Lyse von E.Coli-Bakterienzellen mittels Ultraschall

  • E. coli-Bakterien zählen zu den am häufigsten verwendeten Bakterien in der Mikrobiologie und Biotechnologie.
  • Ultraschallhomogenisatoren liefern zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse beim Zallaufschluss von E. coli.
  • Intensive und präzise steuerbare Ultraschallkavitation und Scherkräfte ermöglichen eine vollständige Lyse und hohe Extraktionsausbeute (z.B. Proteine, DNA).

Warum ist der Zellaufschluss von E. coli mit Ultraschall die bevorzugte Methode?

Ultraschallhomogenisatoren oder Sonden-Ultraschallgeräte bieten mehrere Vorteile für die Lyse von E. coli, da intensiver Ultraschall die Zellwände und -membranen effizient aufbricht. Sonden-Ultraschallgeräte werden aus folgenden Gründen häufig für die Lyse von E. coli verwendet:

  • Effiziente Zerstörung von Zellwänden: E. coli hat eine halbstarre Zellwand aus Peptidoglykan, die mit herkömmlichen Lysemethoden nur schwer zu brechen ist. Ein Sonden-Ultraschallgerät erzeugt intensive Ultraschallwellen, die in der die Zellen umgebenden Flüssigkeit Kavitationsblasen erzeugen. Wenn diese Blasen kollabieren, erzeugen sie Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitsstrahlen und Schockwellen, die zu einer mechanischen Zertrümmerung der Zellwände führen und so Zellinhalte wie Biomoleküle freisetzen.
  • Verbessertes Eindringen: Die von der Sonde/Sonotrode erzeugten Ultraschallwellen können tief in die Probe eindringen, erreichen eine größere Anzahl von E. coli-Zellen und behandeln sie gleichmäßig. Dies trägt dazu bei, dass die Lyse in der gesamten Probe gleichmäßiger erfolgt, was zu einer höheren Effizienz des Zellaufschlusses führt.
  • Verkürzte Bearbeitungszeit: Die vom Sonden-Ultraschallgerät abgegebene Energie ist hoch konzentriert und lokalisiert, was zu einer schnellen und effizienten Zelllyse führt. Im Vergleich zu anderen Methoden wie Bead Beating oder enzymatischer Lyse kann mit Ultraschall die Lyse von E. coli innerhalb von Minuten oder sogar Sekunden erreicht werden. Während viele alternative Verfahren wie das Gefrier-Auftauen mehrere Behandlungsrunden erfordern, öffnet die Ultraschalllyse die Zellen in einem einzigen Prozessschritt.
  • Temperaturregelung: Moderne Ultraschallgeräte sind mit Temperatursensoren und intelligenter Software ausgestattet, mit der eine maximale Prozesstemperatur eingestellt werden kann. Das Ultraschallgerät pausiert automatisch, wenn die Temperaturgrenze erreicht wird, und startet den Beschallungsprozess, wenn ein bestimmter Temperaturpunkt erreicht wird. Die Kühlung der Proben in einem Eisbad ist eine einfache Methode, um die Probentemperatur niedrig zu halten und eine hitzebedingte Verschlechterung der Proben zu verhindern.
  • Skalierbarkeit: Sonden-Ultraschallgeräte sind in verschiedenen Größen erhältlich, von handgehaltenen Geräten bis hin zu großen Industriemodellen. Dadurch eignen sie sich für die Verarbeitung kleiner Mengen im Labor oder für größere Bioprozessanwendungen, z. B. für die Impfstoffherstellung oder die Biosynthese von Molekülen.
  • Vielseitigkeit: Ultraschallgeräte können über die Zelllyse hinaus für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, z. B. zur DNA-Scherung, Proteinextraktion, Gewebehomogenisierung, Dispersion von Nanopartikeln und Emulgierung. Daher bietet die Investition in einen Sonden-Ultraschallgenerator vielseitige Einsatzmöglichkeiten in Forschung und Industrie.
  • Sonden-Ultraschallgeräte wie das UP200St sind zuverlässige Gewebehomogenisatoren und Zellzerkleinerer und werden daher häufig für die Probenvorbereitung in der Genetik verwendet, z. B. für die Lyse von E. coli.

    Die Proteinextraktion aus E.coli-Zellen erfolgt effizient mit dem Ultraschallhomogenisator UP200St

    Der Sonden-Ultraschallgenerator bietet viele Vorteile für die Lyse von E. coli. Dank der zuverlässigen und präzisen Kontrolle der Ultraschallprozessparameter lassen sich die Betriebsparameter wie Leistung, Dauer und Probenhandhabung optimieren, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.
     

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    In dieser Anleitung wird erläutert, welche Art von Sonicator sich am besten für Ihre Probenvorbereitungsaufgaben wie Lyse, Zellaufschluss, Proteinisolierung, DNA- und RNA-Fragmentierung in Labor, Analyse und Forschung eignet. Wählen Sie den idealen Schallkopf-Typ für Ihre Anwendung, Ihr Probenvolumen, Ihre Probenanzahl und Ihren Durchsatz. Hielscher Ultrasonics hat den idealen Ultraschall-Homogenisator für Sie!

    So finden Sie den perfekten Sonicator für Zellaufschluss und Proteinextraktion in Wissenschaft und Analyse

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    Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall wird häufig als Probenvorbereitungsschritt bei der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) eingesetzt.

    Elektrophoretische Analysen genomischer DNA von E. coli EDL933, die einer 0-15-minütigen Ultraschallbehandlung unterzogen wurde. L bezeichnet die DNA-Leiter.
    (Studie und Bild: ©Basselet et al. 2008)

    Zellaufschluss durch Ultraschall-Kavitation

    Ultraschallhomogenisatoren arbeiten mit ca. 20.000 Zyklen pro Sekunde (bei 20 kHz) und erzeugen Kavitation in Flüssigkeiten oder Suspensionen. Akustische Kavitation erzeugt mikroskopisch kleine Bereiche mit vakuumähnlichem Druck und hohen Temperaturen, die Zellen zerreißen. Obwohl die Temperaturen mehrere tausend Grad Celsius erreichen können, sind die Kavitationsvolumina so klein, dass sie den Prozess nicht wesentlich erwärmen. Durch Ultraschall erzeugte akustische Kavitation und Scherkräfte perforieren oder durchbrechen die Zellmembran von Bakterienzellen wie E.coli. Hielscher-Ultraschallgeräte erlauben die präzise Steuerung von Prozessparametern wie Ultraschallintensität, Amplitude, Energieeintrag und Temperatur. Dadurch kann der Ultraschall-Lyseprozess optimal an den Zelltyp, die Zellkultur und das Prozessziel angepasst werden.
     

    Vorteile der Ultraschall-Lyse

    • präzise Kontrolle (Intensität, Amplitude, Temperatur)
    • zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse
    • optimale Anpassung an spezifische Proben
    • Temperaturkontrolle
    • für sehr kleine bis sehr große Proben (µl bis l)
    • Rein mechanische Behandlung
    • benutzerfreundlicher, sicherer Betrieb
    • lineares Scale-up vom Labor bis zur Produktion
    Das Ultraschallgerät VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Probenvorbereitung von bis zu 10 Vials unter denselben Prozessbedingungen VialTweeter. (Zum Vergrößern anklicken!)

    VialTweeter für die Ultraschall-Lyse

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    Ultraschallhomogenisator im Vergleich zu anderen Lysetechniken

    Während die chemische und enzymatische Lyse problematisch sein kann – da durch die chemische Lyse die Proteinstrukturen verändert werden können und dadurch Probleme bei der Reinigung entstehen und die enzymatische Lyse lange Inkubationszeiten benötigt und die Ergebnisse nicht reproduzierbar sind – , ist der Zellaufschluss durch Ultraschall ist eine zuverlässige, schnelle Lysemethode.
    Die Ultraschall-Lyse basiert ausschließlich auf mechanischen Kräften. Es werden keine Chemikalien hinzugefügt, sondern die Zellwand wird durch Scherkräfte aufgebrochen. Die chemische Lyse kann die Proteinstruktur verändern und Probleme bei der Aufreinigung verursachen. Der enzymatische Aufschluss erfordert lange Inkubationszeiten und ist nicht reproduzierbar. Der Zellaufschluss von E.coli-Bakterienzellen mit Ultraschall ist schnell, einfach, zuverlässig und reproduzierbar. Deshalb werden Hielscher-Ultraschallgeräte in biologischen und biochemischen Laboratorien auf der ganzen Welt zur Probenvorbereitung, Präanalytik, In-vitro-Diagnostik und für vielfältige Assays eingesetzt.

    Allgemeine Empfehlungen für die Ultraschalllyse

    Die Ultraschall-Lyse ist die am häufigsten bevorzugte Methode, um sehr kleine, mittlere sowie auch große Volumina von Zellsuspensionen – von Pico-Litern bis 100L /h (mit Ultraschall-Durchflusszelle) - zu lysieren. Die Zellen werden durch Scherung und Kavitation aufgeschlossen. Auch DNA kann während der Beschallung fragmentiert werden, so die Zugabe von DNase zur Zellsuspension überflüssig ist.
     

    Temperaturkontrolle bei der E.coli-Lyse mit Ultraschall
    Ultraschall-Zellauflöser UP100H (100W) für Zellaufschluss und Extraktion von Pflanzeninhaltsstoffen.Wird die Probe vor der Lyse gekühlt und während der Beschallung im Eisbad gehalten, lässt sich ein thermischer Abbau der Probe verhindern.
    Idealerweise sollten die Proben während der Lyse eiskalt gehalten werden, aber für die meisten Proben ist es ausreichend, wenn die Temperatur nicht über die Temperatur der Kultur oder der Gewebequelle ansteigt. Daher empfiehlt es sich, die Suspension auf Eis zu halten und mit mehreren kurzen Ultraschallimpulsen von 5-10 Sekunden und Pausen von 10-30 Sekunden zu beschallen. Während der Pausen kann die Wärme abgeleitet werden, um eine niedrige Temperatur wiederherzustellen. Für größere Zellproben sind verschiedene Durchflusszellenreaktoren mit Kühlmantel erhältlich.
    Lesen Sie hier detaillierte Tipps und Empfehlungen für eine erfolgreiche Ultraschall-Lyse!

    Protokolle für die Ultraschallaufbereitung von E. Coli-Lysaten

    Forscher verwenden Hielscher Ultraschall-Homogenisatoren für den Aufschluss von E.coli-Zellen. Nachfolgend finden Sie verschiedene getestete und bewährte Protokolle für die Lyse von E.coli mit Hielscher Ultraschall-Homogenisatoren für verschiedene E.coli-bezogene Anwendungen.
     

    Dieser Videoclip zeigt den Hielscher Ultraschall-Homogenisator UP100H, ein Ultraschallgerät, das häufig für die Probenvorbereitung in Laboratorien eingesetzt wird.

    Ultraschall-Homogenisator UP100H

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    Zellwachstum, Vernetzung und Herstellung von E. coli-Zellextrakten mit Ultraschall

    Für den SeqA and RNA Polymerase ChIP-Chip werden E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA bei 37 °C zu einer OD600 mit ca. 0,15 in 50ml LB (+ 0,2% Glukose) gezüchtet, bevor 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium hinzugefügt wird (finale Konzentration 1%). Die Vernetzung wird unter langsamem Schütteln (100 rpm) bei Raumtemperatur für 20 Min. und anschließendem Abschrecken mit 10ml 2,5M Glycin (finale Konzentration 0,5 M) durchgeführt. Für das Hitzeschock-Experiment werden E. coli MG1655 in 65ml LB-Medium bei 30°C mit einer OD600 von etwa 0,3. Anschließend wurden 30 ml der Kultur in einen vorgewärmten Kolben bei 43°C überführt, der Rest wurde bei 30°C gehalten. Die Vernetzung und das Quenchen erfolgten wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Zellen 5 Minuten lang bei 30 oder 43°C gehalten wurden, bevor sie bei Raumtemperatur langsam weitergeschüttelt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit kaltem TBS (pH 7,5) gewaschen. Nach Resuspendierung in 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20 % Saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml Lysozym) und 30-minütiger Inkubation bei 37 °C und anschließender Zugabe von 4 ml IP-Puffer wurden die Zellen mit dem Hielscher-Ultraschallgerät UP400St bei 100 % Leistung auf Eis mit 12 mal 30 Sekunden und 30 Sekunden Pause beschallt. Nach einer 10-minütigen Zentrifugation bei 9000 g wurden 800 μl des Überstandes bei -20 °C gelagert. (Waldminghaus 2010)
     

    Überproduktion und Reinigung von Enzymen mit einer Ultraschallsonde

    Der Ultrasonicator UP100H ist ein Laborhomogenisator, der häufig für die Probenvorbereitung von Zellkulturplatten verwendet wird.Zur Überproduktion von Decahistidin (His10)-markierten Proteinen wurde E. coli BL21(DE3) mit pET19b-Konstrukten transformiert. Eine Vorkultur über Nacht wurde durch Zentrifugation geerntet, und 1 % davon wurde zur Beimpfung einer Expressionskultur verwendet. Zellen, die pET19mgtB tragen, wurden bei 22°C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,7 gezüchtet. Die Kultur wurde auf 17 °C gebracht und mit 100 μM IPTG induziert. Nach 16 Stunden wurde die Kultur durch Zentrifugation bei 7.500 × g bei 4°C geerntet. Die Zellen wurden in 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,3 M NaCl bei einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung mit einer S2-Mikrospitzen-Sonotrode am Hielscher-Ultraschallgerät UP200St bei einem Zyklus von 0,5 und einer Amplitude von 75 % aufgeschlagen.
    Die Überproduktion von Decahistidin-markierten GtfC werden bei 37°C zu einer OD600 von 0,6 mit 100µM IPTG kultiviert. Die Zellen werden für 4 Std. inkubiert, dann geerntet und wie oben beschrieben für MgtB lysiert.
    Rohe Zellextrakte wurden bei 15.000 × g und 4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Die geklärten Extrakte wurden unter Verwendung eines ÄKTAprime Plus-Systems auf 1-ml-HisTrap FF Crude-Säulen geladen. Die Enzyme wurden nach dem Protokoll des Herstellers für die Gradientenelution von His-markierten Proteinen gereinigt. Die eluierten Proteinlösungen wurden zweimal gegen 1.000 Volumina von 50 mM PBS, pH 7,4, mit 0,3 M NaCl bei 4°C dialysiert. Die Aufreinigung wurde durch 12%ige SDS-PAGE analysiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode mit Roti-Quant bestimmt. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultraschallextraktion von Proteinen aus E. coli-Bakterien
    Ein Köderprotein (in diesem Fall MTV1 aus Arabidopsis thaliana) mit einem GST-Tag fusioniert und in BL21 Escherichia coli (E. coli) Zellen exprimiert.

    1. Nehmen Sie ein Pellet von GST-MTV1 und GST (entsprechend 50 ml Bakterienkultur) und resuspendieren Sie es in 2,5 ml eiskaltem Extraktionspuffer.
    2. Verwenden Sie ein Ultraschallgerät UP100H (mit MS3-Mikrotip-Sonotrode für kleine Volumina von ca. 2-5 ml), um die Bakterienzellen aufzubrechen, bis sie lysiert sind, was durch eine verringerte Trübung und erhöhte Viskosität angezeigt wird. Dies muss auf Eis erfolgen, und es wird empfohlen, in Intervallen zu beschallen (z. B. 10 Sekunden Beschallung, gefolgt von 10 Sekunden Pause auf Eis usw.). Es muss darauf geachtet werden, dass nicht mit zu hoher Intensität beschallt wird. Wenn Schaumbildung oder die Bildung eines weißen Niederschlags festgestellt wird, muss die Intensität verringert werden.
    3. Die lysierte Bakterienlösung in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 20 Minuten lang bei 4°C und 16.000 x g zentrifugieren.

     

    Ultraschallsonden nutzen die Kräfte der akustischen Kavitation, um Zellen aufzubrechen und Moleküle und DNA aus E.coli zu extrahieren.

    Ultraschallstabschwinger wie der UP400St nutzen das Funktionsprinzip der akustischen Kavitation für die effiziente Lyse von E.coli.

    Expressionsanalyse und Reinigung von rekombinanten Proteinen durch Sonikation

    Das E. coli-Pellet wurde mit dem Hielscher-Ultraschallgerät UP100H beschallt. Zu diesem Zweck wurde das Zellpellet in gekühltem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendiert und 10 Minuten auf Eis gekühlt. Dann wurde die Zellsuspension mit 10 kurzen Schallsignalen von 10 s Dauer beschallt, gefolgt von einer Abkühlpause von 30 s. Schließlich wurden die Zelltrümmer durch Ultrazentrifugation bei 4°C für 15 Minuten bei 14000 U/min entfernt. Zur Bestätigung der rPR-Expression wurde der Überstand auf ein 12%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und mittels SDS-PAGE und Western Blotting analysiert. Die Reinigung von rPR erfolgte mit Ni2+-NTA-Harz (Invitrogen, USA) gemäß der Anleitung des Herstellers. In diesem Stadium wurde die native Reinigungsmethode verwendet. Die Reinheit des gereinigten Proteins wurde durch Elektrophorese auf einem 12%igen Polyacrylamidgel und anschließender Coomassie-Blau-Färbung bestimmt. Die Konzentration des gereinigten Proteins wurde mit dem Micro BCA Protein Assay Kit (PIERCE, USA) gemessen. (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Dieses Video zeigt das 200 Watt Ultraschall-Cuphorn zum Dispergieren, Homogenisieren, Extrahieren oder Entgasen von Laborproben.

    Ultraschall-Cuphorn (200 Watt)

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    Ultraschallhomogenisatoren für die Lyse von E. coli

    Hielscher Ultrasonics entwickelt, fertigt und liefert Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren für die zuverlässige und effiziente Lyse von E. coli-Bakterien und anderen Zelltypen, Geweben und Zellkulturen.
    Das breite Portfolio an Ultraschallsonden und indirekten Beschallungssystemen ermöglicht es uns, Ihnen den idealen Ultraschall-Gewebehomogenisator für Ihre Zellaufschluss- und Extraktionsanwendung anzubieten.

    Design, Herstellung und Beratung – Qualität Made in Germany

    Hielscher-Ultraschallgeräte können über eine Browsersteuerung ferngesteuert werden. Die Beschallungsparameter können überwacht und exakt an die Prozessanforderungen angepasst werden.Hielscher-Ultraschallgeräte sind bekannt für höchste Qualität und Designstandards. Intelligente Software, intuitives Menü, programmierbare Einstellungen und automatische Datenprotokollierung sind nur einige Merkmale der Hielscher-Ultraschallgeräte. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die problemlose Integration unserer Ultraschallgeräte in Forschungs- und Biotech-Einrichtungen. Selbst raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen meistern Hielscher-Ultraschallgeräte problemlos.

    Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Ultraschallgeräte CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

    In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren:

    Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
    Multiwell-/Mikrotiterplatten n.a. UIP400MTP
    CupHorn für Vials und Becher n.a. Ultraschall-CupHorn
    Ultraschall-Mikroströmungsreaktor n.a. GDmini2
    bis zu 10 Fläschchen mit 0,5 bis 1,5 ml n.a. VialTweeter
    0,5 bis 1,5 ml n.a. VialTweeter
    1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
    10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
    0.1 bis 20l 0,2 bis 4l/min UIP2000hdT
    10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000
    n.a. 10 bis 100l/min UIP16000
    n.a. größere Cluster aus UIP16000

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    Fordern Sie weitere Informationen an!

    Bitte verwenden Sie das untenstehende Formular, um weitere Informationen über Ultraschall-Gewebehomogenisatoren und -Zellbrecher, Lyseanwendungen und Preise anzufordern. Wir freuen uns darauf, Ihren Prozess mit Ihnen zu besprechen und Ihnen einen Ultraschallhomogenisator anzubieten, der Ihren Anforderungen entspricht!









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    Das Video zeigt das Ultraschallsystem UIP400MTP, das die zuverlässige Probenvorbereitung jeder Standard-Multiwell-Platte / Microtiter-Platte mit hochintensivem Ultraschall ermöglicht. Typische Anwendungen des UIP400MTP sind die Lyse, das Scheren von DNA, RNA und Chromatin sowie die Proteinextraktion.

    Ultraschallgerät UIP400MTP zur Beschallung von Multiwell-Platten

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    Zusätzliche Protokolle für die Lyse von E. coli mit Ultraschall

    Allicin-modifizierte Proteine in E. coli unter Verwendung eines Ultraschall-VialTweeter

    VialTweeter mit Ultraschallprozessor UP200STBestimmung des Sulfhydryl-Gehalts mittels 5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) Assay
    Eine E. coli MG1655 Übernachtkultur wurde zur Beimpfung von MOPS-Minimalmedium (1:100) verwendet. Die Kultur wurde aerob gezüchtet, bis ein A600-Wert von 0,4 erreicht war. Die Kultur wurde für die Stressbehandlung in drei 15-ml-Kulturen aufgeteilt. Eine unbehandelte Kultur diente als Negativkontrolle. 0,79 mM Allicin (128 μg ml-1) oder 1 mM Diamid wurden jeweils einer der beiden verbleibenden Kulturen zugesetzt. Die Kulturen wurden 15 Minuten lang bebrütet. Von jeder Kultur wurden 5 ml durch Zentrifugation (8.525 × g, 4°C, 10 min) geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, vor der Verwendung anaerob gelagert) gewaschen und zentrifugiert (13 000 × g, 4°C, 10 min). Die Zellen wurden in Lysepuffer (PBS mit 6 mM Guanidinium-HCl, pH 7,4) resuspendiert, bevor sie bei 4°C durch Ultraschall aufgeschlossen wurden (VialTweeter Ultraschallgerät, Hielscher GmbH, Deutschland) (3 × 1 min). Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (13.000 × g, 4 °C, 15 min) pelletiert. Der Überstand wurde mit einem Magnetrührer in eine 3,5-ml-QS-Makroküvette (10 mm) überführt und mit 1 ml Lysepuffer gemischt. Die Extinktion der Proben wurde bei 412 nm mit einem Jasco V-650 Spektralphotometer, das mit dem temperaturgesteuerten Küvettenhalter PSC-718 ausgestattet ist, bei Raumtemperatur gemessen. 100μl einer 3 mM Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-Lösung wurden hinzugefügt. Die Extinktion wurde bis zum Erreichen der Sättigung überwacht. Die Berechnung der Thiolkonzentration erfolgte anhand des Extinktionskoeffizienten ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 für Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB) durchgeführt. Die zellulären Thiol-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7 x 10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 = 0,5 (entspricht 1 × 108 ml-1 Zellkultur) berechnet. (Müller et al. 2016)
     

    In-vivo-Glutathion-Bestimmung mit einem Ultraschall-Zellenzerkleinerer

    E.coli MG1655 wurde in MOPS-Minimalmedium in einem Gesamtvolumen von 200 ml gezüchtet, bis ein A600 von 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde für die Stressbehandlung in 50-ml-Kulturen aufgeteilt. Nach einer 15-minütigen Inkubation mit 0,79 mM Allicin, 1 mM Diamid oder Dimethylsulfoxid (Kontrolle) wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 4°C und 4.000 g geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit KPE-Puffer gewaschen, bevor die Pellets in 700 µl KPE-Puffer resuspendiert wurden. Zur Entschützung wurden 300 l 10%ige (w/v) Sulfosalicylsäure zugegeben, bevor die Zellen durch Ultraschall (3 x 1 min) aufgeschlossen wurden; VialTweeter Ultraschallgerät) aufgeschlossen wurden. Die Überstände wurden nach Zentrifugation (30 min, 13000 g, 4°C) gesammelt. Die Sulfosalicylsäure-Konzentrationen wurden durch die Zugabe von 3 Volumeneinheiten KPE Puffer auf 1% reduziert. Messungen des Glutathion-Gesamtgehaltes und des GSSG wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die zellulären Glutathion-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7×10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 0,5 (entspricht 1×108 ml-1 Kultur) berechnet. Die GSH-Konzentrationen wurden durch Subtraktion von 2[GSSG] vom Glutathion-Gesamtgehlat berechnet. (Müller et al. 2016)

    Expression von humanem mAspAT in E. coli unter Verwendung eines Ultraschallhomogenisators

    Ultraschall-Disruptor UP400St (400W) für die Extraktion von intrazellulärems Material (z.B. Proteine, Organellen, DNA, RNA, etc.)Die einzelne E. coli BL21 (DE3)-Kolonie, welche den Expressionsvektor in 30ml Luria-Bertani (LB)-Medium inkl. 100?g/ml Ampicillin enthielt, wurde bei 37°C zu einer optischen Dichte (OD600) bis 0,6 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 10 Min geerntet und in 3l frischem LB-Medium, welches 100?g/ml Ampicillin enthielt, rücksuspendiert.
    Anschließend wurde die Proteinexpression mit 1 mM Isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 20 h bei 16 ºC induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min geerntet und mit Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewaschen. Aus einer 3-Liter-Kultur wurden ca. 45 g (Nassgewicht) Zellen gewonnen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellpellets in 40 mL (für 1 L Kultur) eiskaltem Extraktionspuffer A resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung bei eiskalter Temperatur mit dem Hielscher Ultraschall-Zellbrecher UP400St lysiert. Die Zelllyse wurde 15 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert, um lösliche (Überstand) und ausgefällte (Pellet) Fraktionen zu trennen. (Jiang et al. 2015)
     



    Wissenswertes

    E.coli

    Escherichia coli (E. coli) sind gram-negative, säurebildende, coliforme Stäbchenbakterien der Gattung Escherichia, welche vor allem im menschlichen und tierischen Darm vorkommt. Es werden zahlreichen E. coli-Stämmen (bzw. Unterarten) unterschieden, welche jeweils besondere Eigenschaften aufweisen. Die meisten E.coli-Stämme, wie z.B. die K12-Stämme, sind für den Menschen ungefährlich und werden daher häufig für Forschungszwecke in Laboratorien verwendet. Allerdings gibt es auch Stämme, welche ernsthafte Erkrankungen hervorrufen können.
    E. coli spielen eine wichtige Rolle in der modernen Bio-Ingenieurwissenschaft und industriellen Mikrobiologie, da die Bakterien leicht zu manipulieren sind. So werden E. coli häufig für Laboranwendungen eingesetzt, um z.B. rekombinante Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu gewinnen oder um als Modellorganismus zu dienen.
    Das E. coli-Bakterium ist ein sehr vielseitiger Wirt, der sich hervorragend dazu eignet, um heterologe Proteine herzustellen. Zudem stehen zahlreiche Proteinexpressionssysteme zur Verfügung, mit denen in E. coli rekombinante Proteine hergestellt werden können. Durch die Verwendung von Plasmiden, welche eine hohe Proteinexpression ermöglichen, können in die Bakterien Gene eingeschleust werden, wodurch solche Proteine in industriellen Fermentationsprozessen hergestellt werden können.
    E. coli werden als Zellfabriken zur Herstellung von Insulin verwendet. Weitere Anwendungen sind die Verwendung modifizierter E. coli-Zellen zur Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen und immobilisierten Enzymen, zur Herstellung von Biokraftstoffen sowie zur Bioremediation.
    Der Stamm K-12 ist eine mutante E. coli-Form,welcher das Enzym alkalische Phosphatase (ALP) überexprimiert. Diese Mutation tritt auf aufgrund eines Gendefekts auf. Das Phänomen, bei dem ein Gen einen bestimmten Stoff ungehemmt produziert, ist als konstitutive Aktivität bekannt. Diese spezifische Mutantenform wird zur Isolierung und Reinigung des ALP-Enzyms verwendet.
    E. coli-Bakterien werden ebenfalls häufig als Zellfabriken verwendet. Gentechnisch veränderte Mikroben (z. B. Bakterien) und Pflanzenzellen können als so genannte Zellfabriken verwendet werden. Diese gentechnisch veränderten Zellen produzieren Moleküle, Chemikalien, Polymere, Proteine und andere Stoffe, die z. B. in der Pharma-, Lebensmittel- und Chemieindustrie verwendet werden. Um die im Inneren solcher biotechnologisch veränderten Zellen produzierten Moleküle freizusetzen, ist die Ultraschall-Lyse eine gängige Methode, um die Zellwände aufzubrechen und die Zielsubstanzen in die umgebende Flüssigkeit zu übertragen. Lesen Sie mehr über die Lyse von biotechnologisch bearbeiteten Zellen!

    DNA-Scheren mit Ultraschall

    Ultraschall-Scherkräfte sind eine gängige Methode, um Moleküle, Organellen und Proteine aus dem Zellinneren freizusetzen und DNA-Stränge in Stücke zu brechen. Akustische Kavitation bricht die Zellwände und -membranen, um DNA aus den Zellen zu extrahieren und Fragmente von etwa 600 – 800 bp Länge gewonnen werden, welche sich sehr gut für analytische Zwecke eignen.
    Klicken Sie hier, um mehr über die DNA-Scherung durch Ultraschall zu erfahren!

    Literatur / Literaturhinweise


    Hochleistungs-Ultraschall! Die Hielscher-Produktpalette deckt das gesamte Spektrum vom kompakten Labor-Ultraschallhomogenisator über Benchtop-Sonicator bis hin zu vollindustriellen Ultraschallsystemen ab.

    Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.


    Wir besprechen Ihr Verfahren gerne mit Ihnen.

    Lassen Sie uns in Kontakt treten.