Biosynthetische Herstellung humaner Milch-Oligosaccharide

Die Biosynthese humaner Milch-Oligosaccharide (HMOs) durch Fermentation oder enzymatische Reaktionen ist ein komplexer, aufwendiger und oft wenig ergiebiger Prozess. Die Ultraschallbehandlung erhöht den Stofftransport zwischen Substrat und Zellfabriken und stimuliert das Zellwachstum und den Stoffwechsel. Dadurch intensiviert die Beschallung die Fermentation und biochemische Prozesse und ermöglicht eine schnellere und effizientere Herstellung von HMOs.

Humane Milch-Oligosaccharide

Humane Milch-Oligosaccharide (HMOs), auch als humane Milchglykane bezeichnet, sind Zuckermoleküle, die zur Gruppe der Oligosaccharide gehören. Bekannte Beispiele für HMOs sind 2’-Fucosyllactose (2′-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), 3’-Galactosyllactose (3′-GL) und Difucosyllactose (DFL).
Während menschliche Muttermilch mehr als 150 verschiedene HMO-Strukturen enthält, werden derzeit nur 2′-Fucosyllactose (2′-FL) und Lacto-N-neotetraose (LNnT) kommerziell hergestellt und als Nährstoffzusätze in Säuglingsnahrung verwendet.
Humane Milch-Oligosaccharide (HMOs) sind für ihre Bedeutung in der Säuglingsernährung bekannt. Humane Milch-Oligosaccharide sind eine einzigartige Art von Nährstoffen, die im Darm des Säuglings als Präbiotika, antiadhäsive antimikrobielle Substanzen und Immunmodulatoren wirken und wesentlich zur Gehirnentwicklung beitragen. HMOs kommen ausschließlich in menschlicher Muttermilch vor; die Milch anderer Säugetiere (z. B. Kühe, Ziegen, Schafe, Kamele usw.) enthält diese speziellen Formen von Oligosacchariden nicht.
Humane Milch-Oligosaccharide sind der dritthäufigste Feststoffbestandteil der Muttermilch und können in Wasser gelöst, emulgiert oder suspendiert vorliegen. Lactose und Fettsäuren sind die häufigsten Feststoffe in menschlicher Muttermilch. HMOs liegen in einer Konzentration von 0,35–0,88 Unzen (9,9–24,9 g)/ L vor. Es sind etwa 200 strukturell unterschiedliche humane Milch-Oligosaccharide bekannt. Das bei 80% aller Frauen vorherrschende Oligosaccharid ist 2′-Fucosyllactose, das in menschlicher Muttermilch in einer Konzentration von etwa 2,5 g/ L vorkommt.
Da HMOs nicht verdaut werden, liefern sie keinen kalorischen Beitrag zur Ernährung. Als unverdauliche Kohlenhydrate wirken sie als Präbiotika und werden selektiv von erwünschten Mikroorganismen der Darmflora, insbesondere Bifidobakterien, fermentiert.

Biosynthese humaner Milch-Oligosaccharide

Zellfabriken und enzymatische beziehungsweise chemoenzymatische Systeme sind aktuelle Technologien zur Synthese von HMOs. Für die HMO-Herstellung im industriellen Maßstab sind die Fermentation mit mikrobiellen Zellfabriken, die biochemische Synthese und verschiedene enzymatische Reaktionen geeignete Wege der biologischen HMO-Produktion. Aus wirtschaftlichen Gründen ist die Biosynthese mithilfe mikrobieller Zellfabriken derzeit das einzige Verfahren, das bei der industriellen Herstellung von HMOs eingesetzt wird.

Fermentation von HMOs mithilfe mikrobieller Zellfabriken

E. coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis sind häufig eingesetzte Zellfabriken für die Bioproduktion von biologischen Molekülen wie HMOs. Die Fermentation ist ein biochemischer Prozess, bei dem Mikroorganismen ein Substrat in die gewünschten biologischen Moleküle umwandeln. Mikrobielle Zellfabriken nutzen einfache Zucker als Substrat, das sie in HMOs umwandeln. Da einfache Zucker (z. B. Lactose) reichlich verfügbare, kostengünstige Substrate sind, bleibt der Biosyntheseprozess kosteneffizient.
Die Wachstums- und Biokonversionsrate werden hauptsächlich durch den Stofftransport von Nährstoffen (Substrat) zu den Mikroorganismen beeinflusst. Die Stofftransportrate ist ein wesentlicher Faktor für die Produktsynthese während der Fermentation. Die Ultraschallbehandlung ist dafür bekannt, den Stofftransport zu fördern.
Während der Fermentation müssen die Bedingungen im Bioreaktor kontinuierlich überwacht und geregelt werden, damit die Zellen möglichst schnell wachsen und anschließend die gewünschten Biomoleküle produzieren können (z. B. Oligosaccharide wie HMOs; Insulin; rekombinante Proteine). Theoretisch beginnt die Produktbildung, sobald die Zellkultur zu wachsen beginnt. Besonders bei genetisch veränderten Zellen, etwa gentechnisch modifizierten Mikroorganismen, wird sie jedoch üblicherweise erst später durch Zugabe einer chemischen Substanz zum Substrat ausgelöst, die die Expression des gewünschten Biomoleküls hochreguliert. Ultraschallbioreaktoren (Sono-Bioreaktoren) lassen sich präzise steuern und ermöglichen die gezielte Stimulation von Mikroorganismen. Dies führt zu einer beschleunigten Biosynthese und höheren Ausbeuten.
Ultraschalllyse und -extraktion: Die Fermentation komplexer HMOs kann durch niedrige Fermentationstiter und intrazellulär verbleibende Produkte begrenzt sein. Ultraschalllyse und -extraktion werden eingesetzt, um intrazelluläres Material vor der Reinigung und den nachgelagerten Verarbeitungsschritten freizusetzen.

Ultraschallgestützte Fermentation

Die Wachstumsrate von Mikroorganismen wie Escherichia coli, gentechnisch modifizierten E. coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis lässt sich durch eine Erhöhung der Stofftransportrate und der Zellwandpermeabilität mittels kontrollierter niederfrequenter Ultraschallbehandlung steigern. Als schonendes, nichtthermisches Verarbeitungsverfahren bringt die Ultraschallbehandlung rein mechanische Kräfte in die Fermentationsbrühe ein.
Akustische Kavitation: Das Wirkprinzip der Beschallung beruht auf akustischer Kavitation. Die Sonotrode koppelt niederfrequente Ultraschallwellen in das Medium ein. Die Ultraschallwellen breiten sich durch die Flüssigkeit aus und erzeugen abwechselnde Hochdruckphasen (Kompression) und Niederdruckphasen (Expansion). Durch das abwechselnde Komprimieren und Dehnen der Flüssigkeit entstehen winzige Vakuumblasen. Diese kleinen Vakuumblasen wachsen über mehrere Zyklen, bis sie eine Größe erreichen, bei der sie keine weitere Energie aufnehmen können. An diesem Punkt maximaler Ausdehnung implodiert die Vakuumblase heftig und erzeugt lokal extreme Bedingungen, die als Kavitationsphänomen bekannt sind. Im „Hotspot“ der Kavitation lassen sich hohe Druck- und Temperaturunterschiede sowie starke Scherkräfte mit Flüssigkeitsstrahlen von bis zu 280m/sec beobachten. Diese Kavitationseffekte bewirken einen intensiven Stofftransport und Sonoporation (die Perforation von Zellwänden und Zellmembranen). Die Nährstoffe des Substrats werden zu den lebenden, intakten Zellen und in sie hinein transportiert, sodass die Zellfabriken optimal versorgt werden und sowohl das Wachstum als auch die Umwandlungsraten steigen. Ultraschallbioreaktoren sind eine einfache und zugleich äußerst wirksame Möglichkeit, Biomasse in einem Eintopf-Biosyntheseprozess zu verarbeiten.
Eine präzise kontrollierte, schonende Beschallung ist dafür bekannt, Fermentationsprozesse zu intensivieren.
Die Beschallung verbessert „die Produktivität vieler Bioprozesse mit lebenden Zellen durch eine verbesserte Substrataufnahme, eine gesteigerte Produktion oder ein verstärktes Wachstum infolge einer erhöhten Zellporosität sowie eine potenziell verstärkte Freisetzung von Zellbestandteilen.“ (Naveena et al. 2015)
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Naveena et al. (2015) stellten fest, dass die Ultraschallintensivierung bei der biotechnologischen Verarbeitung mehrere Vorteile bietet, darunter niedrige Betriebskosten im Vergleich zu anderen Verfahren zur Prozessverbesserung, eine einfache Bedienung und einen geringen Leistungsbedarf.

Hochleistungs-Ultraschallreaktoren für die Fermentation

An Fermentationsprozessen sind lebende Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen beteiligt, die als Zellfabriken dienen. Während die Beschallung eingesetzt wird, um den Stofftransport zu fördern und die Wachstums- und Umwandlungsrate der Mikroorganismen zu erhöhen, ist eine präzise Steuerung der Ultraschallintensität entscheidend, um eine Zerstörung der Zellfabriken zu vermeiden.
Hielscher Ultrasonics ist auf die Entwicklung, Herstellung und den Vertrieb von Hochleistungs-Ultraschallgeräten spezialisiert, die sich präzise steuern und überwachen lassen, um hervorragende Fermentationsausbeuten zu gewährleisten.

Die Prozesskontrolle ist nicht nur für hohe Ausbeuten und hervorragende Qualität unerlässlich, sondern ermöglicht auch die Wiederholung und Reproduktion von Ergebnissen. Insbesondere bei der Stimulation von Zellfabriken ist die zellspezifische Anpassung der Beschallungsparameter entscheidend, um hohe Ausbeuten zu erzielen und einen Zellabbau zu verhindern. Deshalb sind alle digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher mit intelligenter Software ausgestattet, mit der Sie die Beschallungsparameter einstellen, überwachen und anpassen können. Ultraschallprozessparameter wie Amplitude, Temperatur, Druck, Beschallungsdauer, Tastverhältnisse und Energieeintrag sind entscheidend für die Förderung der HMO-Produktion durch Fermentation.
Die intelligente Software der Ultraschallgeräte von Hielscher zeichnet alle wichtigen Prozessparameter automatisch auf der integrierten SD-Karte auf. Die automatische Datenaufzeichnung des Beschallungsprozesses bildet die Grundlage für die Prozessstandardisierung und die Reproduzierbarkeit beziehungsweise Wiederholbarkeit, die für die Gute Herstellungspraxis (GMP) erforderlich sind.

Ultraschallreaktoren für die Fermentation

Hielscher bietet Sonotroden in verschiedenen Größen, Längen und Geometrien an, die sowohl für Chargenbehandlungen als auch für kontinuierliche Durchflussbehandlungen eingesetzt werden können. Ultraschallreaktoren, auch als Sono-Bioreaktoren bezeichnet, sind für jedes Volumen erhältlich und decken die ultraschallgestützte biotechnologische Verarbeitung von kleinen Laborproben über den Pilotmaßstab bis zur kommerziellen Produktion im vollen Maßstab ab.
Es ist bekannt, dass die Position der Sonotrode im Reaktionsgefäß die Verteilung der Kavitation und der Mikroströmungen im Medium beeinflusst. Sonotrode und Ultraschallreaktor sollten entsprechend dem zu verarbeitenden Volumen der Zellbrühe gewählt werden. Obwohl die Beschallung sowohl im Chargenbetrieb als auch kontinuierlich erfolgen kann, empfiehlt sich bei großen Produktionsvolumina der Einsatz einer kontinuierlichen Durchflussanlage. Beim Durchströmen einer Ultraschalldurchflusszelle wird das gesamte Zellmedium exakt derselben Beschallung ausgesetzt, was eine möglichst wirksame Behandlung gewährleistet. Das breite Angebot an Sonotroden und Durchflussreaktoren von Hielscher Ultrasonics ermöglicht es, die ideale Anlage für die ultraschallgestützte biotechnologische Verarbeitung zusammenzustellen.

Hielscher Ultrasonics – Vom Labor über den Pilotmaßstab bis zur Produktion

Hielscher Ultrasonics deckt das gesamte Spektrum der Ultraschalltechnik ab: von kompakten, handgeführten Ultraschallhomogenisatoren für die Probenvorbereitung über Tischgeräte und Pilotanlagen bis hin zu leistungsstarken industriellen Ultraschallanlagen, die problemlos ganze Lkw-Ladungen pro Stunde verarbeiten. Dank vielseitiger und flexibler Installations- und Montagemöglichkeiten lassen sich Ultraschallgeräte von Hielscher problemlos in verschiedenste Chargenreaktoren, Fed-Batch-Systeme oder kontinuierliche Durchflussanlagen integrieren.
Vielfältiges Zubehör sowie kundenspezifische Bauteile ermöglichen eine optimale Anpassung Ihrer Ultraschallanlage an Ihre Prozessanforderungen.
Die Ultraschallprozessoren von Hielscher sind für den 24/7-Betrieb unter Volllast und für starke Beanspruchung unter anspruchsvollen Bedingungen ausgelegt. Sie sind zuverlässig und wartungsarm.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte: