Protokoll zur Inaktivierung des SARS-CoV-2-Coronavirus mittels Ultraschall

Der Hielscher VialTweeter ist eine einzigartiges Ultraschallgerät für die effiziente Probenvorbereitung von mehreren Proben gleichzeitig. Der VialTweeter wir u.A. zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-COV-2 verwendet. Der VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Präparation von bis zu 10 Probenfläschchen und ist damit die ideale Einheit für die gleichzeitige Verarbeitung von mehreren Proben unter den gleichen Bedingungen.

Inaktivierung des SARS-CoV-2-Coronavirus mit dem VialTweeter

Nach dem Entfernen des Fixiermittels werden die Monolayers dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (engl. phosphate-buffered saline, PBS) gewaschen, bevor die Zellen in 1 ml MEM / 5% FBS geschabt werden und mit dem Hielscher Ultraschallprozessor UP200St mit VialTweeter beschallt werden (3 × 10 Sek. an, 10 Sek., bei 100% Leistung und Amplitude). Die Überstände werden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3000 × g geklärt. Lesen das vollständige Protokoll hier für die Inaktivierung des SARS-CoV-2-Coronavirus von Welch et al. (2020) unten:

Zellen und Virus

Vero E6 Zellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) wurden in modifiziertem Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) unter Zugabe von 10% (v/v) fötalem Kälberserum (engl. fetal calf serum; FCS) kultiviert. Das verwendete Virus war der SARS-CoV-2-Stamm hCOV-19/England/2/2020, der am 29.01.2020 von der Public Health England (PHE) aus dem ersten Patientencluster in Großbritannien isoliert wurde. Dieses Virus wurde in der ersten Passage gewonnen und in der zweiten und dritten Viruspassage für Inaktivierungsstudien verwendet.
Reagenzien und Chemikalien, die zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 verwendet wurden sowie weiterführende Informationen zur Zytotoxizität der Reagenzien entnehmen Sie bitte der wissenschaftlichen Studie von Welch et al. (2020).

Virusinaktivierung mittels Detergenzien – SARS-CoV-2-Coronavirus-Inaktivierungsprotokoll von Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Inaktivierung

Für kommerzielle Produkte werden die Proben mit dem Virus (Gewebekulturflüssigkeit, Titer von 1 × 10⁶ auf 1 × 10⁸ PFU/ml) wurden in dreifacher Ausfertigung mit Reagenzien in den Konzentrationen und Kontaktzeiten behandelt. Hierbei werden die Angaben in den Gebrauchsanweisungen der Hersteller oder die Konzentrationen und Zeiten angewendet, die von den Prüflaboratorien vorgegeben werden. Wenn vom Hersteller ein Konzentrationsbereich angegeben wurde, wurde das niedrigste Verhältnis von Produkt zu Probe getestet (d.h. die niedrigste empfohlene Konzentration des Testprodukts). Reagenzien für Probentransportröhrchen wurden mit einem Volumenverhältnis von 1:10 von Gewebekulturflüssigkeit zu Reagenz getestet, außer der Hersteller gibt ein Volumenverhältnis von Probenflüssigkeit zu Reagenz an. Detergenzien, Fixiermittel und Lösungsmittel wurden bei den angegebenen Konzentrationen für die angegebenen Zeiten getestet. Alle Inaktivierungsschritte wurden bei Raumtemperatur (18 - 25°C) durchgeführt. Zum Testen alternativer Probentypen wurde das Virus im Verhältnis 1:9 in die angegebene Probenmatrix gespikt und dann wie oben beschrieben mit Testreagenzien behandelt. Alle Experimente umfassten dreifache Kontrollproben, die anstelle des Testreagenzes mit einem äquivalenten Volumen an PBS behandelt wurden. Unmittelbar nach der erforderlichen Kontaktzeit wurden 1 ml der behandelten Probe unter Verwendung der entsprechend ausgewählten Filtrationsmatrix verarbeitet. Die Reagenzentfernung für Inaktivierungstests wurde in einer größeren Spin Column unter Verwendung von Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) oder mittes Befüllen leerer 10mL Pierce Zentrifugensäulen mit SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR oder Sephadex LH-20 durchgeführt, so dass 4mL gepackte Beads/Harz entstehen. Zur Reinigung mittels Amicon-Filtern wurden 2 × 500μl Proben mit zwei Zentrifugalfiltern nach der zuvor beschriebenen Methode gereinigt und dann zusammengeführt. Für die Entfernung von Formaldehyd und Formaldehyd mit Glutaraldehyd wurde ein Filter mit 1 × 500μl Probenvolumen verwendet, nach der Verarbeitung in 500μl PBS resuspendiert und zu 400ul MEM/5% FBS hinzugefügt. Zur Inaktivierung von infizierten Monoschichten, wurden 12,5 cm² Küvetten mit Vero E6-Zellen (2,5 × 10⁶ Zellen/Flasche in 2,5mL MEM/5% FBS) wurden bei MOI 0,001 infiziert und bei 37°C/5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden 15 oder 60 Minuten lang mit 5 ml Formaldehyd oder Formaldehyd und Glutaraldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Das Fixiermittel wurde entfernt, und die Monolayer wurden dreimal mit PBS gewaschen, bevor die Zellen in 1 ml MEM/5% FBS abgeschagt und mit einem UP200St mit VialTweeter-Aufsatz (Hielscher Ultraschalltechnologie) beschallt wurden (3 × 10 Sekunden an, 10 Sekunden aus bei 100% Leistung und Amplitude). Die Überstände wurden durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 10 Min. geklärt.

Einzelheiten zu den Reagenzien, welche zur Inaktivierung des SARS-CoV-2-Coronavirus mit dem MultiSample-Ultrasonicator VialTweeter gemäß dem Protokoll von Welch et al. 2020 verwendet wurde

Das vollständige Protokoll einschließlich der Verwendung des Hielscher VialTweeters finden Sie hier:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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