Hielscher Ultraschalltechnik

Ultraschall-gestützte Proben-Vorbereitung für ELISA-Assays

Assays wie der ELISA werden häufig für die In-vitro-Diagnostik, den Nachweis krankheitsbezogener Proteine und die Qualitätskontrolle (z.B. Überwachung von Lebensmittelallergenen) eingesetzt. Die ultraschall-gestützte Probenvorbereitung ist eine schnelle, zuverlässige und reproduzierbare Technik zur Lyse von Zellen und zur Isolierung intrazellulärer Proteine, DNA, RNA und Organellen. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die bequeme und effiziente Vorbereitung von Einzelproben sowie der gleichzeitigen Beschallung mehreren Röhrchen und Mikrotiterplatten und 96-Well-Platten.

ELISA – Enzym-Linked Immunosorbent-Assay

ELISA steht für Enzyme-Linked Immunosorbent Assay und ist ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren, das als biochemische Analysetechnik aus der Kategorie der Ligandenbindungs-Assays weit eingesetzt wird. Bei ELISA wird eine flüssige Probe auf eine stationäre Festphase mit speziellen Bindungseigenschaften gegeben. Normalerweise wird die stationäre Festphase als Beschichtung auf eine Well-Platte oder ELISA-Platte aufgetragen. Dann werden verschiedene flüssige Reagenzien nacheinander zugegeben, inkubiert und gewaschen, so dass schließlich eine optische Veränderung (z.B. Farbentwicklung durch das Produkt einer enzymatischen Reaktion) in der Endflüssigkeit im Well auftritt. Die optische Veränderung macht es möglich, die Menge des Analyten durch eine sogenannte quantitative „Auslesen" zu bestimmen. Für die quantitative Messung wird ein Spektrophotometer, Fluorometer oder Luminometer verwendet, um die Intensität des durchgelassenen Lichts zu erfassen und zu messen. Die Empfindlichkeit der Detektion wird durch die Signalverstärkung während der analytischen Reaktionen beeinflusst. Da Enzymreaktionen gut untersucht sind und als zuverlässige Amplifikationsprozesse eingesetzt werden können, werden Enzyme zur Erzeugung des Signals verwendet. Die Enzyme sind in festen Anteilen an die Nachweisreagenzien gebunden, um eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen, woraus sich auch die Bezeichnung "enzyme-linked" Immunosorbent-Assay ableitet.
Da ELISA-Assays normalerweise in Mikrotiterplatten / 96-Well-Platten durchgeführt werden, ist ELISA sie als plattenbasierte Assay-Technik bekannt und wird z.B. in der klinischen In-vitro-Diagnostik, Forschung, Medikamentenentwicklung etc. zum Nachweis und zur Quantifizierung von Antikörpern, Peptiden, Proteinen und Hormonen eingesetzt.
Die ELISA-Technik wird häufig als diagnostisches Werkzeug in der Medizin, Biotechnologie und Pflanzenpathologie und auch als wichtige Messmethode zur Qualitätskontrolle in verschiedenen Industriezweigen eingesetzt.

Komplettes VialTweeter-Set: VialTweeter-Sonotrode am Ultraschallprozessor UP200St

Die Ultraschall-Probenvorbereitungseinheit VialTweeter wird für die Zelllyse und Proteinextraktion vor ELISA-Tests verwendet

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Ultraschall für die Proben-Vorbereitung vor ELISA-Assays

Bevor ein ELISA-Test durchgeführt werden kann, müssen die Proben in einer mehrstufigen Prozedur vorbereitet werden, dazu gehören u.A. der Zellaufschluss (Lyse) und die Extraktion von intrazellulären Proteinen, DNA, RNA usw. Die Vorteile des Ultraschall-gestützten Zellaufschlusses und der Proteinisolierung liegen in ihrer hohen Effizienz, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit. All diese Faktoren sind wichtig, um qualitativ hochwertige Diagnostik- und Forschungsergebnisse zu erhalten.

Vorteile der Ultraschall-Lyse vor ELISA-Assays

  • Homogene Probenvorbereitung
  • Vollständige Lyse
  • Vollständige Proteinextraktion (z.B. Antikörper, DNA)
  • Optimale Anpassung der Ultraschallintensität an den Zelltyp
  • Für jedes Probenvolumen
  • reproduzierbar
  • Temperaturkontrolle
  • Automatische Datenprotokollierung auf SD-Karte

Protokoll für den prä-analytischen Ultraschall-Zellaufschluss

Probe-Typ akustische Sonde UP200St für die Lyse

  • Für Zellkulturen: Vor der Lyse der Ultraschallzellen werden die Zellen für 5 Minuten bei 270 x g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie die Zellen in 30 - 100 μL RIPA-Puffer. Anschließend wird das Zellpellet 30 Minuten lang auf Eis inkubiert.
  • Nun ist die Zellprobe bereit für die Ultraschall-Lyse:
    Verwenden Sie ein Ultraschallgerät mit Sonotrode (z.B. UP200Ht mit Sonotrode S26d2) oder ein Ultraschall-Multi-Sample-Device (z.B. den VialTweeter für die gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 Röhrchen oder den UIP400MPT für Mikrotiterplatten / 96-Well-Platten). Wählen Sie Ihr Ultraschallgerät passend zur Anzahl der Proben, die Sie vorbereiten müssen.
    Für die Beschallung einer einzelnen Probe ist ein eine Ultraschallsonotrode (auch Ultraschallstab genannt) am besten geeignet. Hierzu werden die Zellen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
  • Stellen Sie die gewünschte Beschallungsdauer, den Gesamtenergieeintrag, den Zyklusmodus und/oder die Temperaturgrenzwerte im Digitalmenü des Ultraschallgerätes ein. Dies gewährleistet eine sehr zuverlässige Beschallung und Wiederholbarkeit der Probenvorbereitung.
  • Tauchen Sie die Sonotrode in die Probe und schalten Sie das Ultraschallgerät ein. Bewegen Sie die Mikrospitze der Ultraschallsonotrode vorsichtig durch die Probe, um die Probe gleichmäßig zu beschallen.
    Für die Lyse der meisten Zellarten ist eine Beschallung mit 2-4 Zyklen à 10 Sekunden ausreichend.
  • Entfernen Sie die Sonotrode nach der Beschallung aus der Probe. Die Proben sollten für 5 Minuten auf Eis inkubiert werden. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei 10.000 x g, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Überführen Sie die Überstände in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Markieren Sie die Röhrchen mit den Analyten und lagern Sie diese bei -20°C.
  • Die Ultraschallsonotrode kann einfach gereinigt werden, indem sie die Sonotrode gründlich mit Ethanol abwischen oder die Sonotrode in einem mit Alkohol, z.B. 70%igem Ethanol, gefüllten Becherglas kurz in Betrieb nehmen. Alle Ultraschallsonotroden aus Titan sind autoklavierbar.

Für Gewebehomogenate:

  • Spülen Sie die Gewebeprobe gründlich mit eiskaltem PBS (0,01M, pH=7,4), um überschüssiges Hämolyseblut zu entfernen.
  • Das Gewebe (Niere, Herz, Lunge, Milz usw.) wird gewogen und in kleine Stücke zerkleinert, welche in PBS homogenisiert werden. Das benötigte PBS-Volumen steht im Verhältnis zum Gewicht des Gewebes. Als Faustregel gilt, dass für 1g Gewebe ca. 9mL PBS benötigt werden. Es wird empfohlen, dem PBS etwas Proteaseinhibitor zuzusetzen. (RIPA oder hypotoner Lysepuffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail können alternativ verwendet werden).
  • Je nach Gewebegrösse kann eine kurze Vortexbehandlung (ca. 1-2 Min. in 15 Sek. Pulsen) zur Vorbehandlung des Gewebes hilfreich sein.
  • Schrauben Sie eine Mikrospitze, z.B. S26d2, an Ihr Ultraschallgerät. Stellen Sie das Probenröhrchen mit dem Gewebe in ein Eisbad.
  • Beschallen Sie die Probe mit Ihrem Ultraschallgerät, z.B. UP200St (80% Amplitude) für 1 Min. im Pulsmodus (15 Sek. an, 15 Sek. Pause). Lassen Sie die Probe im Eisbad.
  • Die Homogenate werden anschließend zentrifugiert, um spezifische Pools (zytosolisch, nukleär, mitochondrial oder lysosomal) zu erhalten und um das Protein für die Analyse anzureichern. Durch 5-minütiges Zentrifugieren der Probe bei 5000×g wird der Überstand gewonnen.
Die Sonotrode MTP-24-8-96 verfügt über acht Ultraschallspitzen zur Beschallung der Wells von Mikrotiterplatten.

Die Sonotrode MTP-24-8-96 verfügt über acht Ultraschallspitzen zur Beschallung der Wells von Mikrotiterplatten.

Zuverlässige Temperaturkontrolle während der Beschallung

Die Probentemperatur ist ein entscheidender prozess-beeinflussender Faktor, der insbesondere bei der Behandlung biologischer Proben wichtig ist, z.B. um den thermischen Abbau von Proteinen zu verhindern. Wie alle mechanischen Probenpräparationstechniken erzeugt auch die Beschallung Wärme. Die Temperatur der Proben kann jedoch gut kontrolliert werden, wenn die Hielscher Ultraschallgeräte eingesetzt werden. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben zu überwachen und zu kontrollieren, während diese entweder mit einer Ultraschallsonotrode/-finger oder dem MultiSample-Ultrasonicator VialTweeter präanalytisch aufbereitet werden.

  1. Überwachung der Probentemperatur: Alle digitalen Ultraschallprozessoren von Hielscher sind mit einer intelligenten Software und einem steckbaren Temperatursensor ausgestattet. Verbinden Sie den steckbaren Temperatursensor mit dem Ultraschallgerät (z.B, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touch-Display können Sie im Menü des Ultraschallprozessors einen bestimmten Temperaturbereich für Ihre Probenbeschallung einstellen. Der Ultraschallprozessor stoppt automatisch, wenn die maximale Temperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den niedrigeren Wert des eingestellten Temperatur-∆ gesunken ist. Dann beginnt die Beschallung automatisch wieder. Diese intelligente Funktion hält die Probentemperatur in einem vorgegeben Bereich und verhindert hitze-induzierte Denaturierung der Proteine.
  2. Bei dem MultiSample-Ultrasonicator VialTweeter kann der Titanblock, der die Probenröhrchen aufnimmt, vorgekühlt werden. Legen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühl- oder Gefrierschrank, um den Titanblock vorzukühlen und so den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Wenn möglich, kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
  3. Verwenden Sie ein Eisbad oder Trockeneis zur Kühlung während der Beschallung. Platzieren Sie Ihr(e) Probenröhrchen während der Beschallung in einem Eisbad. Verwenden Sie für den VialTweeter eine flache, mit Trockeneis gefüllte Schale und legen Sie den VialTweeter auf das Trockeneis, so dass die entstehende Wärme schnell abgeführt werden kann.

Kunden weltweit nutzen die Hielscher Ultraschallsonotroden sowie die MultiSample-Ultrasonicators VialTweeter und UIP400MTP für ihre tägliche Probenvorbereitung in biologischen, biochemischen, medizinischen und klinischen Labors. Durch die intelligente Software und Temperaturregelung der Hielscher Ultraschallprozessoren wird die Temperatur zuverlässig geregelt und eine hitzeinduzierte Probenzersetzung vermieden. Die Ultraschall-Probenvorbereitung mit den Hielscher Ultraschallsystemen liefert höchst zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse!

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Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics stellt Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren für Mischanwendungen, Dispergierung, Emulgierung und Extraktion im Labor-, Pilot- und Industriemaßstab her.

Literatur / Literaturhinweise



Wissenswertes

Arten von ELISA-Assays

Es gibt verschiedene Arten von ELISA-Assays, die sich durch ihr Funktionsprinzip unterscheiden. Sie werden als direkter ELISA, indirekter ELISA, Sandwich-ELISA, kompetitiver ELISA und reverse ELISA bezeichnet. Im Folgenden geben wir Ihnen einen Überblick über die verschiedenen ELISA-Methoden und ihre wichtigsten Merkmale und Unterschiede.
ELISAs können als qualitative oder quantitative Tests durchgeführt werden. Qualitative Ergebnisse liefern ein einfaches positives oder negatives Ergebnis, während beim quantitativen ELISA die optische Dichte (OD) der Probe mit einer Standardkurve verglichen wird. Dabei handelt es sich in der Regel um eine serielle Verdünnung einer Lösung des Zielmoleküls mit bekannter Konzentration.

Direkter ELISA

Der direkte ELISA ist die einfachste Testform der ELISAs, bei der nur ein enzymmarkierter Primärantikörper verwendet wird und Sekundärantikörper nicht erforderlich sind. Der enzymmarkierte Primärantikörper bindet direkt an das Ziel, d.h. das Antigen. Die gepufferte Antigenlösung wird in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte (in der Regel 96-Well-Platten, ELISA-Platten) gegeben, wo sie durch Ladungswechselwirkungen an der Kunststoffoberfläche anhaftet. Wenn das an den Primärantikörper gebundene Enzym mit seinem Substrat reagiert, erzeugt es ein sichtbares Signal, das mit einem Spektrophotometer, Fluorometer oder Luminometer gemessen werden kann.

Indirekter ELISA

Für den indirekten ELISA-Test sind sowohl ein primärer Antikörper als auch ein sekundärer Antikörper erforderlich. Im Gegensatz zum direkten ELISA wird jedoch nicht der primäre Antikörper, sondern der sekundäre Antikörper mit einem Enzym markiert. Das Antigen wird an der Well-Platte immobilisiert und durch den Primärantikörper gebunden. Anschließend bindet der enzymmarkierte Sekundärantikörper an den Primärantikörper. Schließlich reagiert das an den sekundären Antikörper gebundene Enzym mit seinem Substrat und erzeugt ein sichtbares Signal, das gemessen werden kann.

Sandwich-ELISA

Während im direkten und indirekten ELISA-Test das Antigen immobilisiert und als Beschichtung auf die Oberfläche der Well-Platte aufgetragen wird, ist im Sandwich-ELISA der Antikörper auf der Kunststoffoberfläche der ELISA-Platte immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper im Sandwich-ELISA werden als Fänger-Antikörper bezeichnet. Zusätzlich zu den Fänger-Antikörpern werden im Sandwich-ELISA auch sogenannte Detektions-Antikörper benötigt. Zu den Detektionsantikörpern gehören ein unmarkierter primärer Detektionsantikörper und ein enzymmarkierter sekundärer Detektionsantikörper.
Schrittweise bindet das gesuchte Antigen an den auf der Platte immobilisierten Fängerantikörper. Dann bindet der primäre Detektionsantikörper an das Antigen. Danach bindet der sekundäre Detektionsantikörper an den primären Detektionsantikörper. Im letzten Reaktionsschritt reagiert das Enzym mit seinem Substrat und erzeugt ein sichtbares Signal, das optisch detektiert werden kann.

Kompetitiver ELISA

Der kompetitive ELISA, auch bekannt als Inhibitions-ELISA, ist die komplexeste ELISA-Methode, da er die Verwendung eines Inhibitorantigens erfordert. Jedes der drei Formate - direkter, indirekter und Sandwich-ELISA - kann an das kompetitive ELISA-Format angepasst werden. Beim kompetitiven ELISA konkurrieren das Inhibitorantigen und das nachzuweisende Antigen um die Bindung an den Primärantikörper.
Beim kompetitiven ELISA wird der unmarkierte Antikörper in Gegenwart seines Antigens, d.h. der Probe, inkubiert. Diese gebundenen Antikörper/Antigen-Komplexe werden dann in eine mit Antigen beschichtete Well-Platte gegeben.
Die Platte wird gewaschen, so dass ungebundene Antikörper entfernt werden. Der kompetitive ELISA hat seinen Namen aufgrund der Tatsache, dass je mehr Antigen in der Probe ist, desto mehr Antigen-Antikörper-Komplexe gebildet werden. Das wiederum bedeutet, dass weniger ungebundene Antikörper zur Verfügung stehen, die sich an das Antigen im Well binden, so dass die Antigene um die verfügbaren Antikörper konkurrieren müssen. Ein sekundärer Antikörper, der zum primären Antikörper passt, wird hinzugefügt. Dieser zweite Antikörper ist an das Enzym gebunden. Wenn das Substrat zugegeben wird, erzeugen die verbleibenden Enzyme ein chromogenes oder fluoreszierendes Signal.
An diesem Punkt wird die Reaktion gestoppt, um eine eventuelle Sättigung des Signals zu vermeiden.
Einige kompetitive ELISA-Kits enthalten ein enzymgebundenes Antigen anstelle eines enzymgebundenen Antikörpers. Das markierte Antigen konkurriert mit dem Probenantigen (unmarkiert) um primäre Antikörperbindungsstellen. Je weniger Antigen in der Probe, desto mehr markiertes Antigen wird im Well zurückgehalten und desto stärker ist das Signal.

Reverse ELISA

Beim Reverse ELISA werden keine Well-Platten verwendet, sondern die Antigene bleiben in der Testflüssigkeit suspendiert. Der Reverse ELISA-Test misst die Menge des über das Antigen gebundenen Antikörpers. Er wurde speziell entwickelt, um das West-Nil-Virus-Hüllprotein nachzuweisen und zu untersuchen, wie es in der Lage ist, virusspezifische Antikörper zu finden.

Für ELISA verwendete enzymatische Marker

Die nachstehende Liste enthält die gebräuchlichsten enzymatischen Marker, die in ELISA-Assays verwendet werden und es ermöglichen, die Ergebnisse des Assays anschließend zu messen.

  • OPD (O-Phenylendiamindihydrochlorid) färbt sich bernsteinfarben, um HRP (engl. horse radish peroxidase; Meerrettichperoxidase) nachzuweisen, welche oft als konjugiertes Protein verwendet wird.
  • TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin) färbt sich beim Nachweis von HRP blau und nach Zugabe von Schwefel- oder Phosphorsäure gelb.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure]-Diammoniumsalz) färbt sich beim Nachweis von HRP grün.
  • PNPP (p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz) färbt sich gelb, wenn alkalische Phosphatase nachgewiesen wird.