Biosynthetische Herstellung von Humanen Milch-Oligosacchariden

Die Biosynthese von Humanmilch-Oligosacchariden (HMOs) durch Fermentation oder enzymatische Reaktionen ist ein komplexer, aufwendiger und oft wenig ergiebiger Prozess. Ultraschall erhöht den Massentransfer zwischen Substrat und Zellfabriken und stimuliert das Zellwachstum und den Stoffwechsel. Dadurch intensiviert die Beschallung die Fermentation und biochemische Prozesse, was zu einer beschleunigten und effizienteren Produktion von HMOs führt.

Humanmilch-Oligosaccharide

Humanmilch-Oligosaccharide (HMOs), auch als humane Milchglykane bekannt, sind Zuckermoleküle, die zur Gruppe der Oligosaccharide gehören. Prominente Beispiele für HMOs sind 2'-Fucosyllactose (2′-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), 3'-Galactosyllactose (3′-GL), und Difucosyllactose (DFL).
Während sich die menschliche Muttermilch aus mehr als 150 verschiedenen HMO-Strukturen zusammensetzt, werden derzeit nur 2′-Fucosyllactose (2′-FL) und Lacto-N-neotetraose (LNnT) auf kommerzieller Ebene hergestellt und als Nahrungszusatzstoffe in Säuglingsanfangsnahrung verwendet.
Humanmilch-Oligosaccharide (HMOs) sind für ihre Bedeutung in der Säuglingsernährung bekannt. Humanmilch-Oligosaccharide sind eine einzigartige Art von Nährstoffen, die im Darm des Säuglings als Präbiotika, antiadhäsive antimikrobielle Wirkstoffe und Immunmodulatoren wirken und wesentlich zur Entwicklung des Gehirns beitragen. HMOs kommen ausschließlich in menschlicher Muttermilch vor; andere Säugetiermilchen (z.B. Kuh-, Ziegen-, Schaf-, Kamelmilch usw.) weisen diese spezifische Form von Oligosacchariden nicht auf.
Humanmilch-Oligosaccharide sind die dritthäufigste feste Komponente in der menschlichen Milch, die entweder in gelöster oder emulgierter oder suspendierter Form in Wasser vorliegen kann. Laktose und Fettsäuren sind die am häufigsten vorkommenden Feststoffe in der menschlichen Milch. HMOs sind in einer Konzentration von 0,35-0,88 Unzen (9,9-24,9 g)/L vorhanden. Es sind etwa 200 strukturell unterschiedliche Oligosaccharide aus menschlicher Milch bekannt. Das dominierende Oligosaccharid bei 80% aller Frauen ist 2′-Fucosyllactose, die in der menschlichen Muttermilch in einer Konzentration von ca. 2,5 g/L vorhanden ist.
Da HMOs nicht verdaut werden, tragen sie nicht kalorisch zur Ernährung bei. Da sie unverdauliche Kohlenhydrate sind, wirken sie als Präbiotika und werden von der erwünschten Darmmikroflora, insbesondere Bifidobakterien, selektiv fermentiert.

Biosynthese von Humanmilch-Oligosacchariden

Zellfabriken und enzymatische / chemo-enzymatische Systeme sind aktuelle Technologien, die für die Synthese von HMOs verwendet werden. Für die HMO-Produktion im industriellen Maßstab sind die Fermentation von mikrobiellen Zellfabriken, die biochemische Synthese und verschiedene enzymatische Reaktionen machbare Wege der HMO-Bioproduktion. Aus wirtschaftlichen Gründen ist die Biosynthese mittels mikrobieller Zellfabriken derzeit die einzige Technik, die auf industrieller Produktionsebene von HMOs eingesetzt wird.

Fermentation von HMOs mit Hilfe von mikrobiellen Zellfabriken

E.coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis sind häufig verwendete Zellfabriken, die für die Bioproduktion von biologischen Molekülen wie HMOs verwendet werden. Fermentation ist ein biochemischer Prozess, bei dem Mikroorganismen verwendet werden, um ein Substrat in zielgerichtete biologische Moleküle umzuwandeln. Mikrobielle Zellfabriken verwenden einfache Zucker als Substrat, die sie in HMOs umwandeln. Da einfache Zucker (z.B. Laktose) ein reichlich vorhandenes, billiges Substrat sind, bleibt der Biosyntheseprozess kosteneffizient.
Wachstum und Biokonversionsrate werden hauptsächlich durch den Massentransfer von Nährstoffen (Substrat) zu den Mikroorganismen beeinflusst. Die Stofftransferrate ist ein Hauptfaktor, der die Produktsynthese während der Fermentation beeinflusst. Es ist bekannt, dass Ultraschall den Massentransfer fördert.
Während der Fermentation müssen die Bedingungen im Bioreaktor ständig überwacht und reguliert werden, damit die Zellen so schnell wie möglich wachsen können, um dann die gewünschten Biomoleküle (z.B. Oligosaccharide wie HMOs; Insulin; rekombinante Proteine) zu produzieren. Theoretisch beginnt die Produktbildung, sobald die Zellkultur zu wachsen beginnt. Vor allem bei gentechnisch veränderten Zellen wie z.B. technisierten Mikroorganismen wird sie jedoch in der Regel später durch Zugabe einer chemischen Substanz zum Substrat induziert, welche die Expression des Ziel-Biomoleküls hochreguliert. Ultraschall-Bioreaktoren (Sono-Bioreaktor) lassen sich präzise steuern und ermöglichen die spezifische Stimulation von Mikroben. Dies führt zu einer beschleunigten Biosynthese und höheren Ausbeuten.
Ultraschall-Lyse und -Extraktion: Die Fermentation von komplexen HMOs könnte durch niedrige Fermentationstiter und intrazellulär verbleibende Produkte eingeschränkt sein. Die Ultraschall-Lyse und -Extraktion wird verwendet, um intrazelluläres Material vor der Reinigung und nachgelagerten Prozessen freizusetzen.

Ultraschall-gestützte Fermentation

Die Wachstumsrate von Mikroben wie Escherichia coli, technisches E.coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis kann durch die Erhöhung der Stofftransferrate und der Zellwandpermeabilität durch Anwendung von kontrolliertem Niederfrequenz-Ultraschall beschleunigt werden. Als milde, nicht-thermische Verarbeitungstechnik bringt Ultraschall rein mechanische Kräfte in die Fermentationsbrühe ein.
Akustische Kavitation: Das Funktionsprinzip der Beschallung beruht auf der akustischen Kavitation. Die Ultraschallsonde (Sonotrode) koppelt Niederfrequenz-Ultraschallwellen in das Medium ein. Die Ultraschallwellen wandern durch die Flüssigkeit und erzeugen abwechselnde Hochdruck- (Kompression) und Niederdruckzyklen (Verdünnung). Indem die Flüssigkeit abwechselnd komprimiert und gedehnt wird, entstehen winzige Vakuumbläschen. Diese kleinen Vakuumbläschen wachsen über mehrere Zyklen hinweg, bis sie eine Größe erreichen, bei der sie keine weitere Energie mehr aufnehmen können. An diesem Punkt des maximalen Wachstums implodiert die Vakuumblase heftig und erzeugt lokal extreme Bedingungen, die als Kavitationsphänomen bekannt sind. Im Kavitations-"Hot-Spot" sind hohe Druck- und Temperaturunterschiede und intensive Scherkräfte mit Flüssigkeitsstrahlen von bis zu 280 m/s zu beobachten. Durch diese Kavitationseffekte wird ein gründlicher Stoffaustausch und Sonoporation (Perforation von Zellwänden und Zellmembranen) erreicht. Die Nährstoffe des Substrats werden zu und in die lebenden ganzen Zellen geschwemmt, so dass die Zellfabriken optimal ernährt und Wachstum sowie Umsatzraten beschleunigt werden. Ultraschall-Bioreaktoren sind eine einfache, aber hocheffektive Strategie zur Verarbeitung von Biomasse in einem One-Pot-Biosyntheseprozess.
Eine genau kontrollierte, milde Beschallung intensiviert bekanntlich Gärungsprozesse.
Die Beschallung verbessert "die Produktivität vieler Bioprozesse, an denen lebende Zellen beteiligt sind, durch die Verbesserung der Substrataufnahme, die Steigerung der Produktion oder des Wachstums durch Erhöhung der Zellporosität und die potenziell verbesserte Freisetzung von Zellbestandteilen". (Naveena et al. 2015)
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Naveena et al. (2015) fanden heraus, dass die Ultraschall-Intensivierung bei der Bioverarbeitung mehrere Vorteile bietet, u.a. niedrige Betriebskosten, einfache Bedienung, geringer Energie- und Wartungsbedarf.

Hochleistungs-Ultraschallreaktoren für die Fermentation

An Gärungsprozessen sind lebende Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefe beteiligt, die als Zellfabriken fungieren. Wenn Ultraschall angewendet wird, um den Massentransfer zu fördern und die Wachstums- und Umwandlungsrate der Mikroorganismen zu erhöhen, ist es entscheidend, die Ultraschallintensität genau zu kontrollieren, um eine Zerstörung der Zellfabriken zu vermeiden.
Hielscher Ultrasonics ist spezialisiert auf die Entwicklung, Herstellung und den Vertrieb von Hochleistungs-Ultraschallgeräten, die präzise gesteuert und überwacht werden können, um überlegene Fermentationserträge zu gewährleisten.

Die Prozesskontrolle ist nicht nur für hohe Erträge und überlegene Qualität unerlässlich, sondern ermöglicht auch die Wiederholung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Insbesondere bei der Stimulation von Zellfabriken ist die zellspezifische Anpassung der Beschallungsparameter essentiell, um hohe Ausbeuten zu erzielen und Zellabbau zu verhindern. Deshalb sind alle digitalen Modelle der Hielscher Ultraschallgeräte mit einer intelligenten Software ausgestattet, die es erlaubt, die Beschallungsparameter einzustellen, zu überwachen und zu nachzuregulieren. Ultraschall-Prozessparameter wie Amplitude, Temperatur, Druck, Beschallungsdauer, Arbeitszyklen und Energieeintrag sind unerlässlich, um die HMO-Produktion durch Fermentation zu fördern.
Die intelligente Software der Hielscher Ultraschallgeräte zeichnet automatisch alle wichtigen Prozessparameter auf die integrierte SD-Karte auf. Die automatische Datenaufzeichnung des Beschallungsprozesses bildet die Grundlage für die Prozessstandardisierung und Reproduzierbarkeit / Wiederholbarkeit, welche für Good Manufacturing Practices (GMP) erforderlich sind.

Ultraschall-Rektoren für die Fermentation

Hielscher bietet Ultraschallsonotroden in verschiedenen Größen, Längen und Geometrien an, die sowohl für die Batch- als auch für kontinuierliche Durchflussbehandlungen eingesetzt werden können. Ultraschallreaktoren, auch bekannt als Sono-Bioreaktoren, sind für jedes Volumen verfügbar. Hielscher Ultraschallreaktoren für die Bioprozesstechnik sind in jeder Größe erhältlich - für kleine Laborproben bis hin zur Pilotgröße und vollkommerziellen Produktion.
Es ist bekannt, dass die Position der Ultraschallsonotrode im Reaktionsgefäß die Kavitationsausstrahlung und Mikroströmung im Medium beeinflusst. Sonotrode und Ultraschallreaktor sollten entsprechend dem Verarbeitungsvolumen der Zellbrühe gewählt werden. Während die Beschallung sowohl im Batch- als auch im kontinuierlichen Betrieb durchgeführt werden kann, wird für hohe Produktionsvolumen die Verwendung einer Anlage mit kontinuierlichem Durchfluss empfohlen. Beim Durchlauf durch eine Ultraschall-Durchflusszelle wird das gesamte Zellmedium exakt der gleichen Beschallung ausgesetzt, wodurch die effektivste Behandlung gewährleistet ist. Die breite Palette an Ultraschallsonotroden und Durchflussreaktoren von Hielscher Ultrasonics ermöglicht es, die ideale Ultraschall-Bioprozessanlage zu konfigurieren.

Hielscher Ultrasonics – Von Labor und Pilotanlage bis zur Produktion

Hielscher Ultrasonics deckt das gesamte Spektrum an Ultraschallgeräten ab und bietet kompakte handgehaltene Ultraschall-Homogenisierer für die Probenvorbereitung bis hin zu Tisch- und Pilotsystemen sowie leistungsstarken industriellen Ultraschallgeräten, welche problemlos LKW-Ladungen pro Stunde verarbeiten. Aufgrund der vielseitigen und flexiblen Installations- und Montagemöglichkeiten lassen sich Hielscher Ultraschallgeräte leicht in alle Arten von Batch-Reaktoren, Fed-Batches oder kontinuierliche Durchflussanlagen integrieren.
Diverses Zubehör sowie kundenspezifisch angefertigte Teile ermöglichen die ideale Anpassung Ihres Ultraschallaufbaus an Ihre Produktionsanlage und Prozessanforderungen.
Hielscher Ultraschallprozessoren sind für den 24/7-Betrieb unter Volllast und für den Schwerlastbetrieb unter anspruchsvollen Bedingungen gebaut. Sie sind zuverlässig und erfordern nur einen geringen Wartungsaufwand.
In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme: