Plasmidpräparation mittels Ultraschall

Die Ultraschallbehandlung ist ein zuverlässiges Verfahren zur Fragmentierung von Plasmid-DNA. Eine präzise einstellbare Amplitude, ein Pulsmodus und eine Temperaturkontrolle sind die wichtigsten Merkmale eines Ultraschallgeräts für eine schonende Plasmidfragmentierung. Zusätzlich trägt der Einsatz bestimmter Zusätze zum Schutz vor Plasmidabbau bei. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Lösungen für die kontrollierte Plasmidfragmentierung in einzelnen Probengefäßen sowie für die gleichzeitige Beschallung zahlreicher Proben und von Multiwell-Platten. Erfahren Sie mehr über die erfolgreiche Plasmidfragmentierung mittels Ultraschall!

Scherung von Plasmiden mittels Ultraschall

Werden DNA-Proben Ultraschallwellen ausgesetzt, erzeugen die ultraschallinduzierten Schwingungen akustische Kavitation in der Flüssigkeit, die hochmolekulare DNA-Moleküle durch mechanische Kräfte schert oder aufbricht. Die Beschallung ist die am häufigsten eingesetzte Methode für Versuche zur Scherung größerer DNA-Mengen, einschließlich Anwendungen wie der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei denen kleine Fragmentgrößen für eine hohe Auflösung entscheidend sind. (Vgl. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) ist eine spezifische Form der DNA, die sich durch ihre Ringform auszeichnet und in Bakterien sowie einigen Eukaryoten vorkommt.
Superhelikale pDNA ist die gewünschte Form der Plasmid-DNA, da sie in nachgelagerten Prozessen wie der automatisierten Sequenzierung und der Transfektion die besten Ergebnisse liefert. Die Ultraschallbehandlung eignet sich zur erfolgreichen Fragmentierung von pDNA, einschließlich superhelikaler pDNA.
Thompson et al. (2008) zeigten, dass die Beschallung von Plasmiden, die bekanntermaßen superhelikale DNA fragmentiert, eine wirksame Methode zur Verbesserung der phred20-Leselängen bei der Sequenzierung ist. Diese lassen sich damit so weit verbessern, dass sie sich nicht mehr signifikant von den Leselängen unterscheiden, die mit der Kontrollvorlage von Beckman Coulter oder enzymatisch linearisierten Plasmiden erzielt werden.

Verwendung von Plasmidvektoren

Plasmide werden häufig als Werkzeuge zur Klonierung, Übertragung und Manipulation von Genen eingesetzt. Werden Plasmide experimentell für diese Zwecke verwendet, bezeichnet man sie als Vektoren. DNA-Fragmente oder Gene können in einen Plasmidvektor eingefügt werden, wodurch ein sogenanntes rekombinantes Plasmid entsteht. Plasmidvektoren dienen als Transportmittel, um rekombinante DNA in eine Wirtszelle einzuschleusen, und sind ein zentraler Bestandteil der molekularen Klonierung.
„Nichtvirale Vektoren werden hinsichtlich ihres potenziellen Einsatzes in der Gentherapie zur Behandlung verschiedener komplexer Erkrankungen intensiv untersucht. Nichtvirale Vektoren schützen Plasmid-DNA vor physikalischem, chemischem und enzymatischem Abbau und transportieren das DNA-Molekül zum Zielort. Beispielsweise bilden kationische Liposomen, Chitosan und andere positiv geladene Nanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen Komplexe mit Plasmid-DNA. Die leicht entstehenden Komplexe aus kationischen Liposomen und Plasmid-DNA sind jedoch relativ groß (d. h. 300–400 nm) und heterogen, was ihren Einsatz in pharmazeutischen Anwendungen erschwert. Die großen und heterogenen Plasmid-DNA/Liposomen-, Plasmid-DNA/Aerosol- und Plasmid-DNA/Peptid-Komplexe können mittels Ultraschall zu kleineren, homogenen Partikeln zerkleinert werden.“ (Sarker et al., 2019)
Ein bekanntes Beispiel für die Verwendung von Plasmidvektoren ist CRISPR–Cas9. Das CRISPR–Cas9-System wird üblicherweise als einzelnes großes Plasmid oder als mehrere kleinere Plasmide in Zellen eingebracht. Diese Plasmide kodieren eine Zielsequenz, einen CRISPR-Guide und Cas9.

Ultraschallgestützte Herstellung DNA-beladener PLGA-Nanopartikel durch Nanopräzipitation

Jo et al. (2020) verwendeten Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA), um einen Nanopartikelträger für das Einbringen eines CRISPR–Cas9-Modellplasmids in primäre, aus Knochenmark gewonnene Makrophagen herzustellen. Für die Nanopräzipitation der PLGA-Nanopartikel wurde PLGA mit zwei unterschiedlichen Endgruppen (Ester- und Amingruppen) eingesetzt. Dabei sollten die positiv geladenen Aminendgruppen aufgrund der Ladungswechselwirkungen mit dem negativ geladenen DNA-Rückgrat die Verkapselungseffizienz und die Beladung erhöhen. In einem konischen 50-mL-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen wurden 100 mg Pluronic F127 in 20 mL autoklaviertem deionisiertem Wasser durch Mischen auf einem Vortexmischer und anschließende schonende Beschallung für 30 min in einem Ultraschallbad gelöst (siehe CupHorn). Ein autoklavierter Magnetrührstab (englisch: stirring bar) wurde hinzugegeben und die Lösung bei 600 RPM für 30 min gemischt, während die anderen Lösungen hergestellt wurden. Um die unspezifische Adsorption von DNA zu minimieren, wurden durchgehend Laborgefäße aus Kunststoff anstelle von Glas verwendet. Lösungen von PLGA in DMF (44,48 mg/ml) und TIPS-Pentacen in THF (0,667 mg/ml) wurden getrennt hergestellt. Das PLGA wurde zur Benetzung für 30 min ohne Bewegung in DMF belassen, bevor es für 30 min beschallt wurde. (Das vollständige Protokoll findet sich bei Jo et al., 2020.)

Schutz von Plasmid-DNA während der Beschallung

DNA, einschließlich Plasmiden und superhelikalen Plasmiden, ist sehr anfällig für Abbau. Alle verfügbaren Fragmentierungsmethoden weisen bekanntermaßen bestimmte Nachteile auf. Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall gehört zu den bevorzugten Methoden, da eine kontrollierte Beschallung in Kombination mit Schutzmaßnahmen die scher- und hitzebedingte Schädigung der DNA-Stränge verringern kann.
Neben niedrigen Amplitudeneinstellungen, dem Pulsmodus und der Temperaturkontrolle während der DNA-Scherung mittels Ultraschall zeigte auch der Einsatz bestimmter Zusätze eine deutliche Schutzwirkung gegen den DNA-Abbau. Beispielsweise schützen verschiedene Polymere, Peptide und Lipide die Plasmid-DNA während der Ultraschallbehandlung.

Die Stabilität von Plasmid-DNA und Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexen gegenüber ultraschallinduzierten Scherbelastungen wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Sowohl die Plasmid-DNA als auch die Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe wurden unterschiedlich lange ultraschallinduzierten Scherbelastungen ausgesetzt. Die Plasmid-DNA wurde für 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten ultraschallinduzierten Scherbelastungen ausgesetzt. Die Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe hingegen wurden für 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten ultraschallinduzierten Scherbelastungen ausgesetzt.
(Studie und Abbildung: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) zeigten, dass nach einer ultraschallinduzierten Scherbelastung der Nanostrukturen aus Plasmid-DNA und ionischer Flüssigkeit (pDNA/IL) für 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 min sowie der Komplexierung mit dem handelsüblichen kationischen Gentransferreagenz Lipofectamine der Anteil fluoreszenzpositiver Zellen jeweils 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% und 50% betrug (siehe Diagramm unten). Der Anteil fluoreszenzpositiver Zellen stieg an, wenn die Nanostrukturen für 10 und 20 min ultraschallinduzierten Scherbelastungen ausgesetzt wurden, und nahm danach langsam ab.

Einfluss der ionischen Flüssigkeit [Bmim][PF6] auf das Einbringen von Plasmid-DNA in COS7-Zellen. Nanokomplexe aus Plasmid-DNA und ionischer Flüssigkeit (IL) wurden bis zu 120 Minuten ultraschallinduzierten Scherbelastungen ausgesetzt und vor dem Einbringen in COS7-Zellen mit LA komplexiert. Die Daten zeigen die durchschnittliche Anzahl (%) GFP-positiver HeLa-Zellen, die in 10 verschiedenen mikroskopischen Gesichtsfeldern gezählt wurden. Das Experiment wurde an drei verschiedenen Tagen mehrfach durchgeführt. (Studie und Diagramm: ©Sarker et al., 2019)

Lysatpräparation mittels Ultraschall

Protokoll zur Zelllyse mittels Ultraschall
Beginnen Sie mit einer angereicherten Zellprobe, die mithilfe eines Zelltrennverfahrens hergestellt wurde (z. B. immunmagnetische Zellseparation, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), Dichtegradientenzentrifugation, immunbasierte Dichte-Zellisolation).
Die Zellproben müssen ein Volumen an Lysepuffer enthalten, das für das Versuchsziel und das verwendete Ultraschallgerät mit Sonotrode geeignet ist.
Hypotone Puffer werden bevorzugt, da sie die ultraschallgestützte Zelllyse fördern. Wichtig ist, dass Zusätze und Salzkonzentration angemessen gewählt werden.
Wählen Sie Ihr Ultraschallgerät für die Lyse: Für die indirekte Beschallung von Probengefäßen werden der VialTweeter oder der CupHorn empfohlen. Für Multiwell-Platten ist der UIP400MTP das ideale Ultraschallgerät. Für die klassische Beschallung mit einer Sonotrode eignen sich Ultraschallhomogenisatoren wie der UP100H oder der UP200Ht mit einer Mikrospitze am besten.
Protokoll für die Beschallung mit einer Sonotrode: Tauchen Sie die Sonotrode des Ultraschallgeräts in die Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein und beschallen Sie diese etwa 10 Sekunden lang. Je nach DNA-Probe kann die Beschallung ein- oder zweimal wiederholt werden. Der erforderliche Ultraschallenergieeintrag (Ws/mL) hängt von der Probenviskosität und dem DNA-Typ ab. Die Kühlung im Eisbad und der Pulsmodus des Ultraschallgeräts tragen dazu bei, einen thermischen Abbau der Probe zu verhindern.
Nach der Ultraschalllyse wird die Probe zentrifugiert, um die als Pellet vorliegenden Rückstände abzutrennen, die nicht lysierte Zellen, Zellkerne und nicht lysierte Organellen enthalten.
Wird die Probe nicht unmittelbar weiterverarbeitet, kann sie bei einer geeigneten Temperatur gelagert werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Ultraschallgeräte für die DNA-Fragmentierung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Plattformen zur Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin. Dazu gehören Ultraschallsonden (Sonotroden), Lösungen zur indirekten Beschallung für die gleichzeitige Probenvorbereitung in mehreren Röhrchen oder Multiwell-Platten (z. B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten), Sonoreaktoren und Ultraschall-CupHorns. Alle Plattformen zur DNA-Scherung werden von frequenzabgestimmten Hochleistungs-Ultraschallprozessoren angetrieben, die präzise kontrollierbar sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Ultraschallprozessoren für jede Probenanzahl und Probengröße

Mit den Mehrproben-Ultraschallgeräten von Hielscher, dem VialTweeter (für bis zu 10 Probenröhrchen) und dem UIP400MTP (für Mikroplatten/Multiwell-Platten), lässt sich die Probenverarbeitungszeit durch intensive und präzise kontrollierbare Ultraschallbehandlung einfach verkürzen. Gleichzeitig werden die gewünschte Größenverteilung und Ausbeute der DNA-Fragmente erzielt. Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall macht die Schritte der Plasmidpräparation effizient, zuverlässig und skalierbar. Bei konstanten Ultraschallparametern lassen sich Protokolle linear von einer auf zahlreiche Proben skalieren.
Ultraschallgeräte mit Sonotroden mit einem bis fünf Fingern eignen sich ideal für die Präparation kleinerer Probenzahlen. Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind in verschiedenen Leistungsstufen erhältlich, sodass Sie das ideale Ultraschallgerät für den Aufschluss bei Ihrer DNA-bezogenen Anwendung auswählen können.