Protokoll zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-CoV-2 mittels Ultraschallbehandlung

Der Hielscher VialTweeter ist ein einzigartiges Ultraschallgerät zur gleichzeitigen Aufbereitung mehrerer Proben, das zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-COV-2 eingesetzt wird. Der VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Aufbereitung von bis zu 10 Probengefäßen und ist damit das ideale Gerät für die Verarbeitung großer Probenzahlen.

Inaktivierung des Coronavirus SARS-CoV-2 mit dem VialTweeter

Nach dem Entfernen des Fixiermittels wurden die Zellmonolayer dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor die Zellen in 1 mL MEM/5% FBS abgeschabt und bei 100% Leistung und Amplitude (3 × 10 Sekunden ein, 10 Sekunden aus) mit dem Hielscher-Ultraschallprozessor UP200St mit VialTweeter-Aufsatz beschallt wurden. Die Überstände wurden durch Zentrifugation bei 3000 × g für 10 Minuten geklärt.

Lesen Sie nachfolgend das vollständige Protokoll zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-CoV-2 von Welch et al. (2020):

Zellen und Virus

Vero E6-Zellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) wurden in modifiziertem Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM) kultiviert, das mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (FCS) ergänzt wurde. Als Virus wurde der SARS-CoV-2-Stamm hCOV-19/England/2/2020 verwendet, der am 29/01/2020 von PHE aus dem ersten Patientencluster im Vereinigten Königreich isoliert wurde. Dieses Virus wurde in Passage 1 bezogen und in Passage 2 oder 3 für Inaktivierungsstudien verwendet.
Informationen zu den für die Inaktivierung von SARS-CoV-2 verwendeten Reagenzien und Chemikalien sowie zur Beseitigung der durch die Reagenzien verursachten Zytotoxizität finden Sie im wissenschaftlichen Bericht von Welch et al. (2020).

Virusinaktivierung durch Detergenzien – Protokoll zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-CoV-2 von Welch et al. 2020

Inaktivierung von SARS-CoV-2


Zur Prüfung kommerzieller Produkte wurden Viruspräparationen (Gewebekulturflüssigkeit mit Titern von 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁸ PFU/ml) in Dreifachansätzen mit Reagenzien behandelt. Dabei wurden die Konzentrationen und Einwirkzeiten verwendet, die in den Gebrauchsanweisungen des Herstellers empfohlen wurden, sofern diese verfügbar waren, oder die von den Prüflaboratorien ausdrücklich angefordert wurden. Wenn der Hersteller einen Konzentrationsbereich angab, wurde das niedrigste Verhältnis von Produkt zu Probe getestet (d. h. die niedrigste empfohlene Konzentration des Prüfprodukts). Reagenzien für Probentransportröhrchen wurden in einem Verhältnis von einem Volumenteil Gewebekulturflüssigkeit zu zehn Volumenteilen Reagenz getestet, sofern der Hersteller kein Volumenverhältnis von Probenflüssigkeit zu Reagenz vorgab. Detergenzien, Fixiermittel und Lösungsmittel wurden in den angegebenen Konzentrationen für die angegebenen Zeiten getestet. Alle Inaktivierungsschritte wurden bei Raumtemperatur (18 – 25°C) durchgeführt. Zur Prüfung alternativer Probentypen wurde der angegebenen Probenmatrix Virus in einem Verhältnis von 1:9 zugesetzt; anschließend erfolgte die Behandlung mit den Prüfreagenzien wie oben beschrieben. Alle Versuche umfassten scheinbehandelte Kontrollproben in Dreifachansätzen, bei denen anstelle des Prüfreagenzes ein entsprechendes Volumen PBS verwendet wurde. Unmittelbar nach Ablauf der erforderlichen Einwirkzeit wurde 1 mL der behandelten Probe mit der jeweils geeigneten Filtrationsmatrix verarbeitet. Die Entfernung der Reagenzien für die Inaktivierungstests erfolgte in einem größeren Zentrifugationssäulenformat unter Verwendung von Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) oder durch Befüllen leerer Pierce-Zentrifugationssäulen mit einem Fassungsvermögen von 10 mL (Thermo Fisher) mit SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR oder Sephadex LH-20, sodass sich ein gepacktes Volumen von 4 mL Kügelchen bzw. Harz ergab. Zur Aufreinigung mit Amicon-Filtern wurden 2 × 500 μl Probe mit zwei Zentrifugalfiltern nach der zuvor beschriebenen Methode aufgereinigt und anschließend vereinigt. Zur Entfernung von Formaldehyd sowie von Formaldehyd in Kombination mit Glutaraldehyd wurde ein Filter mit einem Probenvolumen von 1 × 500 μl verwendet. Nach der Verarbeitung wurde die Probe in 500 μl PBS resuspendiert und zu 400 ul MEM/5% FBS gegeben. Zur Inaktivierung infizierter Zellmonolayer wurden 12,5 cm²-Kulturflaschen mit Vero E6-Zellen (2,5 × 10⁶ Zellen/Kulturflasche in 2,5 mL MEM/5% FBS) bei einer MOI von 0,001 infiziert und bei 37°C/5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen mit 5 mL Formaldehyd oder Formaldehyd und Glutaraldehyd bei Raumtemperatur für 15 oder 60 Minuten fixiert. Das Fixiermittel wurde entfernt und die Zellmonolayer wurden dreimal mit PBS gewaschen, bevor die Zellen in 1 mL MEM/5% FBS abgeschabt und mit einem UP200St mit VialTweeter-Aufsatz (Hielscher Ultrasound Technology) beschallt wurden (3 × 10 Sekunden ein, 10 Sekunden aus bei 100% Leistung und Amplitude). Die Überstände wurden durch Zentrifugation bei 3000 × g für 10 Minuten geklärt.


Details zum Reagenz, das zur Inaktivierung des Coronavirus SARS-CoV-2 mit dem Ultraschallgerät VialTweeter gemäß dem Protokoll von Welch et al. 2020 verwendet wurde

Das vollständige Protokoll einschließlich der Verwendung des Ultraschallgeräts Hielscher VialTweeter finden Sie hier:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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