DNA-Scheren mit Ultraschall

DNA-Scheren mit Ultraschall

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschall-basierte Lösungen für DNA, RNA und Chromatin Scherung. Wählen zwischen einer Sondentyp ultrasonicators (z.B. UP100H) für direkte Beschallung einer microtip verwenden oder verwenden, um die VialTweeeter oder den Ultraschall cuphorn für indirekte DNA Herstellung verschiedener Proben gleichzeitig. Hielscher bietet das ideale Gerät, um Ihre Bedürfnisse Berücksichtigung, ob du 1 oder bis zu 10 Proben, Volumen von Mikroliter bis Liter Volumen – Hielscher Ultraschallprozessoren zur Verfügung Ihrer Anforderungen gerecht zu werden DNA, RNA und Chromatin-Fragmente an der richtigen Länge herzustellen. Reproduzierbarkeit, einfache Bedienung und präzise Steuerung ermöglichen eine zuverlässige Bibliothek für die nächste Generation-Sequenzierung.
Im Gegensatz zur enzymatischen DNA-Fragmentierung, wendet Ultraschallscher rein mechanische Scherkräfte, ohne Zusatz von Chemikalien. Durch die genaue Einstellung der Prozessparameter, erzeugt Ultraschallscherhochmolekulare DNA-Fragmente (Plasmid und genomischer DNA).
Gereinigter Nukleinsäuren können vor oder nach einem Fragmentierungsschritt amplifiziert werden.
Beschallen Parameter (Leistung, Pulszyklus / Bursts, Zeit und Temperatur) sicher über Software-Einstellungen gesteuert werden.

Protokolle für die Ultraschall-DNA Shearing

Für Chromatin Immunopräzipitation-Assay

Kurz gesagt wurden die Zellen in Schalen mit 60 mm Durchmesser (400.000 pro Schale) ausplattiert und mit RhoA-siRNA (wie beschrieben) transfiziert; nach 72 Stunden wurden sie mit Formaldehyd (Endkonzentration 1%) für 10 Minuten bei 37 ° C inkubiert, um Proteine ​​mit DNA zu vernetzen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von einem Zehntel Volumen von 1,25 mol / l Glycin gequencht, was 125 mmol / l Endkonzentration ergab. Die Zellen wurden zweimal mit eiskalter PBS gewaschen, resuspendiert in Radioimmunpräzipitationstestpuffer [150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8,0 )], enthaltend 1 mmol / l Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag / ml Aprotinin und 1 Ag / ml Pepstatin A, und wurde 30 min auf Eis gehalten. Dann wurden Zelllysate mit Eis mit Eis beschallt Hielscher UP200S Ultraschall-Beschallungsgerät (3 x 40 s, Amplitude 40%, 1 Zyklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), bis vernetztes chromatins wurde geschert um DNA-Fragment zwischen 200 und 1000 bp zu ergeben. Ein Zehntel des gesamten Lysat wurde verwendet, um die Menge an DNA, die in verschiedenen Proben zu quantifizieren und galt als „Gesamteingangs DNA“. Die Überstände wurden mit Lachsspermien-DNA / Protein-Agarose-50% Slurry inkubiert unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Immunpräzipitation wurde dann mit 5 Ag von anti-NF-nb p65 (Upstate) oder ohne Antikörper (negative Kontrolle) bei 4 ° C über Nacht durchgeführt. Diese Überstände wurden mit 5 mol / L NaCl ergänzt und über Nacht bei 65 ° C erhitzt, Protein-DNA-Vernetzungen zurückzukehren. Die Immunkomplexe wurden weiter mit DNase- und RNase-freien Proteinase K behandelt, und die DNA wurde durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. PCR wurde mit spezifischen Primern durchgeführt, um eine Sequenz innerhalb der Promotorregion des humanen iNOS-Gens entsprechen (P1-Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; P2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expressionsstudien

Für Expressionsstudien des rekombinante Stamm L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Deutschland) mit dem Gen für EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), SSU chromosomalen integriert, in den verschiedenen Medien kultiviert wurde, wie zuvor beschrieben, und zusätzlich mit 100 mg l supplementiert^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Deutschland). Während der Kultivierung wird 1 ml-Proben wurden entnommen, zentrifugiert (2000 × g, 20 ° C, 10 min) und mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen. Pellet wurde in Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) und zerfielen durch Sonifikation mit dem Ultraschallprozessor resuspendiert UP400S (Anwendung von Energie ~ 400 Ws). Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) mit 12.5% ​​polyacralamide Gele - Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (6000 × g, 4 ° C, 5 min) und analysiert durch Natriumdodecylsulfat entfernt . EGFP-Expression wurde in einer gerührten Kultur untersucht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatinimmunpräzipitation

Der Chromatinimmunpräzipitation Test wurde durchgeführt, um den Chip-IT mit^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Herstelleranweisungen mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, differenzierte menschliche Podocyten wurden mit 1% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur vernetzt. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und die Fixierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Die Zellen wurden erneut mit eiskaltem PBS gewaschen und von der Schale abgekratzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und im Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Kerne in dem Scherpuffer resuspendiert, auf Eis für 30 Minuten inkubiert und das Chromatin wurde durch Beschallung, z UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Deutschland) bei 25% Leistung 5 Pulse von je 20 sec auf Eis in Fragmente von ca. 200-600 bp. Das gescherte Chromatin wurde dann zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Für Immunopräzipitationen wurden 60 & mgr; l Chromatin mit 1 & mgr; g Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF- & kgr; B p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF- & kgr; B p50 (Abcam) -Antikörpern oder mit Kaninchen inkubiert IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), als Negativkontrolle, über Nacht bei 4ºC unter leichter Rotation. Immunkomplexe, die an magnetische Kügelchen gebunden waren, wurden unter Verwendung eines magnetischen Ständers gesammelt, gründlich gewaschen und die Protein / DNA-Vernetzungen wurden umgekehrt und die DNA für die Echtzeit-PCR-Analyse eluiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-Präparation für die Chip-Array-Analyse

Anordnung von Zelllysaten und extrahierte DNAs
Bakterienpellets in PBS auf die gewünschte Endkonzentration suspendiert wurden, behandelt mit Ultraschall-Disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Deutschland) ausgestattet mit einer Mikrospitze MS1 (1 mm Durchmesser). Die Betriebsfrequenz betrug 30 kHz und die effektive Ausgangsleistung betrug 100 W. Während des Betriebs wurden die Proben in einem Eiswasserbad gekühlt, gemischt und zentrifugiert. Die Proben wurden für Durchflusszytometrie-Untersuchungen verwendet, während die Proben zur späteren Handhabung einer Wärmebehandlung (95 ° C, 5 min) unterzogen wurden. Die rohen Zelllysate wurden mit einer Mischung von Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) verarbeitet. Ein gleiches Volumen dieses Gemisches wurde zu der Lysatprobe gegeben, die Lösung wurde 15 s kräftig gevortext und bei 15.000 xg für 2 min bei Raumtemperatur (RT) bei etwa 22 ° C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, die die genomische DNA enthielt, wurde sorgfältig getrennt und in einem neuen sterilen Eppendorf-Röhrchen gesammelt.
Anschließend wurden die Proben mit Ultraschall behandelt, um die DNA zu fragmentieren. Der Ultraschallschritt wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Um die Fragmentierungseffekte auf die genomische DNA zu bewerten, wurden die Proben unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese analysiert.
(…) Die Proben, die zuvor für 2,5 min beschallt worden waren, wurden nach Wärmebehandlung und Zentrifugation einem Extraktionsschritt unterzogen. Die freigesetzte DNA wurde zweimal mit einem Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Gemisch extrahiert und danach einer zweiten Ultraschallbehandlung für 0 bis 15 Minuten unterzogen. Die Agarose-Gelelektrophorese wurde verwendet, um die Größenverteilung der DNA zu bestimmen, die der Ultraschall-Fragmentierung nach der Extraktion unterzogen wurde (Fig. Oben rechts). Stark fragmentierte DNA wurde von der Anwesenheit eines DNA-Abstrichs anstelle von Bändern mit hohem Molekulargewicht, die aus 2,5 min oder länger beschallten Proben eliminiert wurden, ersichtlich. Bei längerer Beschallung wurden die Fragmentlängen allmählich auf etwa 150-600 bp reduziert, und die Beschallung für 15 Minuten führte zu einer weiteren Degradation dieser Fragmente, wie dies hauptsächlich im oberen Teil des Abstrichs zu sehen ist. Somit nahm die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße mit der Ultraschallzeit allmählich ab und die 5-minütige Behandlung erlaubte es, die Größen von DNA-Fragmenten zu erhalten, die für Chip-Array-Assays am besten geeignet waren. Zuletzt wurde das DNA-Analyt-Herstellungsverfahren, umfassend eine erste 2-minütige Ultraschallbehandlung, DNA-Extraktion (2 ×) und anschließende 5-minütige Beschallung, etabliert. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

HEK293-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und mit 2 mM Disuccinimidylglutarat für 45 min bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Chromatin wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1% (V / V) Formaldehyd vernetzt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Inkubation mit Glycin bei einer Endkonzentration von 0,125 M für 5 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt. Nach Inkubation mit Trypsin wurden die Zellen von der Zellkulturschale abgekratzt und zweimal mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% (Vol./Vol.) Nonidet P-40) resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Kerne durch Zentrifugation (3500 × g, 5 min, 4 ° C) pelletiert und in Zellkernpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA und 1% (Gew./Vol.) SDS) resuspendiert. Die Kerne wurden durch Beschallung mit drei 20-s-Pulsen in a aufgeschlossen UP50H Beschallungsgerät (Hielscher Ultraschall Technologie) bei einer Einstellung von 0,5 Zyklus und Amplitude von 30%, wodurch man genomische DNA-Fragmente mit einer Volumengröße von 200 bis 1000 bp. Für CHIP, 50 g DNA wurde 4-fach in Immunpräzipitations-Puffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 und 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histon-Modifikations Analyse durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

Kurz gesagt, 6 x 10⁶ Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 15 min bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd auf der Kulturplatte vernetzt. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,125 M Glycin gestoppt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 48 ° C durchgeführt. Alle Puffer waren vorgekühlt und enthielten Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche). Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann abgekratzt. Die gesammelten Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) gelöst und in einem kalten Ethanolbad 10 Zyklen bei 100% Amplitude unter Verwendung von Ultraschall behandelt UP50H Beschallungsgerät (Hielscher, Teltow, Deutschland). Chromatin-Fragmentierung wurde in 1% Agarose-Gel sichtbar gemacht. Erhaltenen Fragmente wurden in den 200-500pb Bereich. Lösliche Chromatin wurde bei 48 ° C für 10 min mit Ultraschall behandelt, durch Zentrifugieren der Proben bei 14000 erhalten. Die lösliche Fraktion wurde 1/10 in Verdünnungspuffer (8, 150 mM NaCl 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH) verdünnt, dann bei 80 ° C bis zur Verwendung in Aliquots aufgeteilt und gespeichert. (Rodriguez et al. 2008)