Ultraschalllyse biotechnologisch veränderter Zellen in der industriellen Produktion

Biotechnologisch veränderte Bakterienarten wie E. coli sowie gentechnisch veränderte Säugetier- und Pflanzenzelltypen werden in der Biotechnologie häufig zur Expression von Molekülen eingesetzt. Um diese synthetisierten Biomoleküle freizusetzen, ist ein zuverlässiges Zellaufschlussverfahren erforderlich. Hochleistungsultraschall ist eine bewährte Methode für eine effiziente und zuverlässige Zelllyse – einfach auf hohe Durchsätze skalierbar. Hielscher Ultrasonics bietet Ihnen leistungsstarke Ultraschallgeräte für eine wirksame Zelllyse zur Herstellung großer Mengen hochwertiger Biomoleküle.

Extraktion von Molekülen aus Zellfabriken

Zur Herstellung einer Vielzahl von Biomolekülen können verschiedene biotechnologisch veränderte Mikroorganismen und Pflanzenzellen als mikrobielle Zellfabriken eingesetzt werden, darunter Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobakterien, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana und Algen sowie viele weitere. Diese Zellfabriken können Proteine, Lipide, Biochemikalien, Polymere, Biokraftstoffe und Oleochemikalien herstellen, die als Lebensmittel oder Rohstoffe für industrielle Anwendungen dienen. Als Zellfabriken eingesetzte Zellen werden in geschlossenen Bioreaktoren kultiviert, in denen sie eine hohe Effizienz und Spezifität bei geringem Energiebedarf erreichen können.
Um die Zielmoleküle aus den biotechnologisch veränderten Zellkulturen zu isolieren, müssen die Zellen aufgeschlossen werden, sodass das intrazelluläre Material freigesetzt wird. Ultraschall-Zellaufschlussgeräte sind als äußerst zuverlässige und effiziente Technik zur Zelldesintegration und Stofffreisetzung etabliert.

Mikrobielle Zellfabriken sind Zellen mit gezielt verändertem Stoffwechsel, die zur Synthese verschiedener wertvoller Verbindungen eingesetzt werden. Der Zellaufschluss mittels Ultraschall ist eine effiziente und zuverlässige Methode, um die wertvollen Verbindungen aus dem Zellinneren freizusetzen.
Studie und Grafik: ©Villaverde, 2010.

Vorteile von Ultraschall-Zellaufschlussgeräten

Der Zellaufschluss mittels Ultraschall ist eine nichtthermische, schonende und dennoch hocheffiziente Technologie, die in Labor und Industrie zur Zelllyse und zur Herstellung hochwertiger Extrakte eingesetzt wird, z. B. zur Isolierung von Molekülen aus Zellfabriken.

Leistungsultraschall für den effizienten Aufschluss mikrobieller Zellfabriken

Mechanismus und Wirkungen von Ultraschall-Zellaufschlussgeräten:
Der Zellaufschluss mittels Ultraschall nutzt die Leistung von Ultraschallwellen. Der Ultraschallhomogenisator bzw. das Zellaufschlussgerät ist mit einer Sonotrode aus einer Titanlegierung ausgestattet, die mit einer hohen Frequenz von etwa 20 kHz schwingt. Das bedeutet, dass die Sonotrode 20.000 (zwanzigtausend) Schwingungen pro Sekunde in die beschallte Flüssigkeit einkoppelt. Die in die Flüssigkeit eingekoppelten Ultraschallwellen sind durch abwechselnde Hochdruck- und Niederdruckzyklen gekennzeichnet. Während eines Niederdruckzyklus dehnt sich die Flüssigkeit aus, und winzige Vakuumblasen entstehen. Diese sehr kleinen Blasen wachsen über mehrere wechselnde Druckzyklen hinweg, bis sie keine weitere Energie aufnehmen können. Dann implodieren die Kavitationsblasen heftig und erzeugen lokal eine Umgebung mit außergewöhnlich hoher Energiedichte. Dieses Phänomen wird als akustische Kavitation bezeichnet und ist durch lokal sehr hohe Temperaturen, sehr hohe Drücke und Scherkräfte gekennzeichnet. Diese Scherspannungen brechen Zellwände effizient auf und erhöhen den Stofftransport zwischen dem Zellinneren und dem umgebenden Lösungsmittel. Der Einsatz ultraschallerzeugter Scherkräfte ist ein rein mechanisches Verfahren, das sowohl für den bakteriellen Zellaufschluss als auch für die Proteinisolierung häufig genutzt und empfohlen wird. Als einfache und schnelle Zellaufschlussmethode eignet sich die Beschallung ideal für die Isolierung aus kleinen, mittleren und großen Volumina. Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher verfügen über ein übersichtliches Einstellungsmenü zur präzisen Steuerung der Beschallung. Alle Beschallungsdaten werden automatisch auf einer integrierten SD-Karte gespeichert und sind leicht zugänglich. Ausgereifte Möglichkeiten zur Wärmeabfuhr, etwa externe Kühlung, Beschallung im Pulsbetrieb usw., gewährleisten während der Ultraschalldesintegration die Einhaltung der idealen Prozesstemperatur und damit die Unversehrtheit der extrahierten wärmeempfindlichen Verbindungen.

Forschung unterstreicht die Stärken des Zellaufschlusses und der Extraktion mittels Ultraschall

Prof. Chemat et al. (2017) fassen in ihrer Studie zusammen: „Die ultraschallunterstützte Extraktion ist eine umweltfreundliche und wirtschaftlich tragfähige Alternative zu konventionellen Verfahren für Lebensmittel und Naturprodukte. Die wichtigsten Vorteile sind die Verringerung der Extraktions- und Verarbeitungszeit, des Energie- und Lösungsmittelverbrauchs, der Anzahl der Grundoperationen und der CO₂-Emissionen.“
Gabig-Ciminska et al. (2014) verwendeten in ihrer Studie einen Hochdruckhomogenisator und ein Ultraschall-Zellaufschlussgerät zur Lyse von Sporen, um DNA freizusetzen. Beim Vergleich beider Zellaufschlussmethoden gelangt das Forschungsteam hinsichtlich der Zelllyse zur Gewinnung von Sporen-DNA zu folgendem Schluss: „Die Analyse wurde mit Zelllysaten aus der Hochdruckhomogenisierung durchgeführt. Anschließend erkannten wir, dass der Zellaufschluss mittels Ultraschall für diesen Zweck herausragende Vorteile bietet. Er ist relativ schnell und lässt sich auch bei kleinen Probenvolumina durchführen.“ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleküle aus Zellfabriken für die Lebensmittelproduktion

Mikrobielle Zellfabriken stellen ein praktikables und effizientes Produktionsverfahren dar, bei dem mikrobielle Organismen durch gezielte biotechnologische Veränderungen ihres Stoffwechsels hohe Ausbeuten an nativen und nicht nativen Metaboliten erzeugen. Hierfür werden Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilze usw. eingesetzt. In großen Mengen benötigte Enzyme werden beispielsweise mithilfe von Mikroorganismen wie Aspergillus oryzae, Pilzen und Bakterien hergestellt. Diese Enzyme werden in der Lebensmittel- und Getränkeproduktion sowie in der Landwirtschaft, der Bioenergie und in Haushaltsreinigungs- und Pflegemitteln eingesetzt.
Bestimmte Bakterien wie Acetobacter xylinum und Gluconacetobacter xylinus produzieren während der Fermentation Cellulose, wobei Nanofasern in einem Bottom-up-Prozess synthetisiert werden. Bakterielle Cellulose (auch als mikrobielle Cellulose bekannt) entspricht chemisch der pflanzlichen Cellulose, weist jedoch einen hohen Kristallinitätsgrad, eine hohe Reinheit (frei von Lignin, Hemicellulose, Pektin und anderen biogenen Bestandteilen) sowie eine einzigartige Struktur aus zu einem dreidimensionalen (3D) Netzwerk verwobenen Cellulose-Nanofasern auf. (vgl. Zhong, 2020) Im Vergleich zu pflanzlicher Cellulose ist bakterielle Cellulose nachhaltiger, und die produzierte Cellulose ist rein, sodass keine aufwendigen Reinigungsschritte erforderlich sind. Ultraschallbehandlung und Lösungsmittelextraktion mit NaOH oder SDS (Natriumdodecylsulfat) sind sehr wirksam zur Isolierung bakterieller Cellulose aus den Bakterienzellen.

Biomoleküle aus Zellfabriken für die Arzneimittel- und Impfstoffproduktion

Eines der bekanntesten pharmazeutischen Produkte aus Zellfabriken ist Humaninsulin. Für die biotechnologische Insulinproduktion werden vorwiegend E. coli und Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Da biosynthetisierte Moleküle im Nanomaßstab eine hohe Biokompatibilität aufweisen, sind biologische Nanopartikel wie Ferritin für zahlreiche Anwendungen in der biotechnologischen Herstellung vorteilhaft. Außerdem ist die Produktion in Mikroorganismen mit gezielt verändertem Stoffwechsel hinsichtlich der erzielten Ausbeuten häufig deutlich effektiver. So wurde beispielsweise die Produktion von Artemisinsäure, Resveratrol und Lycopin um das Zehnfache bis hin zum Mehrhundertfachen gesteigert; die Herstellung im industriellen Maßstab ist bereits etabliert oder befindet sich in der Entwicklung. (vgl. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Proteinbasierte Biomoleküle im Nanomaßstab mit selbstassemblierenden Eigenschaften, etwa Ferritin und virusähnliche Partikel, sind beispielsweise für die Impfstoffentwicklung besonders interessant, da sie sowohl die Größe als auch die Struktur von Krankheitserregern nachahmen und die Konjugation von Antigenen an ihrer Oberfläche ermöglichen, um die Interaktion mit Immunzellen zu fördern. Solche Moleküle werden in sogenannten Zellfabriken exprimiert (z. B. in biotechnologisch veränderten E. coli-Stämmen), die ein bestimmtes Zielmolekül produzieren.

Protokoll für die Ultraschalllyse von E. coli BL21 zur Freisetzung von Ferritin

Ferritin ist ein Protein, dessen Hauptfunktion die Speicherung von Eisen ist. Ferritin zeigt vielversprechende Eigenschaften als selbstassemblierender Nanopartikel in Impfstoffen, wo es als Impfstoffträger eingesetzt wird (z. B. für SARS-Cov-2-Spike-Proteine). Die wissenschaftliche Untersuchung von Sun et al. (2016) zeigt, dass rekombinantes Ferritin bei niedrigen NaCl-Konzentrationen (≤50 mmol/L) in löslicher Form aus Escherichia coli freigesetzt werden kann. Um Ferritin in E. coli BL21 zu exprimieren und freizusetzen, wurde das folgende Protokoll erfolgreich angewendet. Das rekombinante pET-28a/Ferritin-Plasmid wurde durch Transformation in den Stamm E. coli BL21 (DE3) eingebracht. Die Ferritin produzierenden E. coli BL21 (DE3)-Zellen wurden in LB-Nährmedien mit 0,5% Kanamycin bei 37°C kultiviert und bei einer OD600 von 0,6 mit 0,4% Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid für 3 Stunden bei 37°C induziert. Die fertige Kultur wurde anschließend durch Zentrifugation bei 8000g für 10 Minuten bei 4°C geerntet und das Pellet gesammelt. Danach wurde das Pellet in LB-Medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% Hefeextrakt)/Lysepuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) bzw. in NaCl-Lösung unterschiedlicher Konzentrationen (0, 50, 100, 170 und 300 mmol/L) resuspendiert. Für die bakterielle Zelllyse wurde im Pulsbetrieb beschallt (z. B. mit dem Ultraschallgerät UP400St bei 100% Amplitude mit einem Schaltzyklus von 5 Sekunden EIN und 10 Sekunden AUS über 40 Zyklen) und anschließend bei 10 000g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand und das Präzipitat wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Alle mit Natriumdodecylsulfat gefärbten Gele wurden mit einem hochauflösenden Scanner gescannt. Die Gelbilder wurden mit der Software Magic Chemi 1D analysiert. Für eine optimale Erkennbarkeit wurden die Parameter zur Detektion der Proteinbanden angepasst. Die Daten für die Banden wurden aus technischen Dreifachbestimmungen gewonnen. (vgl. Sun et al., 2016)

Ultraschall-Zellaufschlussgeräte für die industrielle Lyse von Zellfabriken

Ultraschalllyse und -extraktion sind eine zuverlässige und komfortable Methode zur Freisetzung von Metaboliten aus Zellfabriken und unterstützen dadurch eine effektive Produktion von Zielmolekülen. Ultraschall-Zellaufschlussgeräte sind vom Labor- bis zum Industriemaßstab verfügbar, und die Prozesse lassen sich vollständig linear skalieren.
Hielscher Ultrasonics ist Ihr kompetenter Partner für leistungsstarke Ultraschall-Zellaufschlussgeräte und verfügt über langjährige Erfahrung mit der Implementierung von Ultraschallsystemen im Technikums- und Industriebereich.
Mit ihrer ausgereiften Hard- und Software erfüllen die Zellaufschlusssysteme von Hielscher Ultrasonics alle Anforderungen an optimale Prozesssteuerung, einfache Bedienung und Benutzerfreundlichkeit. Kunden und Anwender der Ultraschallgeräte von Hielscher schätzen den Vorteil, dass die Ultraschall-Zellaufschlussgeräte und Extraktoren von Hielscher eine präzise Prozessüberwachung und -steuerung ermöglichen – über ein digitales Touchdisplay und die Fernsteuerung per Browser. Alle wichtigen Beschallungsdaten (z. B. Nettoenergie, Gesamtenergie, Amplitude, Dauer, Temperatur, Druck) werden automatisch als CSV-Datei auf einer integrierten SD-Karte gespeichert. Dies hilft, reproduzierbare und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen, und erleichtert die Prozessstandardisierung sowie die Einhaltung der Guten Herstellungspraxis (cGMP).
Selbstverständlich sind die Ultraschallprozessoren von Hielscher für den 24/7-Betrieb unter Volllast ausgelegt und können daher zuverlässig in der industriellen Produktion eingesetzt werden. Dank hoher Robustheit und geringem Wartungsbedarf sind die Stillstandszeiten der Ultraschallgeräte sehr kurz. CIP- (Clean-in-Place) und SIP-Funktionen (Sterilize-in-Place) minimieren den Aufwand für die Reinigung, insbesondere da alle medienberührten Teile glatte Metalloberflächen aufweisen (keine verborgenen Öffnungen oder Düsen).

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte: