Ultraschall-gestützter Aufschluss biotechnologischer Zellfabriken in der industriellen Produktion

Biotechnologisch veränderte Bakterienarten wie E. coli sowie gentechnisch veränderte Säugetier- und Pflanzenzelltypen werden in der Biotechnologie häufig zur Expression von Molekülen verwendet. Um diese synthetisierten Biomoleküle freizusetzen, ist eine zuverlässige Technik den Zellaufschluss erforderlich. Hochleistungs-Ultraschall ist eine bewährte Methode für den effizienten und zuverlässigen Zellaufschluss – und zudem leicht skalierbar auf große Durchsatzmengen. Hielscher Ultrasonics bietet Ihnen Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die effiziente Zelllyse, um große Mengen hochwertiger Biomoleküle zu produzieren.

Extraktion von Molekülen aus Zellfabriken

Für die Herstellung zahlreicher Biomoleküle können verschiedene gentechnisch veränderte Mikroben und Pflanzenzellen als mikrobielle Zellfabriken verwendet werden, darunter Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobakterien, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana, Algen, und viele andere. Diese Zellfabriken können Proteine, Lipide, Biochemikalien, Polymere, Biokraftstoffe und Oleochemikalien produzieren, die z.B. als Lebensmittel oder Rohstoffe für industrielle Anwendungen genutzt werden. Zellen, die als Zellfabriken verwendet werden, werden in geschlossenen Bioreaktoren kultiviert, wo sie eine hohe Effizienz und Spezifität sowie einen geringen Energiebedarf erreichen können.
Um die Zielmoleküle aus den biotechnologisch hergestellten Zellkulturen zu isolieren, müssen die Zellen aufgebrochen werden, um dadurch das intrazelluläre Material freizusetzen. Ultraschall-Zelldesintegratoren haben sich als äußerst zuverlässige und effiziente Technik für den Zellaufschluss und die Freisetzung von Substanzen bewährt.

Bei mikrobiellen Zellfabriken handelt es sich um metabolisch veränderte Zellen, welche für die Synthese verschiedener nützlicher Verbindungen eingesetzt werden. Der Zellaufschluss mit Ultraschall ist eine effiziente und zuverlässige Methode zur Freisetzung der synthestisierten Verbindungen aus dem Zellinneren.
Studie und Grafik: ©Villaverde, 2010.

Vorteile von Ultraschall-Zelldesintegratoren

Als nicht-thermische, milde und dennoch hocheffiziente Technologie werden Ultraschalldesintegratoren im Labor und in der Industrie eingesetzt, um Zellen zu lysieren und hochwertige Extrakte herzustellen, z.B. mittels Isolierung von Molekülen aus Zellfabriken.

Leistungs-Ultraschall zur effizienten Lyse von mikrobiellen Zellfabriken

Mechanismus und Auswirkungen von Ultraschall-Zelldesintegratoren:
Beim Ultraschall-Zellaufschluss wird die Kraft der Ultraschallwellen genutzt. Der Ultraschall-Homogenisator/Desintegrator ist mit einer Sonde (auch Sonotrode genannt) aus einer Titanlegierung ausgestattet, welche mit einer hohen Frequenz von ca. 20 kHz schwingt. Das heißt, die Ultraschallsonotrode koppelt 20.000 Schwingungen pro Sekunde in die beschallte Flüssigkeit ein. Die in die Flüssigkeit eingekoppelten Ultraschallwellen sind durch abwechselnde Hoch- und Niederdruckzyklen gekennzeichnet. Während eines Niederdruckzyklus dehnt sich die Flüssigkeit aus und es entstehen winzige Vakuumbläschen. Diese sehr kleinen Bläschen wachsen über mehrere Wechseldruckzyklen, bis sie keine Energie mehr aufnehmen können. An diesem Punkt implodieren die Kavitationsblasen heftig und erzeugen lokal eine außergewöhnlich energiedichte Umgebung. Dieses Phänomen wird als akustische Kavitation bezeichnet und ist durch lokal sehr hohe Temperaturen, sehr hohe Drücke und Scherkräfte gekennzeichnet. Diese Scherkräfte brechen Zellwände auf und erhöhen den Stoffaustausch zwischen dem Zellinneren und dem umgebenden Lösungsmittel. Als rein mechanische Technik sind die mit Ultraschall erzeugten Scherkräfte weit verbreitet und das bevorzugte Verfahren für den Aufschluss von Bakterienzellen sowie für die Isolierung von Proteinen. Als einfache und schnelle Methode des Zellaufschlusses ist Ultraschall ideal für die Isolierung kleiner, mittlerer und großer Volumina. Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher sind mit einem übersichtlichen Bedienmenü ausgestattet, das eine präzise Steuerung der Beschallungsparameter ermöglicht. Alle Beschallungsdaten werden automatisch auf einer eingebauten SD-Karte gespeichert und können einfach exportiert werden. Ausgefeilte Möglichkeiten der Wärmeabfuhr wie externe Kühlung, Beschallung im Pulsbetrieb etc. während des Ultraschall-Zellaufschlusses sorgen für die Einhaltung der idealen Prozesstemperatur und damit für die Unversehrtheit der extrahierten wärmeempfindlichen Substanzen.

Die Forschung unterstreicht die Stärken des Zellaufschlusses mittels Ultraschall

Prof. Chemat et al. (2017) fassen in ihrer Studie zusammen, dass "die ultraschall-gestützte Extraktion eine umweltfreundliche und wirtschaftlich tragfähige Alternative zu herkömmlichen Verfahren für Lebensmittel und Naturprodukte ist. Die Hauptvorteile sind die Verringerung der Extraktions- und Verarbeitungszeit, des Energie- und Lösungsmittelverbrauchs, der Betriebseinheiten sowie der CO₂ Emissionen".
Gabig-Ciminska et al. (2014) verwendeten in ihrer Studie einen Hochdruckhomogenisator und einen Ultraschall-Zellaufschlussgerät für die Lyse von Sporen, um DNA freizusetzen. Das Forscherteam vergleicht beide Zellaufschlussmethoden und kommt zu dem Schluss, dass "der Ultraschall-Zellaufschluss für diesen Zweck hervorragende Vorteile hat. Die Ultraschallmethode ist relativ schnell und kann auch bei kleinen Probenmengen durchgeführt werden." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleküle aus Zellfabriken für die Lebensmittelproduktion

Mikrobielle Zellfabriken sind eine praktikable und effiziente Produktionsmethode, bei der mikrobielle Organismen eingesetzt werden, um durch metabolisches Bio-Engineering von mikrobiellen Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilzen usw. hohe Erträge an natürlich vorkommenden sowie nicht natürlich vorkommenden Stoffwechselprodukten zu erzielen. In der groß-skaligen Produktion von Enzymen werden z.B. Mikroorganismen wie Aspergillus oryzae, Pilzen und Bakterien genutzt. Diese im großen Maßstab synthetisierten Enzyme kommen u.a. in der Lebensmittel- und Getränkeherstellung sowie in der Landwirtschaft, der Bioenergie und der Haushaltspflege zum Einsatz.
Bestimmte Bakterien wie Acetobacter xylinum und Gluconacetobacter xylinus produzieren Zellulose während des Fermentationsprozesses. Dabei werden Nanofasern in einem Bottom-up-Prozess synthetisiert. Bakterielle Zellulose (auch als mikrobielle Cellulose bezeichnet) ist chemisch äquivalent zu pflanzlicher Zellulose, weist jedoch einen hohen Kristallinitätsgrad und eine hohe Reinheit (frei von Lignin, Hemizellulose, Pektin und anderen biogenen Bestandteilen) sowie eine einzigartige Struktur an Zellulose-Nanofasern auf, welche aus einem dreidimensionalen (3D) netzartigen Netzwerk bestehen. (vgl. Zhong, 2020) Im Vergleich zu pflanzlicher Zellulose ist bakterielle Zellulose nachhaltiger; zudem weist die bio-synthesisch produzierte Zellulose einen hohen Reinheitsgrad auf und erfordert daher keine komplexen Reinigungsschritte. Ultraschall und die Lösungsmittelextraktion mit NaOH oder SDS (Natriumdodecylsulfat) sind sehr effektiv für die Isolierung von bakterieller Zellulose aus Bakterienzellen.

Biomoleküle aus Zellfabriken für die Herstellung von Arzneimitteln und Impfstoffen

Eines der bekanntesten pharmazeutischen Produkte aus Zellfabriken ist Humaninsulin. Für die biotechnologische Insulinproduktion werden vor allem E. coli und Saccharomyces cerevisiae verwendet. Da bio-synthetisierte Moleküle in Nanogröße eine hohe Biokompatibilität aufweisen, sind biologische Nanopartikel wie z.B. nano-skaliges Ferritin für zahlreiche Biomanufacturing-Anwendungen von Vorteil. Darüber hinaus ist die Produktion in metabolisch veränderten Mikroben oft wesentlich effizienter in Bezug auf die erzielten Ausbeuten. So konnte beispielsweise die Produktion von Artemisinsäure, Resveratrol und Lycopin um das Zehn- bis Hundertfache gesteigert werden und ist bereits in der Industrie etabliert bzw. befindet sich im Entwicklungsstadium zur Produktion im industriellen Maßstab. (vgl. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
So sind beispielsweise Biomoleküle auf Proteinbasis in Nanogröße mit selbstassemblierenden Eigenschaften wie Ferritin und virusähnliche Partikel für die Entwicklung von Impfstoffen besonders interessant, da sie sowohl die Größe als auch die Struktur von Krankheitserregern nachahmen und sich für die Oberflächenkonjugation von Antigenen eignen, um die Interaktion mit Immunzellen zu fördern. Solche Moleküle werden in so genannten Zellfabriken (z.B. manipulierten E. coli-Stämmen) exprimiert, welche dadurch ein bestimmtes Zielmolekül produzieren.

Protokoll für die Ultraschall-Lyse von E. coli BL21 zur Freisetzung von Ferritin

Ferritin ist ein Protein, dessen Hauptfunktion die Speicherung von Eisen ist. Ferritin zeigt vielversprechende Fähigkeiten als selbstorganisierender Nanopartikel in Impfstoffen, wo es als Impfstoffträger verwendet wird (z.B. SARS-Cov-2-Spike-Proteine). Die wissenschaftliche Forschung von Sun et. al. (2016) zeigen, dass rekombinantes Ferritin bei niedrigen NaCl-Konzentrationen (≤50 mmol/L) als lösliche Form aus Escherichia coli freigesetzt werden kann. Um Ferritin in E. coli BL21 zu exprimieren und das Ferritin freizusetzen, wurde das folgende Protokoll erfolgreich angewendet. Das rekombinante pET-28a/Ferritin-Plasmid wurde in die E. coli BL21 (DE3)-Linie transformiert. Die Ferritin E. coli BL21 (DE3) Zellen wurden in LB-Wachstumsmedien mit 0,5% Kanamycin bei 37°C kultiviert und bei einer OD600 von 0,6 mit 0,4% Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid für 3 Stunden bei 37°C induziert. Die fertige Kultur wurde dann durch Zentrifugation bei 8000g für 10 Minuten bei 4°C geerntet, und das Pellet wurde gesammelt. Anschließend wurde das Pellet in LB-Medium (1 % NaCl, 1 % Typone, 0,5 % Hefeextrakt)/Lysepuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) und verschiedenen Konzentrationen von NaCl-Lösung (0, 50, 100, 170 und 300 mmol/L) resuspendiert. Für die Lyse von Bakterienzellen wurde die Beschallung im Pulsmodus durchgeführt: z. B. mit dem Ultraschallgerät UP400St bei 100 % Amplitude mit einem Beschallungszyklus von 5 Sekunden EIN, 10 Sekunden AUS, für 40 Zyklen) und dann bei 10 000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand und das Präzipitat wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Alle Natriumdodecylsulfat-gefärbten Gele wurden mit einem hochauflösenden Scanner gescannt. Die Gelbilder wurden mit der Software Magic Chemi 1D analysiert. Für optimale Klarheit wurden die Proteinbanden durch Anpassung der Parameter erkannt. Die Daten für die Banden wurden aus technischen Triplikaten gewonnen. (vgl. Sun et al., 2016)

Ultraschall-Zelldisruptoren für die industrielle Lyse von Zellfabriken

Der Zellaufschluss und Extraktion mittels Ultraschall ist eine zuverlässige und bequeme Methode zur Freisetzung von Stoffwechselprodukten aus Zellfabriken, wodurch eine effiziente Produktion von Zielmolekülen ermöglicht wird. Ultraschall-Zelldesintegratoren sind vom Labormaßstab bis zur Industriegröße erhältlich, und alle Ultraschallprozesse können vollständig linear skaliert werden.
Hielscher Ultrasonics ist Ihr kompetenter Partner für Hochleistungs-Ultraschalldesintegratoren und verfügt über langjährige Erfahrung auf dem Gebiet der Implantation von Ultraschallsystemen im Labor- und Industriebereich.
Die Zellaufschluss-Systeme von Hielscher Ultrasonics erfüllen in puncto ausgefeilter Hard- und Software alle Anforderungen für optimale Prozesskontrolle, einfache Bedienung und Benutzerfreundlichkeit. Kunden und Anwender von Hielscher Ultraschallgeräten schätzen den Vorteil, dass Hielscher Ultraschall-Zelldesintegratoren und -extraktoren eine präzise Prozessüberwachung und Steuerung – über ein digitales Touch-Display und Browser-Fernsteuerung erlauben. Alle wichtigen Beschallungsdaten (z.B. Nettoenergie, Gesamtenergie, Amplitude, Dauer, Temperatur, Druck) werden automatisch als CSV-Datei auf einer integrierten SD-Karte gespeichert. Dies vereinfacht es, reproduzierbare und wiederholbare Ergebnisse zu erhalten und erleichtert die Prozessstandardisierung sowie die Erfüllung der Good Manufacturing Practices (cGMP).
Selbstverständlich sind die Hielscher Ultraschallprozessoren für den 24/7-Betrieb unter Volllast ausgelegt und können daher zuverlässig in der industriellen Produktion betrieben werden. Durch die hohe Robustheit und den geringen Wartungsaufwand sind die Ausfallzeiten der Ultraschallgeräte sehr gering. CIP- (clean-in-place) und SIP- (sterilize-in-place) Funktionen minimieren die aufwändige Reinigung, zumal alle Nassteile glatte Metalloberflächen aufweisen (keine versteckten Öffnungen oder Düsen).

In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren: