Ultraschall ist eine zuverlässige Methode zur Fragmentierung von Plasmid-DNA. Genau steuerbare Amplitude, Pulsationsmodus und Temperaturkontrolle sind die wichtigsten Merkmale eines Ultraschallgeräts für eine schonende Plasmidfragmentierung. Darüber hinaus bestimmte Additive verwendet werden, welche das Plasmid vor einer unerwünschten Degradation schützen. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Lösungen für die kontrollierte Plasmidfragmentierung von einzelnen Vials, für die gleichzeitige Beschallung zahlreicher Proben sowie von Multiwell-Platten. Erfahren Sie mehr über erfolgreiche Plasmidfragmentierung mit Ultraschall!

Fragmentierung von Plasmiden mittels Ultraschall

Wenn DNA-Proben mit Ultraschallwellen behandelt werden, erzeugen die durch den Ultraschall erzeugten Vibrationen akustische Kavitation in der Flüssigkeit. Ultraschall-Kavitation kann DNA-Moleküle mit hohem Molekulargewicht durch mechanische Kräfte aufbrechen und fragmentieren. Ultraschall ist die am weitesten verbreitete Methode für Experimente, bei denen größeren DNA-Mengen fragmentiert werden müssen. Dazu gehören u.a. Anwendungen wie die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei denen eine kleine Fragmentgrößen absolut entscheidend sind, um eine hohe Auflösung zu erzielen. (vgl. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) ist eine spezielle Form der DNA, die durch ihre Ringform gekennzeichnet ist und in Bakterien und einigen Eukaryoten vorkommt.
Superspiralisierte (supercoiled) pDNA ist die erwünschte Form von Plasmid-DNA, da sie bei nachgelagerten Prozessen wie der automatischen Sequenzierung und Transfektion die besten Ergebnisse liefert. Die Ultraschallbehandlung eignet sich zur erfolgreichen Fragmentierung von pDNA, einschließlich supercoiled pDNA.
Thompson et al. (2008) wiesen nach, dass die Plasmid-Ultraschallbehandlung, von der bekannt ist, dass sie superspiralisierte DNA fragmentiert, eine wirksame Methode ist, um die Leselängen der Sequenz phred20 so weit zu verbessern, dass sie sich nicht signifikant von der Kontrollvorlage von Beckman Coulter oder enzymatisch linearisierten Plasmiden unterscheiden.

Verwendung von Plasmid-Vektoren

Plasmide werden häufig als Werkzeuge zum Klonen, Übertragen und Manipulieren von Genen verwendet. Werden Plasmide für diese Zwecke experimentell eingesetzt, werden sie als Vektoren bezeichnet. DNA-Fragmente oder Gene können in einen Plasmidvektor eingefügt werden, wodurch ein so genanntes rekombinantes Plasmid entsteht. Plasmidvektoren werden als Vehikel verwendet, um rekombinante DNA in eine Wirtszelle einzuschleusen, und sind eine Schlüsselkomponente des molekularen Klonens.
„Nichtvirale Vektoren werden ausgiebig auf ihren möglichen Einsatz in der Gentherapie zur Behandlung verschiedener komplizierter Krankheiten untersucht. Nichtvirale Vektoren schützen die Plasmid-DNA vor physikalischer, chemischer und enzymatischer Zersetzung und bringen das DNA-Molekül an den Zielort. So bilden beispielsweise kationische Liposomen, Chitosan und andere positiv geladene Nanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen Komplexe mit Plasmid-DNA. Die leicht zu bildenden kationischen Liposomen/Plasmid-DNA-Komplexe sind jedoch relativ groß (d. h. 300-400 nm) und heterogen, was ihre Verwendung in pharmazeutischen Anwendungen erschwert. Die großen und heterogenen Plasmid-DNA/Liposomen-, Plasmid-DNA/Aerosol- und Plasmid-DNA/Peptid-Komplexe können mittels Ultraschall zu kleineren und homogenen Partikeln reduziert werden.“ (Sarker et al., 2019)
Ein bekanntes Beispiel für die Verwendung von Plasmidvektoren ist CRISPR-Cas9. Das CRISPR-Cas9-System wird den Zellen in der Regel als einzelnes großes Plasmid oder als mehrere kleinere Plasmide zugeführt, welche eine Zielsequenz, einen CRISPR guide und Cas9 kodieren.

Ultraschall-gestützte Produktion von DNA-beladenen PLGA-Nanopartikeln

Jo et al. (2020) verwendeten Poly(lactid-co-glykolsäure) (PLGA), um einen Nanopartikelträger für die Übertragung eines CRISPR-Cas9-Plasmids in primäre Makrophagen aus dem Knochenmark herzustellen. Für die Nanopräzipitation (Fällungsreaktion zur Herstellung von Nanopartikeln) von PLGA-Nanopartikeln wurde PLGA mit zwei verschiedenen Endgruppen (Ester- und Amingruppen) verwendet, wobei die positiv geladenen Amin-Endgruppen die Verkapselungseffizienz und die Beladung aufgrund der Ladungswechselwirkungen zwischen ihnen und dem negativ geladenen Rückgrat der DNA erhöhen sollten. In einem konischen 50-mL-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 100 mg Pluronic F127 in 20 mL autoklaviertem DI-Wasser durch Vortex-Mischen gelöst, gefolgt von 30 Minuten milder Beschallung in einem Ultraschallbad (siehe CupHorn). Ein autoklavierter Magnetrührer wurde eingesetzt, und die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 600 U/min gemischt, während die anderen Lösungen hergestellt wurden. Um die unspezifische Adsorption von DNA zu minimieren, wurden durchgängig Kunststoff- statt Glasgefäße verwendet. Die Lösungen von in DMF gelöstem PLGA (44,48 mg/ml) und in THF gelöstem TIPS-Pentacen (0,667 mg/ml) wurden getrennt hergestellt. Das PLGA wurde 30 Minuten lang in DMF in Ruhe durchfeuchtet, bevor es 30 Minuten lang beschallt wurde (vollständiges Protokoll siehe Jo et al., 2020).

Schutz der Plasmid-DNA während der Beschallung

DNA, einschließlich Plasmide und superspiralisierte Plasmide, sind sehr empfindlich gegenüber Schädigung und Zersetzung. Alle verfügbaren Fragmentierungsmethoden sind für gewisse Nachteile bekannt. Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall ist eine der bevorzugten Methoden, da eine kontrollierte Beschallung in Kombination mit Schutzmaßnahmen die scher- und hitzebedingte Schädigung von DNA-Strängen verringern kann.
Neben niedrigen Amplitudeneinstellungen, einem Pulsmodus und der Temperaturkontrolle beim Scheren der DNA mit Ultraschall zeigte die Verwendung bestimmter Wirkstoffe eine signifikante Schutzwirkung gegen den DNA-Abbau. So schützen beispielsweise verschiedene Polymere, Peptide und Lipide die Plasmid-DNA während der Ultraschallbehandlung.

Die Stabilität von Plasmid-DNA und Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexen unter Ultraschall-Scherung wurde mit Hilfe eines Agarosegel-Elektrophorese-Tests untersucht. Sowohl die Plasmid-DNA als auch die Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe wurden für verschiedene Zeitspannen beschallt. Die Plasmid-DNA wurde 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Die Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe wurden hingegen 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten deutlich länger Ultraschall-Scherung ausgesetzt.
(Studie und Bild: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) wiesen nach, dass der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 % bzw. 50 % betrug, wenn die Nanostrukturen aus Plasmid-DNA und ionischer Flüssigkeit (pDNA/IL) 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten lang einer Ultraschallscherung ausgesetzt und mit dem handelsüblichen kationischen Gentransportmittel Lipofectamin komplexiert wurden (siehe nachstehende Grafik). Der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen stieg an, wenn die Nanostrukturen 10 und 20 Minuten lang einer Ultraschall-Scherung ausgesetzt wurden, und nahm danach langsam ab.

Einfluss der ionischen Flüssigkeit [Bmim][PF6] auf den Transport von Plasmid-DNA in COS7-Zellen. Plasmid-DNA/IL (ionische Flüssigkeit)-Nanokomplexe wurden bis zu 120 Minuten lang Ultraschall-Scherung ausgesetzt und mit LA komplexiert, bevor sie in COS7-Zellen eingebracht wurden. Die Daten zeigen die durchschnittliche Anzahl (%) der GFP-positiven HeLa-Zellen, die in 10 verschiedenen mikroskopischen Feldern gezählt wurden; das Experiment wurde an drei verschiedenen Tagen mehrfach durchgeführt. (Studie und Grafik: ©Sarker et al., 2019)

Vorbereitung von Lysaten mit Ultraschall

Protokoll zur Zelllyse mit Ultraschall
Beginnen Sie mit einer angereicherten Zellprobe, die mit einem Zellseparationsverfahren hergestellt wurde (z. B. immunomagnetische Zellseparation, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), Dichtegradientenzentrifugation, Isolierung von Zellen mit Immundichte).
Die Zellproben müssen ein gewisse Konzentration eines Lysepuffers aufweisen, das für den Versuchsaufbau und das Ultraschallverfahren geeignet ist.
Hypotone Puffer werden bevorzugt, da sie den ultraschall-gestützten Zellaufschluss verstärken. Es ist wichtig, dass die Zusatzstoffe und die Salzkonzentration in geeigneter Weise verwendet werden.
Wählen Sie Ihr Ultraschallgerät für den Zellaufschluss: Für die indirekte Beschallung von Vial und Röhrchen sind der VialTweeter oder das CupHorn empfehlenswert. Für Multiwell-Platten ist der UIP400MTP das ideale Ultraschallgerät. Und für die klassische Beschallung mit einem Ultraschallstab (Ultraschallfinger / Ultraschallspitze) sind Ultraschallhomogenisatoren wie der UP100H oder UP200Ht mit einer Mikrospitze am besten geeignet.
Protokoll für die ultraschall-gestützte Lyse mit einem Ultraschallstab: Tauchen Sie die Ultraschallspitze in die Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen und beschallen Sie es mit 2-3 Ultraschallpulsen von je 5 Sekunden (cycle mode 50%). Je nach DNA-Probe kann die Beschallung ein oder zwei weitere Male wiederholt werden. Die erforderliche Ultraschallenergie (Ws/ml) hängt von der Viskosität der Probe und dem DNA-Typ ab. Die Kühlung mittels eines Eisbads und der Pulsationsmodus des Ultraschallgeräts helfen zu verhindern, dass die Probe thermisch zersetzt wird.
Nach der Ultraschall-Lyse wird die Probe zentrifugiert, um die Pellettrümmer (die nichtlysierte Zellen, Kerne und nichtlysierte Organellen enthalten) abzutrennen.
Wenn die Probe nicht sofort weiterverarbeitet wird, kann sie bei einer geeigneten Temperatur gelagert werden, um ihre Funktionsfähigkeit zu erhalten.

Ultraschallgeräte für die DNA-Fragmentierung

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene ultraschallbasierte Plattformen für die Fragmentierung von DNA, RNA und Chromatin an. Zu diesen verschiedenen Plattformen gehören Ultraschallsonotroden (Ultraschallstabschwinger), indirekte Beschallungslösungen für die gleichzeitige Probenvorbereitung von mehreren Gefäßen sowie Multiwell-Platten (z.B. 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten), Sonoreaktoren und Ultraschall-Cuphörner. Alle Plattformen für das Scheren von DNA werden von niederfrequenten Hochleistungs-Ultraschallprozessoren angetrieben, die präzise steuerbar sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Ultraschallprozessoren für jede Probenanzahl und -größe

Mit Hielschers Multiproben-Ultraschallgeräten VialTweeter (für bis zu 10 Reagenzgefäße) und UIP400MTP (für Mikrotiterplatten/Multiwell-Platten) ist es leicht möglich, die Probenverarbeitungszeit durch intensive und präzise steuerbare Ultraschallbehandlung zu reduzieren und gleichzeitig die gewünschte DNA-Fragmentgrößenverteilung und -ausbeute zu erzielen. Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall macht die Plasmidpräparation effizient, zuverlässig und skalierbar. Die Protokolle können durch Anwendung konstanter Ultraschallparameter linear von einer bis zu zahlreichen Proben skaliert werden.
Sonotroden-Ultraschallgeräte, welche eine Spitze bis hin zu funf Spitzen haben können, sind ideal für die Vorbereitung einer kleineren Probenanzahl (dafür aber höheres Volumen pro Einzelprobe). Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind in verschiedenen Leistungsstufen erhältlich, so dass Sie den idealen Ultraschall-Disruptor für Ihre DNA-basierte Anwendung wählen können.