Ultraschall-Probenvorbereitung für ELISA-Assays

Assays wie ELISA werden häufig in der In-vitro-Diagnostik, zum Nachweis krankheitsbezogener Proteine und zur Qualitätskontrolle (z. B. zur Überwachung von Lebensmittelallergenen) eingesetzt. Die Ultraschall-Probenvorbereitung ist eine schnelle, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Zelllyse und zur Isolierung intrazellulärer Proteine, DNA, RNA und Organellen. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die komfortable Vorbereitung einzelner Proben, mehrerer Probengefäße sowie von Mikrotiterplatten und 96-Well-Platten.

ELISA – Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

ELISA steht für „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay“ (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) und ist eine weitverbreitete biochemische Analysemethode aus der Kategorie der Ligandenbindungsassays. Beim ELISA wird eine flüssige Probe auf eine stationäre Festphase mit besonderen Bindungseigenschaften gegeben. Üblicherweise wird die stationäre Festphase als Beschichtung auf eine Mikrotiterplatte oder ELISA-Platte aufgebracht. Anschließend werden nacheinander verschiedene flüssige Reagenzien zugegeben, inkubiert und ausgewaschen, sodass schließlich eine optische Veränderung (z. B. eine Farbentwicklung durch das Produkt einer enzymatischen Reaktion) in der verbleibenden Flüssigkeit in der Vertiefung auftritt. Diese optische Veränderung ermöglicht es, die Menge des Analyten durch eine sogenannte quantitative „Auslesung“ zu bestimmen. Für die quantitative Auslesung wird ein Spektrophotometer, Fluorometer oder Luminometer verwendet, um die Intensität des durchgelassenen Lichts zu erfassen und zu messen. Die Nachweisempfindlichkeit wird durch die Signalverstärkung während der analytischen Reaktionen beeinflusst. Da Enzymreaktionen gut untersuchte und zuverlässige Verstärkungsprozesse sind, werden Enzyme zur Signalerzeugung eingesetzt. Die Enzyme sind in festen Verhältnissen an die Nachweisreagenzien gekoppelt, um eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen. Dies erklärt auch die Bezeichnung „enzymgekoppelter“ Immunadsorptionstest.
Da ELISA-Assays in Mikrotiterplatten / 96-Well-Platten durchgeführt werden, zählt ELISA zu den plattenbasierten Assayverfahren und wird z. B. in der klinischen In-vitro-Diagnostik, Forschung und Arzneimittelentwicklung zum Nachweis und zur Quantifizierung von Antikörpern, Peptiden, Proteinen und Hormonen eingesetzt.
Die ELISA-Technik wird häufig als diagnostisches Instrument in der Medizin, Biotechnologie und Pflanzenpathologie eingesetzt und ist auch eine wichtige Methode zur Qualitätskontrolle in zahlreichen Branchen.

Ultraschall-Probenvorbereitung vor ELISA

Bevor der ELISA-Assay durchgeführt werden kann, müssen die Proben durch Schritte wie Zelllyse und Extraktion intrazellulärer Proteine, DNA, RNA usw. vorbereitet werden. Die Vorteile der ultraschallgestützten Zelllyse und Proteinisolierung sind ihre hohe Effizienz, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit. Alle diese Faktoren sind wichtig, um qualitativ hochwertige Diagnostik- und Forschungsergebnisse zu erhalten.

Protokoll zur Ultraschall-Zelllyse vor ELISA

• Für Zellkulturen: Zentrifugieren Sie die Zellen vor der Ultraschall-Zelllyse für 5 min bei 270 x g in einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie die Zellen in 30 – 100 μL RIPA-Puffer. Inkubieren Sie das Zellpellet anschließend für 30 min auf Eis.
• Die Zellprobe ist nun bereit für die Ultraschalllyse:
  Verwenden Sie je nach Anzahl der vorzubereitenden Proben ein Ultraschallgerät mit Sonotrode (z. B. UP200Ht mit der Sonotrode S26d2) oder ein Ultraschallgerät für mehrere Proben (z. B. den VialTweeter zur gleichzeitigen Beschallung von bis zu 10 Probengefäßen oder den UIP400MPT für Mikrotiterplatten / 96-Well-Platten).
  Geben Sie die Zellen zur Beschallung einer Einzelprobe mit einer Sonotrode in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
• Stellen Sie im digitalen Menü des Ultraschallgeräts die Beschallungsdauer, den Gesamtenergieeintrag, den Zyklusmodus und/oder die Temperaturgrenzen vorab ein. Dies gewährleistet eine äußerst zuverlässige Beschallung und Wiederholbarkeit.
• Tauchen Sie die Sonotrode in die Probe und schalten Sie das Ultraschallgerät ein. Bewegen Sie die Mikrospitze der Sonotrode vorsichtig durch die Probe, um diese gleichmäßig zu beschallen.
  Bei den meisten Zellen ist die Ultraschalllyse nach 2 – 4 Zyklen mit jeweils 10 sec Beschallung abgeschlossen.
• Entfernen Sie nach der Beschallung die Sonotrode aus der Probe. Die Proben sollten für 5 min auf Eis inkubiert werden. Zentrifugieren Sie anschließend für 20 min bei 10.000 x g, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Überführen Sie die Überstände in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften Sie die Analyten und lagern Sie sie bei -20°C.
• Die Ultraschallsonotrode lässt sich durch gründliches Abwischen mit Alkohol oder durch Beschallung in einem mit Alkohol, z. B. 70% Ethanol, gefüllten Becherglas reinigen. Alle Ultraschallsonotroden aus Titan sind autoklavierbar.

• Spülen Sie das Gewebe mit eiskaltem PBS (0,01M, pH=7,4), um überschüssiges hämolysiertes Blut gründlich zu entfernen.
• Wiegen Sie das Gewebe (Niere, Herz, Lunge, Milz usw.) und zerkleinern Sie es durch Mazeration in kleine Stücke, die in PBS homogenisiert werden. Das benötigte PBS-Volumen richtet sich nach dem Gewebegewicht. Als Faustregel gilt: Für 1g Gewebe werden etwa 9mL PBS benötigt. Es wird empfohlen, dem PBS etwas Proteaseinhibitor zuzusetzen. (Alternativ kann RIPA-Puffer oder ein hypotonischer Lysepuffer mit einem Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktail verwendet werden.)
• Je nach Gewebegröße kann eine kurze Behandlung mit einem Vortexmischer (etwa 1–2 min. in Pulsen von 15 sec.) zur Vorbehandlung des Gewebes hilfreich sein.
• Montieren Sie eine Mikrospitze, z. B. S26d2, an Ihrem Ultraschallgerät. Stellen Sie das Probenröhrchen mit dem Gewebe in ein Eisbad.
• Beschallen Sie die Probe mit Ihrem Ultraschallgerät, z. B. UP200St (80% Amplitude), für 1 min. im Pulsmodus (15sec ein, 15sec Pause). Belassen Sie die Probe im Eisbad.
• Die Homogenate werden anschließend zentrifugiert, um spezifische Fraktionen (zytosolische, nukleäre, mitochondriale oder lysosomale) zu erhalten und das Protein für die Analyse anzureichern. Durch Zentrifugieren der Probe für 5 Minuten bei 5000×g wird der Überstand gewonnen.

Zuverlässige Temperaturregelung während der Beschallung

Die Temperatur ist ein entscheidender Einflussfaktor im Prozess und besonders bei der Behandlung biologischer Proben von Bedeutung, z. B. um den thermischen Abbau von Proteinen zu verhindern. Wie bei allen mechanischen Verfahren zur Probenvorbereitung entsteht auch bei der Beschallung Wärme. Mit den Geräten von Hielscher Ultrasonics lässt sich die Probentemperatur jedoch gut kontrollieren. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben während der präanalytischen Vorbereitung mit einem Ultraschallgerät mit Sonotrode oder dem VialTweeter zu überwachen und zu regeln.

1. Überwachung der Probentemperatur: Alle digitalen Ultraschallprozessoren von Hielscher sind mit intelligenter Software und einem steckbaren Temperatursensor ausgestattet. Schließen Sie den Temperatursensor an das Ultraschallgerät an (z. B. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Ultraschallgerät für Multiwell-Platten UIP400MTP) und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touchdisplay können Sie im Menü des Ultraschallprozessors einen bestimmten Temperaturbereich für die Beschallung Ihrer Proben einstellen. Das Ultraschallgerät stoppt automatisch, sobald die Höchsttemperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den unteren Wert des eingestellten Temperaturintervalls ∆ gesunken ist. Anschließend startet die Beschallung automatisch erneut. Diese intelligente Funktion verhindert einen wärmebedingten Abbau.
2. Beim Ultraschallgerät für mehrere Proben VialTweeter kann der Titanblock, der die Probenröhrchen aufnimmt, vorgekühlt werden. Stellen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühlschrank oder Gefrierschrank. Das Vorkühlen des Titanblocks hilft, den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Wenn möglich, kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
3. Verwenden Sie während der Beschallung ein Eisbad oder Trockeneis zur Kühlung. Stellen Sie Ihr Probenröhrchen bzw. Ihre Probenröhrchen während der Beschallung in ein Eisbad. Verwenden Sie für den VialTweeter eine flache, mit Trockeneis gefüllte Schale und stellen Sie den VialTweeter auf das Trockeneis, damit die Wärme schnell abgeführt werden kann.

Kunden weltweit nutzen die Ultraschallgeräte mit Sonotrode von Hielscher sowie die Geräte zur Beschallung mehrerer Proben VialTweeter und UIP400MTP für ihre tägliche Probenvorbereitung in biologischen, biochemischen, medizinischen und klinischen Laboren. Die intelligente Software und Temperaturregelung der Hielscher-Prozessoren sorgen für eine zuverlässige Temperaturkontrolle und verhindern einen wärmebedingten Abbau der Proben. Die Ultraschall-Probenvorbereitung mit Ultraschalllösungen von Hielscher liefert äußerst zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse!
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