergebnisse.

DNA-Scherung durch Ultraschallbehandlung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Lösungen für die Scherung von DNA, RNA und Chromatin. Wählen Sie ein Ultraschallgerät mit Sonotrode (z. B. UP100H) zur direkten Beschallung mit einer Mikrospitze oder verwenden Sie den VialTweeeter oder den Ultraschall-CupHorn zur gleichzeitigen indirekten DNA-Präparation mehrerer Proben. Hielscher bietet das ideale Gerät für Ihre Anforderungen: Ob Sie 1 oder bis zu 10 Proben und Volumina vom Mikroliter- bis zum Literbereich bearbeiten – die Ultraschallgeräte von Hielscher erfüllen Ihre Anforderungen an die Herstellung von DNA-, RNA- und Chromatinfragmenten in der richtigen Länge. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen die zuverlässige Erstellung einer Bibliothek für die Next-Generation-Sequenzierung.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung nutzt die Ultraschallscherung rein mechanische Scherkräfte ohne Zusatz von Chemikalien. Durch die präzise Einstellung der Prozessparameter erzeugt die Ultraschallscherung hochmolekulare DNA-Fragmente (Plasmid-DNA und genomische DNA).
Gereinigte Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Die Beschallungsparameter (Leistung, Impulszyklus / Impulsfolgen, Zeit und Temperatur) lassen sich über Softwareeinstellungen sicher steuern.

Protokolle zur DNA-Scherung mit Ultraschall

Für den Chromatin-Immunpräzipitationsassay

Zellen wurden in Schalen mit 60 mm Durchmesser ausgesät (400.000 pro Schale) und wie beschrieben mit RhoA-siRNA transfiziert; nach 72 h wurden sie für 10 min bei 37°C mit Formaldehyd (Endkonzentration 1%) inkubiert, um Proteine mit DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe eines Zehntels des Volumens an 1,25 mol/L Glycin gestoppt, wodurch eine Endkonzentration von 125 mmol/L erreicht wurde. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, in Radioimmunpräzipitationsassay-Puffer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] mit 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL Aprotinin und 1 Ag/mL Pepstatin A resuspendiert und für 30 min auf Eis gehalten. Anschließend wurden die Zelllysate auf Eis mit dem Ultraschallgerät Hielscher UP200S (3 x 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) beschallt, bis das vernetzte Chromatin so geschert war, dass DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 bp entstanden. Ein Zehntel des gesamten Lysats wurde zur Quantifizierung der in den verschiedenen Proben vorhandenen DNA-Menge verwendet und als „gesamte Input-DNA“ betrachtet. Die Überstände wurden mit einer 50%igen Suspension aus Lachssperma-DNA/Protein-Agarose inkubiert, um den unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Die Immunpräzipitation erfolgte anschließend über Nacht bei 4°C mit 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (Negativkontrolle). Diesen Überständen wurde 5 mol/L NaCl zugesetzt, und sie wurden über Nacht auf 65°C erhitzt, um die Protein-DNA-Vernetzungen aufzuheben. Die Immunkomplexe wurden anschließend mit DNase- und RNase-freier Proteinase K behandelt, und die DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, die einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des menschlichen iNOS-Gens entsprechen (p1-Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Untersuchungen zur EGFP-Expression

Für Expressionsuntersuchungen wurde der rekombinante Stamm L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem am chromosomalen ssu-Locus integrierten Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) wie zuvor beschrieben in den verschiedenen Medien kultiviert, die zusätzlich mit 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland) versetzt wurden. Während der Kultivierung wurden Proben von 1 ml entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20°C, 10 min) und mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen. Das Pellet wurde in Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendiert und durch Beschallung mit dem Ultraschallprozessor UP400S aufgeschlossen (Energieeintrag ∼ 400 Ws). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (6000 × g, 4°C, 5 min) entfernt und mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen nach der Methode von Laemmli (1970) mit 12,5%igen Polyacrylamidgelen analysiert. Die EGFP-Expression wurde in bewegter Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatin-Immunpräzipitation

Der Chromatin-Immunpräzipitationsassay wurde mit dem ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) nach den Herstellerangaben mit einigen Änderungen durchgeführt. Differenzierte menschliche Podozyten wurden mit 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur vernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen, und die Fixierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und von der Schale abgeschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Zellkerne im Scherpuffer resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Chromatin durch Beschallung, z. B. mit dem UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland), bei 25% Leistung mit 5 Impulsen von jeweils 20 sec auf Eis in Fragmente von etwa 200–600 bp geschert. Das gescherte Chromatin wurde anschließend zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Für die Immunpräzipitationen wurden 60 μl Chromatin mit 1 μg Antikörpern gegen Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) oder mit Kaninchen-IgG (Zymed Laboratories) als Negativkontrolle über Nacht bei 4°C unter sanfter Rotation inkubiert. An magnetische Beads gebundene Immunkomplexe wurden mithilfe eines Magnetständers gesammelt und gründlich gewaschen. Die Protein/DNA-Vernetzungen wurden aufgehoben und die DNA für die Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-Präparation für die Chip-Array-Analyse

Herstellung von Zelllysaten und extrahierter DNA
Bakterienpellets, die in PBS bis zur gewünschten Endkonzentration suspendiert worden waren, wurden mit dem Ultraschall-Zellaufschlussgerät UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland), ausgestattet mit einer Mikrospitze MS1 (1 mm Durchmesser), behandelt. Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für durchflusszytometrische Untersuchungen verwendet; für die spätere Bearbeitung wurden sie einer Wärmebehandlung unterzogen (95°C, 5 min). Die rohen Zelllysate wurden mit einem Gemisch aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) behandelt. Ein gleiches Volumen dieses Gemischs wurde zur Lysatprobe gegeben. Die Lösung wurde für 15 s kräftig auf dem Vortexmischer gemischt und bei 15.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur (RT) von etwa 22°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase mit der genomischen DNA wurde vorsichtig abgetrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Gefäß gesammelt.
Anschließend wurden die Proben beschallt, um die DNA zu fragmentieren. Die Beschallung erfolgte unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben. Zur Beurteilung der Fragmentierungseffekte auf die genomische DNA wurden die Proben mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
(…) Die zuvor für 2,5 min beschallten Proben wurden nach der Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einem Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Gemisch extrahiert und anschließend für 0 – 15 min ein zweites Mal beschallt. Mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese wurde die Größenverteilung der DNA bestimmt, die nach der Extraktion durch Ultraschall fragmentiert worden war (Abb. oben rechts). Stark fragmentierte DNA zeigte sich als DNA-Schmierspur anstelle hochmolekularer Banden, die bei Proben nach einer Beschallung von 2,5 min oder länger nicht mehr vorhanden waren. Eine längere Beschallung verringerte die Fragmentlängen schrittweise auf etwa 150 – 600 bp. Eine Beschallung für 15 min baute diese Fragmente weiter ab, wie vor allem am oberen Teil der Schmierspur zu erkennen ist. Somit nahm die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße mit zunehmender Beschallungsdauer schrittweise ab, und durch die Behandlung für 5 min konnten DNA-Fragmentgrößen erhalten werden, die für Chip-Array-Assays am besten geeignet waren. Schließlich wurde ein Verfahren zur Präparation des DNA-Analyten etabliert, das zunächst eine Ultraschallbehandlung für 2 min, eine DNA-Extraktion (2×) und eine anschließende Beschallung für 5 min umfasst. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und mit 2 mM Disuccinimidylglutarat für 45 min bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Das Chromatin wurde für 10 min bei Raumtemperatur mit 1% (v/v) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin bei einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. Nach der Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen von der Zellkulturschale abgeschabt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (v/v) Nonidet P-40) resuspendiert, für 10 min auf Eis inkubiert und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Zellkerne durch Zentrifugation (3500 x g, 5 min, 4 °C) pelletiert und in Kernpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (w/v) SDS) resuspendiert. Die Zellkerne wurden durch Beschallung mit drei Impulsen von jeweils 20 s in einem Ultraschallgerät UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) bei einer Zykluseinstellung von 0,5 und einer Amplitude von 30% aufgeschlossen. Dabei entstanden genomische DNA-Fragmente, deren Größe überwiegend bei 200 – 1000 bp lag. Für ChIP wurden 50g DNA in Immunpräzipitationspuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 und 0,01% (w/v) SDS) 4-fach verdünnt. (Weiske et al. 2006)

Analyse von Histonmodifikationen durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

6 x 10⁶ Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und auf der Kulturplatte für 15 min bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 48°C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend abgeschabt. Die gesammelten Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) gelöst und in einem kalten Ethanolbad über 10 Zyklen bei 100% Amplitude mit einem Ultraschallgerät UP50H (Hielscher, Teltow, Deutschland) beschallt. Die Chromatinfragmentierung wurde in einem 1%igen Agarosegel sichtbar gemacht. Die erhaltenen Fragmente lagen im Bereich von 200–500pb. Lösliches Chromatin wurde durch Zentrifugation der beschallten Proben bei 14.000g für 10 min bei 48°C gewonnen. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) verdünnt, anschließend aliquotiert und bis zur Verwendung bei 80°C gelagert. (Rodriguez et al. 2008)