Ultraschalllyse von E. coli

E. coli-Bakterien sind die am häufigsten verwendeten Bakterien in der Mikrobiologie und Biotechnologie.
Ultraschall-Zellaufschlussgeräte liefern zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse bei der Lyse von E. coli.
Intensive, jedoch präzise steuerbare Kavitation und Scherkräfte führen zu einem vollständigen Aufschluss und hohen Extraktionsausbeuten (z. B. Proteine, DNA).

Warum ist der Ultraschall-Zellaufschluss von E. coli die bevorzugte Methode?

Ultraschallhomogenisatoren bzw. Ultraschallgeräte mit Sonotrode bieten mehrere Vorteile für die Lyse von E. coli, da intensiver Ultraschall Zellwände und Membranen effizient aufbricht. Ultraschallgeräte mit Sonotrode werden aus folgenden Gründen häufig für die Lyse von E. coli eingesetzt:

Effizienter Aufschluss der Zellwände: E. coli besitzt eine halbstarre Zellwand aus Peptidoglykan, die sich mit herkömmlichen Lysemethoden nur schwer aufbrechen lässt. Ein Ultraschallgerät mit Sonotrode erzeugt intensive Ultraschallwellen, die in der Flüssigkeit um die Zellen Kavitationsblasen bilden. Wenn diese Blasen kollabieren, erzeugen sie Flüssigkeitsstrahlen mit hoher Geschwindigkeit und Stoßwellen, die die Zellwände mechanisch aufbrechen und dadurch Zellinhalte wie Biomoleküle wirksam freisetzen.

Verbesserte Eindringtiefe: Die von der Sonotrode erzeugten Ultraschallwellen können tief in die Probe eindringen, eine größere Anzahl von E. coli-Zellen erreichen und diese gleichmäßig behandeln. Dies trägt zu einer gleichmäßigeren Lyse in der gesamten Probe bei und erhöht die Effizienz des Zellaufschlusses.

Kürzere Behandlungszeit: Die vom Ultraschallgerät mit Sonotrode abgegebene Energie ist stark konzentriert und lokal begrenzt, was zu einer schnellen und effizienten Zelllyse führt. Im Vergleich zu anderen Methoden wie dem mechanischen Aufschluss mit Mahlperlen oder der enzymatischen Lyse kann die Beschallung E. coli innerhalb von Minuten oder sogar Sekunden lysieren. Während viele alternative Verfahren wie das Einfrieren und Auftauen mehrere Behandlungszyklen erfordern, öffnet die Ultraschalllyse die Zellen in einem einzigen Prozessschritt.

Temperaturkontrolle: Moderne Ultraschallgeräte sind mit Temperatursensoren und intelligenter Software ausgestattet, mit der sich eine maximale Prozesstemperatur einstellen lässt. Das Ultraschallgerät pausiert automatisch, sobald die Temperaturgrenze erreicht ist, und startet die Beschallung erneut, sobald ein festgelegter Temperaturwert erreicht wird. Die Kühlung der Proben in einem Eisbad ist eine einfache Methode, um die Probentemperatur niedrig zu halten und einen wärmebedingten Abbau der Probe zu verhindern.

Skalierbarkeit: Ultraschallgeräte mit Sonotrode sind in verschiedenen Größen erhältlich, von Handgeräten bis hin zu großen Industriemodellen. Dadurch eignen sie sich sowohl für die Verarbeitung kleiner Volumina im Labor als auch für die Maßstabsvergrößerung bei umfangreicheren biotechnologischen Anwendungen, z. B. der Impfstoffproduktion oder der Biosynthese von Molekülen.

Vielseitigkeit: Ultraschallgeräte können über die Zelllyse hinaus für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, etwa zur DNA-Scherung, Proteinextraktion, Gewebehomogenisierung, Dispergierung von Nanopartikeln und Emulgierung. Die Investition in ein Ultraschallgerät mit Sonotrode eröffnet daher vielseitige Einsatzmöglichkeiten in Forschung und Industrie.

Ultraschallgeräte mit Sonotrode wie der UP200St sind zuverlässige Gewebehomogenisatoren und Zellaufschlussgeräte und werden daher häufig zur Probenvorbereitung in der Genetik eingesetzt, e.g. zur Lyse von E. coli

Die Proteinextraktion aus E. coli-Zellen erfolgt effizient mit dem Ultraschallgerät mit Sonotrode UP200St.

Ein Ultraschallgerät mit Sonotrode bietet viele Vorteile für die Lyse von E. coli. Die zuverlässige und präzise Steuerung der Ultraschall-Prozessparameter ermöglicht es, Betriebsparameter wie Leistung, Dauer und Probenhandhabung zu optimieren, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.

Diese Anleitung erläutert, welcher Ultraschallgerätetyp sich am besten für Ihre Aufgaben in der Probenvorbereitung eignet, etwa Lyse, Zellaufschluss, Proteinisolierung sowie DNA- und RNA-Fragmentierung in Labor, Analytik und Forschung. Wählen Sie den idealen Ultraschallgerätetyp für Ihre Anwendung, Ihr Probenvolumen, Ihre Probenanzahl und Ihren Probendurchsatz. Hielscher Ultrasonics hat den idealen Ultraschallhomogenisator für Sie!

Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall wird häufig als Schritt der Probenvorbereitung beim Next Generation Sequencing (NGS) eingesetzt

Elektrophoretische Analysen genomischer DNA von E. coli EDL933 nach einer Ultraschallbehandlung von 0 – 15 min. L kennzeichnet die DNA-Leiter.
(Studie und Bild: ©Basselet et al. 2008)

Zellaufschluss mittels Ultraschallkavitation

Ultraschallhomogenisatoren mit Sonotrode arbeiten mit etwa 20.000 Schwingungen pro Sekunde (bei 20kHz) und erzeugen Kavitation in Flüssigkeiten oder Suspensionen. Bei der akustischen Kavitation entstehen mikroskopisch kleine Bereiche mit vakuumähnlichen Drücken und hohen Temperaturen, die Zellen auseinanderreißen. Obwohl die Temperaturen mehrere tausend Grad Celsius erreichen können, sind die Kavitationsvolumina so klein, dass sie den Prozess nicht wesentlich erwärmen. Die durch Ultraschall erzeugte akustische Kavitation und die Scherkräfte perforieren oder durchbrechen die Zellmembran von Bakterienzellen wie E. coli. Ultraschallgeräte von Hielscher ermöglichen die präzise Steuerung von Prozessparametern wie Ultraschallintensität, Amplitude, Energieeintrag und Temperatur. Dadurch lässt sich der Ultraschalllyseprozess optimal an den Zelltyp, die Zellkultur und das Prozessziel anpassen.

Vorteile der Ultraschalllyse

präzise Steuerung der Lyse (Intensität, Amplitude, Temperatur)
zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse
optimale Anpassung an spezifische Proben
Temperaturkontrolle
für sehr kleine bis sehr große Proben (µL bis Liter)
rein mechanische Behandlung
benutzerfreundlicher, sicherer Betrieb
lineare Maßstabsvergrößerung vom Labor bis zur Produktion

Das Ultraschallgerät VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Probenvorbereitung von bis zu 10 Probengefäßen unter gleichen Prozessbedingungen. (Zum Vergrößern anklicken!)

VialTweeter für die Ultraschalllyse

Ultraschallhomogenisatoren im Vergleich zu anderen Lysetechniken

Während die chemische und enzymatische Lyse problematisch sein können – da die chemische Lyse Proteinstrukturen verändern und Probleme bei der Aufreinigung verursachen kann und die enzymatische Lyse lange Inkubationszeiten erfordert und nicht reproduzierbar ist –, ist der Ultraschallaufschluss eine ausgereifte, schnelle Methode zum Zellaufschluss.
Die Ultraschalllyse beruht ausschließlich auf mechanischen Kräften. Es werden keine Chemikalien zugesetzt; die Beschallung bricht die Zellwand durch Scherkräfte auf. Die chemische Lyse kann die Proteinstruktur verändern und Probleme bei der Aufreinigung verursachen. Der enzymatische Aufschluss erfordert lange Inkubationszeiten und ist nicht reproduzierbar. Der Ultraschall-Zellaufschluss von E. coli-Bakterienzellen ist schnell, einfach, zuverlässig und reproduzierbar. Deshalb werden Ultraschallgeräte von Hielscher weltweit in biologischen und biochemischen Laboren zur Probenvorbereitung, Präanalytik, In-vitro-Diagnostik und für vielfältige Assays eingesetzt.

Allgemeine Empfehlungen für die Ultraschalllyse

Die Beschallung ist die beliebteste Technik zur Lyse sehr kleiner, mittlerer und großer Mengen an Zellsuspensionen – von Pikolitern bis zu 100L/hr (unter Verwendung einer Ultraschall-Durchflusszelle). Die Zellen werden durch Scherkräfte in der Flüssigkeit und Kavitation lysiert. Auch DNA wird während der Beschallung geschert, sodass der Zellsuspension keine DNase zugesetzt werden muss.

Temperaturkontrolle während der Ultraschalllyse von E. coli
Wird die Probe vorgekühlt und während der Beschallung auf Eis gehalten, lässt sich ein thermischer Abbau leicht verhindern.
Idealerweise sollten Proben während der Lyse eiskalt gehalten werden. Bei den meisten Proben genügt es jedoch, wenn die Temperatur nicht über die Temperatur der Ausgangskultur bzw. des Ausgangsgewebes ansteigt. Daher wird empfohlen, die Suspension auf Eis zu halten und mit mehreren kurzen Ultraschallimpulsen von 5–10 sec und Pausen von 10–30 sec zu beschallen. Während der Pausen kann die Wärme abgeführt werden, sodass wieder eine niedrige Temperatur erreicht wird. Für größere Zellproben stehen verschiedene Durchflussreaktoren mit Kühlmänteln zur Verfügung.
Lesen Sie hier ausführliche Tipps und Empfehlungen für eine erfolgreiche Ultraschalllyse!

Protokolle zur Herstellung von E. coli-Lysaten mittels Ultraschall

Forschende verwenden Ultraschallhomogenisatoren von Hielscher für den Zellaufschluss von E. coli. Nachfolgend finden Sie verschiedene getestete und bewährte Protokolle zur Lyse von E. coli mit Ultraschallhomogenisatoren von Hielscher für verschiedene Anwendungen mit E. coli.

Zellwachstum, Vernetzung und Herstellung von E. coli-Zellextrakten mittels Ultraschall

Für SeqA- und RNA-Polymerase-ChIP-Chip wurde E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,15 in 50 ml LB (+ 0,2% Glucose) kultiviert, bevor 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium zugesetzt wurden (Endkonzentration 1%). Die Vernetzung erfolgte unter langsamem Schütteln (100 rpm) bei Raumtemperatur für 20 min. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 ml einer 2,5 M Glycinlösung gestoppt (Endkonzentration 0,5 M). Für Hitzeschockexperimente wurde E. coli MG1655 in 65 ml LB-Medium bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,3 kultiviert. Anschließend wurden 30 ml der Kultur in einen auf 43°C vorgewärmten Kolben überführt und der Rest bei 30°C gehalten. Die Vernetzung und das Stoppen der Reaktion erfolgten wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Zellen zunächst für 5 min bei 30 oder 43°C gehalten wurden, bevor sie bei Raumtemperatur weiter langsam geschüttelt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit kaltem TBS (pH7.5) gewaschen. Nach Resuspension in 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% Saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml Lysozym), Inkubation bei 37°C für 30 min und anschließender Zugabe von 4 ml IP-Puffer wurden die Zellen auf Eis mit dem Ultraschallprozessor UP400St von Hielscher bei einer Leistungseinstellung von 100% beschallt, und zwar 12-mal für jeweils 30 sec mit Pausen von 30 sec. Nach Zentrifugation für 10 min bei 9000 g wurden 800-μl-Aliquote des Überstands bei -20°C gelagert. (Waldminghaus 2010)

Überproduktion und Aufreinigung von Enzymen mit einer Sonotrode

Zur Überproduktion von Proteinen mit Decahistidin-Tag (His10) wurde E. coli BL21(DE3) mit pET19b-Konstrukten transformiert. Eine über Nacht kultivierte Vorkultur wurde durch Zentrifugation geerntet, und 1% wurden zum Animpfen einer Expressionskultur verwendet. Zellen mit pET19mgtB wurden bei 22°C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,7 kultiviert. Die Kultur wurde auf 17°C gebracht und mit 100 μM IPTG induziert. Nach 16 h wurde die Kultur durch Zentrifugation bei 7.500 × g und 4°C geerntet. Die Zellen wurden in 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,3 M NaCl bei pH 7,4 resuspendiert und mittels Ultraschall mit einer S2-Mikrospitzen-Sonotrode am Ultraschallgerät UP200St von Hielscher bei einer Zykluseinstellung von 0,5 und einer Amplitude von 75% aufgeschlossen.
Die Überproduktion von GtfC mit Decahistidin-Tag wurde bei 37°C und einer OD₆₀₀ von 0,6 mit 100 μM IPTG induziert. Die Zellen wurden anschließend für 4 h inkubiert, geerntet und wie oben für MgtB beschrieben lysiert.
Rohe Zellextrakte wurden bei 15.000 × g und 4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Die geklärten Extrakte wurden mit einem ÄKTAprime Plus-System auf 1-ml-HisTrap FF Crude-Säulen aufgetragen. Die Enzyme wurden gemäß dem Herstellerprotokoll zur Gradientenelution von Proteinen mit His-Tag aufgereinigt. Die eluierten Proteinlösungen wurden bei 4°C zweimal gegen 1.000 Volumina von 50 mM PBS, pH 7,4, mit 0,3 M NaCl dialysiert. Die Aufreinigung wurde mittels 12% SDS-PAGE analysiert. Die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode mit Roti-Quant bestimmt. (Rabausch et al. 2013)

Ultraschallextraktion von Protein aus E. coli-Bakterien
Ein interessierendes Köderprotein (in diesem Fall MTV1 aus Arabidopsis thaliana) wird mit einem GST-Tag fusioniert und in Escherichia coli (E. coli)-Zellen des Stammes BL21 exprimiert.

Nehmen Sie jeweils ein Pellet von GST-MTV1 und GST (entsprechend 50 ml Bakterienkultur) und resuspendieren Sie jedes in 2,5 mL eiskaltem Extraktionspuffer.
Verwenden Sie ein Ultraschallgerät UP100H (ausgestattet mit der Mikrospitzen-Sonotrode MS3 für kleine Volumina von etwa 2–5mL), um die Bakterienzellen aufzuschließen, bis sie lysiert sind. Dies zeigt sich durch eine verringerte Trübung und erhöhte Viskosität. Der Vorgang muss auf Eis durchgeführt werden; eine Beschallung in Intervallen wird empfohlen (z. B. 10 sec Beschallung, gefolgt von 10 sec Pause auf Eis usw.). Achten Sie darauf, nicht mit zu hoher Intensität zu beschallen. Bei Schaumbildung oder Bildung eines weißen Niederschlags muss die Intensität verringert werden.
Überführen Sie die Lösung mit den lysierten Bakterien in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 4°C und 16.000 x g für 20 min.

Sonotroden nutzen die Kräfte der akustischen Kavitation, um Zellen aufzuschließen und Moleküle sowie DNA aus E. coli zu extrahieren.

Ultraschallgeräte mit Sonotrode wie der UP400St nutzen das Wirkprinzip der akustischen Kavitation für die effiziente Lyse von E. coli.

Expressionsanalyse und Aufreinigung rekombinanten Proteins mittels Beschallung

Das E. coli-Pellet wurde mit dem Ultraschallgerät UP100H von Hielscher beschallt. Dazu wurde das Zellpellet in gekühltem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendiert und für 10 min auf Eis gekühlt. Anschließend wurde die Zellsuspension mit 10 kurzen Impulsen von jeweils 10 s beschallt, jeweils gefolgt von einer Kühlpause von 30 s. Abschließend wurden die Zelltrümmer durch Ultrazentrifugation bei 4°C für 15 min bei 14.000 rpm entfernt. Zur Bestätigung der rPR-Expression wurde der Überstand auf einem 12%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Die Aufreinigung von rPR erfolgte mit Ni2+-NTA-Harz (Invitrogen, USA) gemäß den Herstellerangaben. In diesem Schritt wurde unter nativen Bedingungen aufgereinigt. Die Reinheit des aufgereinigten Proteins wurde mittels Elektrophorese auf einem 12%igen Polyacrylamidgel und anschließender Coomassie-Blau-Färbung beurteilt. Die Konzentration des aufgereinigten Proteins wurde mit dem Micro BCA Protein Assay Kit (PIERCE, USA) gemessen. (Azarnezhad et al. 2016)

Dieses Video zeigt das Ultraschall-Cuphorn mit 200 Watt zum Dispergieren, Homogenisieren, Extrahieren oder Entgasen von Laborproben.

Ultraschallhomogenisatoren für die Lyse von E. coli

Hielscher Ultrasonics entwickelt, fertigt und liefert leistungsstarke Ultraschallhomogenisatoren für die zuverlässige und effiziente Lyse von E. coli-Bakterien und anderen Zelltypen, Geweben und Zellkulturen.
Das breite Portfolio an Sonotroden sowie Systemen zur indirekten Beschallung ermöglicht es uns, Ihnen den idealen Ultraschall-Gewebehomogenisator für Ihre Zellaufschluss- und Extraktionsanwendung anzubieten.

Entwicklung, Fertigung und Beratung – Qualität Made in Germany

Ultraschallgeräte von Hielscher sind für höchste Qualitäts- und Konstruktionsstandards bekannt. Intelligente Software, intuitive Menüführung, programmierbare Einstellungen und automatische Datenprotokollierung sind nur einige Merkmale der Ultraschallgeräte von Hielscher. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in Forschungs- und Biotechnologieeinrichtungen. Selbst raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen bewältigen Ultraschallgeräte von Hielscher problemlos.

Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt besonderen Wert auf leistungsstarke Ultraschallgeräte mit modernster Technologie und hoher Benutzerfreundlichkeit. Selbstverständlich sind Ultraschallgeräte von Hielscher CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte:

Chargenvolumen	Volumenstrom	Empfohlene Geräte
Multiwell-/Mikrotiterplatten	n.a.	UIP400MTP
CupHorn für Probengefäße oder Bechergläser	n.a.	Ultraschall-CupHorn
Ultraschall-Mikrodurchflussreaktor	n.a.	GDmini2
bis zu 10 Probengefäße mit 0,5 bis 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 bis 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 bis 500mL	10 bis 200mL/min	UP100H
10 bis 2000mL	20 bis 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 bis 20L	0,2 bis 4L/min	UIP2000hdT
10 bis 100L	2 bis 10L/min	UIP4000
n.a.	10 bis 100L/min	UIP16000
n.a.	höher	Verbund aus UIP16000

Kontaktieren Sie uns! / Fragen Sie uns!

Das Video zeigt das Ultraschallsystem zur Probenvorbereitung UIP400MTP, das eine zuverlässige Probenvorbereitung in allen gängigen Multiwellplatten mittels hochintensiven Ultraschalls ermöglicht. Typische Anwendungen des UIP400MTP umfassen Zelllyse, die Scherung von DNA, RNA und Chromatin sowie die Proteinextraktion.

Weitere Protokolle zur Ultraschalllyse von E. coli

Allicin-modifizierte Proteine in E. coli unter Verwendung eines Ultraschallgeräts VialTweeter

Bestimmung des Sulfhydrylgehalts mittels 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-Assay (DTNB)
Eine E. coli MG1655-Übernachtkultur wurde zum Animpfen von MOPS-Minimalmedium verwendet (1:100). Die Kultur wurde aerob kultiviert, bis eine A600 von 0,4 erreicht war. Für die Stressbehandlung wurde die Kultur in drei 15-ml-Kulturen aufgeteilt. Eine unbehandelte Kultur diente als Negativkontrolle. Einer der beiden verbleibenden Kulturen wurden 0,79 mM Allicin (128 μg ml-1) und der anderen 1 mM Diamid zugesetzt. Die Kulturen wurden für 15 min inkubiert. Jeweils 5 ml jeder Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet (8.525 × g, 4°C, 10 min). Die Zellen wurden zweimal mit 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, vor Gebrauch anaerob gelagert) gewaschen und zentrifugiert (13.000 × g, 4°C, 10 min). Die Zellen wurden in Lysepuffer (PBS mit 6 mM Guanidinium-HCl, pH 7,4) resuspendiert und anschließend bei 4°C mittels Ultraschall aufgeschlossen (VialTweeter-Ultraschallgerät, Hielscher GmbH, Deutschland) (3 × 1 min). Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation pelletiert (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Der Überstand wurde in eine mit einem Magnetrührstäbchen (stir bar) ausgestattete 3,5-ml-QS-Makroküvette (10 mm) überführt und mit 1 ml Lysepuffer gemischt. Die Extinktion der Proben wurde bei 412 nm mit einem Jasco V-650-Spektrophotometer mit temperaturgeregeltem Küvettenhalter PSC-718 bei Raumtemperatur verfolgt. Es wurden 100μl einer 3 mM Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-Lösung zugesetzt. Die Extinktion wurde bis zum Erreichen der Sättigung verfolgt. Die Berechnung der Thiolkonzentration erfolgte unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 für Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB). Die zellulären Thiolkonzentrationen wurden auf Grundlage eines Volumens der E. coli-Zellen von 6,7 × 10^-15 Liter und einer Zelldichte von A600 = 0,5 (entsprechend 1 × 10⁸ Zellen ml^-1 Kultur) berechnet. (Müller et al. 2016)

In-vivo-Bestimmung von Glutathion mit einem Ultraschall-Zellaufschlussgerät

E. coli MG1655 wurde in MOPS-Minimalmedium mit einem Gesamtvolumen von 200ml kultiviert, bis eine A600 von 0,5 erreicht war. Für die Stressbehandlung wurde die Kultur in 50-ml-Kulturen aufgeteilt. Nach 15 min Inkubation mit 0,79 mM Allicin, 1 mM Diamid oder Dimethylsulfoxid (Kontrolle) wurden die Zellen bei 4.000g und 4°C für 10 min geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit KPE-Puffer gewaschen, bevor die Pellets in 700µl KPE-Puffer resuspendiert wurden. Zur Deproteinierung wurden 300l 10%ige (w/v) Sulfosalicylsäure zugesetzt, bevor die Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen wurden (3 x 1 min; VialTweeter-Ultraschallgerät). Die Überstände wurden nach Zentrifugation gesammelt (30 min, 13.000g, 4°C). Die Sulfosalicylsäurekonzentrationen wurden durch Zugabe von 3 Volumina KPE-Puffer auf 1% gesenkt. Die Messungen von Gesamtglutathion und GSSG wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die zellulären Glutathionkonzentrationen wurden auf Grundlage eines Volumens der E. coli-Zellen von 6,7×10^-15 Liter und einer Zelldichte von A600 0,5 (entsprechend 1×10⁸ Zellen ml^-1 Kultur) berechnet. Die GSH-Konzentrationen wurden durch Subtraktion von 2[GSSG] vom Gesamtglutathion berechnet. (Müller et al. 2016)

Expression von humaner mAspAT in E. coli unter Verwendung eines Ultraschallhomogenisators

Eine einzelne Kolonie von E. coli BL21 (DE3), die den Expressionsvektor trug, wurde in 30 mL Luria-Bertani-Medium (LB) mit 100μg/mL Ampicillin eingebracht und anschließend bei 37ºC kultiviert, bis die optische Dichte (OD₆₀₀) 0,6 erreichte. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 10 min geerntet und in 3L frischem LB-Medium mit 100μg/mL Ampicillin resuspendiert.
Anschließend wurde die Proteinexpression mit 1 mM Isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 20 h bei 16ºC induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min geerntet und mit Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewaschen. Aus 3 L Kultur wurden etwa 45g Zellen (Feuchtgewicht) gewonnen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellpellets in 40 mL eiskaltem Extraktionspuffer A (für 1 L Kultur) resuspendiert und bei eiskalter Temperatur mit dem Ultraschall-Zellaufschlussgerät UP400St von Hielscher lysiert. Das Zelllysat wurde bei 12.000 rpm für 15 min zentrifugiert, um lösliche (Überstand) und präzipitierte (Pellet) Fraktionen zu trennen. (Jiang et al. 2015)

Wissenswertes

E. coli

Escherichia coli (E. coli) ist ein gramnegatives, fakultativ anaerobes, stäbchenförmiges, coliformes Bakterium der Gattung Escherichia, das häufig im unteren Darmabschnitt warmblütiger Organismen (Endothermen) vorkommt. Es gibt zahlreiche E. coli-Stämme (oder Subtypen) mit unterschiedlichen Eigenschaften. Die meisten E. coli-Stämme sind für den Menschen harmlos, z. B. die Stämme B und K-12, die häufig für Forschungsanwendungen in Laboren eingesetzt werden. Einige Stämme sind jedoch schädlich und können schwere Erkrankungen verursachen.
E. coli spielt eine wichtige Rolle in der modernen Biotechnologie und industriellen Mikrobiologie, da sich das Bakterium leicht manipulieren lässt. Zu den häufigen Laboranwendungen von E. coli gehören z. B. die Herstellung rekombinanter Desoxyribonukleinsäure (DNA) und der Einsatz als Modellorganismus.
E. coli ist ein sehr vielseitiger Wirt für die Produktion heterologer Proteine. Für die Herstellung rekombinanter Proteine in E. coli stehen zahlreiche Proteinexpressionssysteme zur Verfügung. Mithilfe von Plasmiden, die eine hohe Proteinexpression ermöglichen, können Gene in die Bakterien eingebracht werden. Dadurch lassen sich solche Proteine in industriellen Fermentationsprozessen in großen Mengen herstellen.
E. coli werden als Zellfabriken zur Herstellung von Insulin verwendet. Weitere Anwendungen umfassen den Einsatz modifizierter E. coli-Zellen zur Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen und immobilisierten Enzymen, zur Produktion von Biokraftstoffen sowie zur Bioremediation.
Der Stamm K-12 ist eine mutierte Form von E. coli, die das Enzym alkalische Phosphatase (ALP) überexprimiert. Diese Mutation entsteht durch einen Defekt in dem Gen, das ständig für das Enzym codiert. Wenn ein Gen ohne jegliche Hemmung ein Produkt erzeugt, wird dies als konstitutive Aktivität bezeichnet. Diese spezifische mutierte Form wird zur Isolierung und Aufreinigung des ALP-Enzyms verwendet.
E. coli-Bakterien werden auch häufig als Zellfabriken eingesetzt. Gentechnisch veränderte Mikroorganismen (z. B. Bakterien) und Pflanzenzellen können als sogenannte Zellfabriken dienen. Diese genetisch veränderten Zellen produzieren Moleküle, Chemikalien, Polymere, Proteine und andere Substanzen, die beispielsweise in der Pharma-, Lebensmittel- und chemischen Industrie verwendet werden. Um die im Inneren solcher biotechnologisch veränderten Zellen produzierten Moleküle freizusetzen, ist die Ultraschalllyse eine gängige Methode, mit der die Zellwände aufgebrochen und die Zielsubstanzen in die umgebende Flüssigkeit überführt werden. Lesen Sie mehr über die Lyse biotechnologisch veränderter Zellen!

DNA-Scherung mittels Ultraschall

Ultraschall-Scherkräfte werden häufig eingesetzt, um Moleküle, Organellen und Proteine aus dem Zellinneren freizusetzen sowie DNA-Stränge in Fragmente zu zerlegen. Akustische Kavitation bricht die Zellwände und Membranen auf, um DNA aus den Zellen zu extrahieren und Fragmente mit einer Länge von etwa 600 – 800 bp zu erzeugen, die sich ideal für die Analyse eignen.
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Literatur / Quellen

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

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