Hielscher – Ultraschall-Technologie

Lyse der E. Coli-Bakterienzellen durch Ultraschall

  • E. coli-Bakterien zählen zu den am häufigsten verwendeten Bakterien in der Mikrobiologie und Biotechnologie.
  • Ultraschallhomogenisatoren liefern zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse beim Zallaufschluss von E. coli.
  • Intensive und präzise steuerbare Ultraschallkavitation und Scherkräfte ermöglichen eine vollständige Lyse und hohe Extraktionsausbeute (z.B. Proteine, DNA).

Zellaufschluss durch Kavitation

Escherichia coli Bakterien können mit Ultraschallhomogenisatorzuverlässig aufgeschlossen werden.Ultraschallstabhomogenisatoren arbeiten mit ca. 20.000 Schwingungen pro Sekunde (bei 20kHz) und verursachen dadurch Kavitation in der Flüssigkeit bzw. Suspension. Durch akustische Kaviation entstehen mikroskopisch kleine Felder mit hohen Druck- und Temperaturschwankungen, durch welche die Zellen aufgeschlossen werden. Obwohl die Temperaturen mehrere tausend Grad Celsius erreichen können, sind die Kavitationsblasen so klein, dass das gesamte Prozessmedium nicht signifikant erhitzt wird. Ultraschallkavitation und die entstehenden Scherkräfte perforieren oder brechen die Zellwände der Escherichia coli Bakterien komplett auf – der Grad des Zellaufschlusses kann präzise über die Geräteeinstellung des Ultraschallhomogenisators geregelt werden.

Vorteile der Ultraschall-Lyse

  • präzise Kontrolle (Intensität, Amplitude, Temperatur)
  • optimale Anpassung an spezifische Proben
  • Temperaturkontrolle
  • für sehr kleine bis sehr große Proben (µl bis l)
  • rein mechanisches Verfahren
  • lineares Scale-up vom Labor bis zur Produktion
Das Ultraschallgerät VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Probenvorbereitung von bis zu 10 Vials unter denselben Prozessbedingungen VialTweeter. (Zum Vergrößern anklicken!)

VialTweeter für die Ultraschall-Lyse

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Während die chemische und enzymtische Lyse problematisch sein können – da durch die chemische Lyse die Proteinstrukturen verändert werden können und dadurch Probleme bei der Reinigung entstehen und die enzymatische Lyse lange Inkubationszeiten benötigt und die Ergebnisse nicht reproduzierbar sind – , ist der Zellaufschluss durch Ultraschall ist eine zuverlässige, schnelle Lysemethode.
Die Ultraschall-Lyse basiert nur auf mechanischen Kräften. Es werden keine Chemikalien zugegeben, die Ultraschallbehandlung bricht die Zellwand durch Scherkräfte. Die chemische Lyse kann die Proteinstruktur verändern und Reinigungsprobleme verursachen. Enzymatische Disruption erfordert lange Inkubationszeiten und ist nicht reproduzierbar.

Allgemeine Empfehlungen

UP400St Ultraschallgerät mit DurchflussreaktorDie Ultraschall-Lyse ist die am häufigsten bevorzugte Methode, um sehr kleine, mittlere sowie auch große Volumina von Zellsuspensionen – von Pico-Litern bis 100L /h (mit Ultraschall-Durchflusszelle) - zu lysieren. Die Zellen werden durch Scherung und Kavitation aufgeschlossen. Auch DNA kann während der Beschallung fragmentiert werden, so die Zugabe von DNase zur Zellsuspension überflüssig ist.
Temperaturregelung:
Wird die Probe vor der Lyse gekühlt und während der Beschallung im Eisbad gehalten, lässt sich ein thermischer Abbau der Probe verhindern.
Im Idealfall sollten die Proben während der Lyse eiskalt gehalten werden, aber für die meisten Proben reicht es aus, wenn die Temperatur nicht über die Temperatur der Kultur oder der Gewebequelle steigt. Daher wird empfohlen, die Suspension auf Eis zu halten und mit mehreren kurzen Ultraschallimpulsen von 5-10 sec und Pausen von 10-30 sec zu sondieren. Während der Pausen kann die Wärme abgeführt werden, um eine niedrige Temperatur wiederherzustellen. Für größere Zellproben stehen verschiedene Durchflusszellenreaktoren mit Kühlmantel zur Verfügung.

Protokolle für die Aufbereitung von E. coli-Lysaten

Expressionsanalyse und Reinigung von rekombinantem Protein

Das E. coli-Pellet wurde mit einem Ultraschallsystem UP100H (Hielscher) beschallt. Hierfür wurde das Zellpellet in gekühlter Pufferlösung (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendiert und für 10 Min. auf Eis gekühlt. Anschließend wurde die Zellsuspension mit jeweils 10 kurzen Ultraschallimpulsen beschallt, welche von 30-sekündigen Pausen unterbrochen wurden, in denen die Probe abkühlen konnte. Anschließend wurde die Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 14.000rpm, 4°C und 15 Min. abgetrennt und anschließend für 10 Min. auf Eis gekühlt. Für die rPR-Expression wurde der Überstand auf 12% Polyacrylamidgel geladen und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Die rPR-Reinigung erfolgte mit Ni2 -NTA (Invitrogen, USA). Auf dieser Stufe wurde die native Reinigung angewendet. Der Reinheitsgrad der gereinigten Proteine wurde durch Elektrophorese auf 12% Polyacrylamidgel und anschließender Coomassie-Blue-Färbung bewertet. Die Proteinkonzentration wurde mittels Micro BCA Proteinassay Kit (PIERCE, USA) gemessen. (Azarnezhad et al. 2016)

Ultraschall-Disruptor UP100H (100W) für Lyse, Zellaufschluss und DNA-Fragmentierung.

Ultraschallhomogenisator UP100H (100 W)

Zellwachstum, Crosslinking und Herstellung von E. coli Zellextrakten

Für den SeqA and RNA Polymerase ChIP-Chip werden E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA bei 37 °C zu einer OD600 mit ca. 0,15 in 50ml LB (+ 0,2% Glukose) gezüchtet, bevor 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium hinzugefügt wird (finale Konzentration 1%). Die Vernetzung wird unter langsamem Schütteln (100 rpm) bei Raumtemperatur für 20 Min. und anschließendem Abschrecken mit 10ml 2,5M Glycin (finale Konzentration 0,5 M) durchgeführt. Für das Hitzeschock-Experiment werden E. coli MG1655 in 65ml LB-Medium bei 30°C mit einer OD600 von 0,3 gezüchtet. Anschließend wird die 30ml Zellkultur in einen auf 43°C vorgewärmten Kolben transferriert und die Restmenge wird bei 30°C gelagert. Die Vernetzung und das Abschrecken wird wie oben beschrieben durchgeführt, allerdings werden die Zellen für 5 Min. bei 30°C bzw. 43°C gehalten, bevor sie danach bei Raumtemperatur langsam geschüttelt werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit kaltem TBS (pH7,5) gewaschen. Nach dem Resuspendieren in 1ml Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% Sukrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) und einer Inkubation bei 37°C für 30 Min., gefolgt von der Zugabe von followed 4ml IP-Puffer, werden die Zellen auf Eis gelegt und beschallt. Die Beschallung erfolgt mit 12 Beschallungsimpulsen von jeweils 30 Sek. und 30 Sek. Pausen. Für die Ultraschall-Lyse wird ein Ultraschallhomogenisator UP400St (Hielscher Ultrasonics GmbH) bei 100% Leistung verwendet. Nach dem Zentrifugieren für 10 Min. bei 9000g werden 800μl Aliquotes des Überstands bei -20°C gelagert. (Waldminghaus 2010)

Überproduktion und Reinigung von Enzymen

Für die Überproduktion von Decahistidin (His10) -markierten Proteinen werden E. coli BL21 (DE3) mit pET19b-Konstrukten transformiert. Eine über Nacht gezüchtete Vorkultur wird durch Zentrifugation geerntet und 1% davon wird verwendet, um eine Expressionskultur zu beimpfen. Die Zellen mit pET19mgtB werden bei 22°C bis zu einer optischen Dichte von 600nm (OD600) von 0,7 gezüchtet. Die Kultur wird auf 17°C überführt und durch 100 μM IPTG induziert. Nach 16 Std. wird die Kultur durch Zentrifugation bei 7.500 g und 4°C geerntet. Die Zellen werden in 50 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,3 M NaCl bei pH 7,4 und durch Ultraschall aufgeschlossen. Die Beschallung erfolgt mit einer Sonotrode S2 (Mikrospitze) am Ultraschallprozessor UP200St (Hielscher, Teltow, Deutschland) bei einem Pulsmodus/Zyklus von 0,5 und einer Amplitude von 75%.
Die Überproduktion von Decahistidin-markierten GtfC werden bei 37°C zu einer OD600 von 0,6 mit 100µM IPTG kultiviert. Die Zellen werden für 4 Std. inkubiert, dann geerntet und wie oben beschrieben für MgtB lysiert.
Die Zellextrakte werden bei 15.000 × g und 4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer abzutrennen. Die geklärten Extrakte werden mittels ÄKTAprime Plus-System (GE Healthcare) auf 1ml HisTrap FF Crude Säule geladen. Die Enzyme werden nach dem Protokoll des Herstellers für Gradientenelution von His-getaggten Proteinen gereinigt. Die eluierte Proteinlösungen wird zweimal gegen 1000 x Volumina 50mM PBS, pH 7,4, dialysiert, mit 0,3 M NaCl bei 4°C dialysiert. Die Reinigung wird mittels 12% SDS-PAGE analysiert. Die Proteinkonzentration wird durch das Bradford-Assay unter Verwendung von Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) bestimmt. (Rabausch et al. 2013)

Proteinextraktion aus E.coli-Bakterien
Ein Köderprotein (in diesem Fall MTV1 aus Arabidopsis thaliana) mit einem GST-Tag fusioniert und in BL21 Escherichia coli (E. coli) Zellen exprimiert.
1. Nehmen Sie ein Pellet mit GST-MTV1 und GST (entsprechend für 50ml Bakterienkultur) und resuspendieren Sie diese jeweils in 2,5ml eiskalten Extraktionspuffer.
2. Verwenden Sie ein Ultraschallgerät UP100H (mit MS3 Mikrotip-Sonotrode für kleine Volumina zw. 2-5ml), um die Bakterienzellen aufzuschließen. Der Fortschritt der Lyse wird durch zunehmende Opazität und Viskosität sichtbar. Die Lyse muss auf Eis durchgeführt werden. Es ist empfehlenswert, in Intervallen beschallen (z.B. 10 Sek. Ultraschall gefolgt von 10 Sek. Pause, mehrmalige Wiederholung). Es muss darauf geachtet werden, nicht mit zu hoher Intensität zu beschallen. Falls sich Schaum oder weißer Niederschlag bildet, muss die Ultraschall-Intensität reduziert werden.
3. Übertragen die lysierte Bakterienlösung in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert bei 4°C, 16000 x g für 20 Min.

Allicin-modifizierte Proteine ​​in E. coli

Der VialTweeter ist ein besonders komfortables Utraschallsystem für die Homogenisierung kleinerer ProbenBestimmung des Sulfhydryl-Gehalts mittels 5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) Assay
Eine über Nacht kultivierte E. coli MG1655 Zellkultur wurde verwendet, um ein MOPS Minimalmedium (1:100) zu impfen. Die Kultur wurde solange unter aeroben Bedingungen gezüchtet, bis ein A600 von 0,4 erreicht war. Die Kultur wurde für Stressbehandlungen in drei 15ml-Kulturen aufgeteilt. Eine unbehandelte Kultur diente als Negativkontrolle. Den beiden verbleibenden Kulturen wurde jeweils entweder 0,79 mM Allicin (128µg ml-1) oder 1mM Diamid zugegeben. Die Kulturen wurden für 15 Min. inkubiert. 5 ml jeder Kultur wurden durch Zentrifugation (8.525 × g, 4°C, 10 Min.) geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 1ml PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, bis zur Verwendung anaerob gelagert) gewaschen und zentrifugiert (13,000 × g, 4°C, 10 Min). Die Zellen wurden in Lysepuffer (PBS mit 6 mM Guanidinium HCl, pH 7.4) resuspendiert, bevor sie bei 4°C durch Ultraschall (VialTweeter Ultraschallgerät, Hielscher GmbH, Deutschland) (3 × 1Min) aufgeschlossen wurden. Die Zelldebris wurde durch Zentrifugation (13000 × g, 4°C, 15 Min) pelletiert. Der Überstand wurde in einer 3,5ml-Küvette QS-Makro (10 mm) mit magnetischem Rührstab überführt und mit 1ml Lysepuffer gemischt. Extinktion der Proben wurden bei 412 nm mit einem Jasco V-650-Spektrophotometer (mit PSC-718 temperaturgesteuertem Küvettenhalter) bei Raumtemperatur überwacht. Es wurden 100µl einer 3 mM Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) Lösung zugegeben. Die Extinktion wurde überwacht bis die Sättigung erreicht wurde. Die Berechnung der Thiol-Konzentration wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε412 = 13,700 M-1 cm-1 für Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB) durchgeführt. Die zellulären Thiol-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7 x 10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 = 0,5 (äquivalent zu 1 × 108 ml-1 Zellkultur) berechnet. (Müller et al. 2016)

In-vivo Glutathion-Bestimmung

E. coli MG1655 wurde in MOPS Minimalmedium mit 200ml Gesamtvolumen zu einem A600 von 0,5 kultiviert. Die Bakterienkultur wurde 50ml Kulturen für Stressbehandlungen aufgeteilt. Nach 15 Min. Inkubation mit 0,79mM Allicin, 1mM Diamid bzw. Dimethylsulfoxid (Kontrollprobe), wurden die Zellen durch Zentrifugation mit 4000g bei 4°C für 10 Min. geerntet.Die Zellen wurden zweimal mit KPE Puffer gewaschen, bevor das Pellet in 700µl KPE Puffer restspendiert wurde. Für die Enteiweißung wurden 300µl 10% (w/v) Sulfosalicylsäure wurden hinzugefügt bevor die Zellen durch Ultraschall (3 x 1 Min; VialTweeter Ultraschallgerät) aufgeschlossen wurden. Die Überstände wurden nach Zentrifugation (30 min, 13000 g, 4°C) gesammelt. Die Sulfosalicylsäure-Konzentrationen wurden durch die Zugabe von 3 Volumeneinheiten KPE Puffer auf 1% reduziert. Messungen des Glutathion-Gesamtgehaltes und des GSSG wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die zellulären Glutathion-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7×10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 0,5 (äquivalent zu 1×108 ml-1 Kultur) berechnet. Die GSH-Konzentrationen wurden durch Subtraktion von 2[GSSG] vom Glutathion-Gesamtgehlat berechnet. (Müller et al. 2016)

Ultraschall-Disruptor für die Lyse und Extraktion von biologischem Material (zum Vergrößern anklicken!)

Ultraschall-Stabschwinger UP400St

mAspAT-Expression in E. coli

Ultraschall-Disruptor UP400St (400W) für die Extraktion von intrazellulärems Material (z.B. Proteine, Organellen, DNA, RNA, etc.)Die einzelne E. coli BL21 (DE3)-Kolonie, welche den Expressionsvektor in 30ml Luria-Bertani (LB)-Medium inkl. 100?g/ml Ampicillin enthielt, wurde bei 37°C zu einer optischen Dichte (OD600) bis 0,6 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 10 Min geerntet und in 3l frischem LB-Medium, welches 100?g/ml Ampicillin enthielt, rücksuspendiert.
Anschließend wurde die Proteinexpression mit 1mM Isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 20 Std. bei 16ºC induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min geerntet und mit Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewaschen. Aus den 3 Litern Zellkultur wurden ca. 45g (Naßgewicht) Zellengewonnen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellpellets in 40ml (für 1l Kultur) in eiskaltem Extraktionspuffer A rücksuspendiert und eiskalt mit einem Ultraschallgerät UP400St (Hielscher Ultrasonics GmbH) aufgeschlossen. Die Lysat wurde bei 12.000 U/min für 15 min zentrifugiert, um die löslichen (Überstand) und die ausgefällten (Pellet) Fraktionen von einander abzutrennen. (Jiang et al. 2015)

In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme:

Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
0,5 bis 1,5 ml n.a. VialTweeter
1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 bis 20l 0.2 bis 4l/min UIP2000hdT
10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000
n.a. 10 bis 100l/min UIP16000
n.a. größere Cluster aus UIP16000

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Literatur



Wissenswertes

E.coli

Escherichia coli (E. coli) sind gram-negative, säurebildende, coliforme Stäbchenbakterien der Gattung Escherichia, welche vor allem im menschlichen und tierischen Darm vorkommt. Es werden zahlreichen E. coli-Stämmen (bzw. Unterarten) unterschieden, welche jeweils besondere Eigenschaften aufweisen. Die meisten E.coli-Stämme, wie z.B. die K12-Stämme, sind für den Menschen ungefährlich und werden daher häufig für Forschungszwecke in Laboratorien verwendet. Allerdings gibt es auch Stämme, welche ernsthafte Erkrankungen hervorrufen können.
E. coli spielen eine wichtige Rolle in der modernen Bio-Ingenieurwissenschaft und industriellen Mikrobiologie, da die Bakterien leicht zu manipulieren sind. So werden E. coli häufig für Laboranwendungen eingesetzt, um z.B. rekombinante Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu gewinnen oder um als Modellorganismus zu dienen.
Das E. coli-Bakterium ist ein sehr vielseitiger Wirt, der sich hervorragend dazu eignet, um heterologe Proteine herzustellen. Zudem stehen zahlreiche Proteinexpressionssysteme zur Verfügung, mit denen in E. coli rekombinante Proteine hergestellt werden können. Durch die Verwendung von Plasmiden, welche eine hohe Proteinexpression ermöglichen, können in die Bakterien Gene eingeschleust werden, wodurch solche Proteine in industriellen Fermentationsprozessen hergestellt werden können.
E. coli werden u.a. als Zellfabriken verwendet, um Insulin zu produzieren. Weitere Anwendungen umfassen die Verwendung von modifizierten E. coli-Zellen, um Impfstoffe und immobilisierte Enzyme zu entwickeln und herzustellen, um Biokraftstoffe herzustellen sowie für die Bioremediation.
Der Stamm K-12 ist eine mutante E. coli-Form,welcher das Enzym alkalische Phosphatase (ALP) überexprimiert. Diese Mutation tritt auf aufgrund eines Gendefekts auf. Das Phänomen, bei dem ein Gen einen bestimmten Stoff ungehemmt produziert, ist als konstitutive Aktivität bekannt. Diese spezifische Mutantenform wird zur Isolierung und Reinigung des ALP-Enzyms verwendet.

DNA-Scheren mit Ultraschall

Der Einsatz von Ultraschall-Scherkräften gehört zu den gängigen Verfahren des Zellaufschlusses und der DNA-Fragmentation. Akustische Kavitation schließt die Zellwände und Membranen auf, so dass die DNA aus den Zellen freigesetzt wird und Fragmente mit ca. 600 – 800 bp Länge gewonnen werden, welche sich sehr gut für analytische Zwecke eignen.
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