Hielscher Ultraschalltechnik

Biosynthetische Herstellung von Humanen Milch-Oligosacchariden

Die Biosynthese von Humanmilch-Oligosacchariden (HMOs) durch Fermentation oder enzymatische Reaktionen ist ein komplexer, aufwendiger und oft wenig ergiebiger Prozess. Ultraschall erhöht den Massentransfer zwischen Substrat und Zellfabriken und stimuliert das Zellwachstum und den Stoffwechsel. Dadurch intensiviert die Beschallung Fermentation und biochemische Prozesse, was zu einer beschleunigten und effizienteren Produktion von HMOs führt.

Humanmilch-Oligosaccharide

Humanmilch-Oligosaccharide (HMOs), auch als humane Milchglykane bekannt, sind Zuckermoleküle, die zur Gruppe der Oligosaccharide gehören. Prominente Beispiele für HMOs sind 2'-Fucosyllactose (2′-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), 3'-Galactosyllactose (3′-GL), und Difucosyllactose (DFL).
Während sich die menschliche Muttermilch aus mehr als 150 verschiedenen HMO-Strukturen zusammensetzt, werden derzeit nur 2′-Fucosyllactose (2′-FL) und Lacto-N-neotetraose (LNnT) auf kommerzieller Ebene hergestellt und als Nahrungszusatzstoffe in Säuglingsanfangsnahrung verwendet.
Humanmilch-Oligosaccharide (HMOs) sind für ihre Bedeutung in der Säuglingsernährung bekannt. Humanmilch-Oligosaccharide sind eine einzigartige Art von Nährstoffen, die im Darm des Säuglings als Präbiotika, antiadhäsive antimikrobielle Mittel und Immunmodulatoren wirken und wesentlich zur Entwicklung des Gehirns beitragen. HMOs kommen ausschließlich in menschlicher Muttermilch vor; andere Säugetiermilchen (z.B. Kuh-, Ziegen-, Schaf-, Kamelmilch usw.) weisen diese spezifische Form von Oligosacchariden nicht auf.
Humanmilch-Oligosaccharide sind die dritthäufigste feste Komponente in der menschlichen Milch, die entweder in gelöster oder emulgierter oder suspendierter Form in Wasser vorliegen kann. Laktose und Fettsäuren sind die am häufigsten vorkommenden Feststoffe in der menschlichen Milch. HMOs sind in einer Konzentration von 0,35-0,88 Unzen (9,9-24,9 g)/L vorhanden. Es sind etwa 200 strukturell unterschiedliche Oligosaccharide aus menschlicher Milch bekannt. Das dominierende Oligosaccharid bei 80% aller Frauen beträgt 2′-Fucosyllactose, die in der menschlichen Muttermilch in einer Konzentration von ca. 2,5 g/ L vorhanden ist.
Da HMOs nicht verdaut werden, tragen sie nicht kalorisch zur Ernährung bei. Da sie unverdauliche Kohlenhydrate sind, wirken sie als Präbiotika und werden von der erwünschten Darmmikroflora, insbesondere Bifidobakterien, selektiv fermentiert.

Gesundheitliche Vorteile von Humanmilch-Oligosacchariden (HMOs)

  • die Entwicklung von Kleinkindern fördern
  • sind wichtig für die Gehirnentwicklung
  • hat entzündungshemmende und
  • antiadhäsive Wirkungen im Gastrointestinaltrakt
  • unterstützt das Immunsystem bei Erwachsenen
Ultraschall und der Einsatz von Ultraschall-Bioreaktoren (Sono-Bioreaktoren) sind hochwirksam, um den Stoffaustausch zwischen Substrat und lebenden Zellen, die als Zellfabriken verwendet werden, zu fördern

Der Ultraschallprozessor UIP2000hdT erhöht den Massentransfer und aktiviert Zellfabriken für höhere Ausbeuten biosynthetisierter biologischer Moleküle wie HMOs

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Biosynthese von Humanmilch-Oligosacchariden

Zellfabriken und enzymatische / chemo-enzymatische Systeme sind aktuelle Technologien, die für die Synthese von HMOs verwendet werden. Für die HMO-Produktion im industriellen Maßstab sind die Fermentation von mikrobiellen Zellfabriken, die biochemische Synthese und verschiedene enzymatische Reaktionen machbare Wege der HMO-Bioproduktion. Aus wirtschaftlichen Gründen ist die Biosynthese über mikrobielle Zellfabriken derzeit die einzige Technik, die auf industrieller Produktionsebene von HMOs eingesetzt wird.

Fermentation von HMOs mit Hilfe von mikrobiellen Zellfabriken

E.coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis sind häufig verwendete Zellfabriken, die für die Bioproduktion von biologischen Molekülen wie HMOs verwendet werden. Fermentation ist ein biochemischer Prozess, bei dem Mikroorganismen verwendet werden, um ein Substrat in zielgerichtete biologische Moleküle umzuwandeln. Mikrobielle Zellfabriken verwenden einfache Zucker als Substrat, die sie in HMOs umwandeln. Da einfache Zucker (z.B. Laktose) ein reichlich vorhandenes, billiges Substrat sind, bleibt der Biosyntheseprozess kosteneffizient.
Wachstum und Biokonversionsrate werden hauptsächlich durch den Massentransfer von Nährstoffen (Substrat) zu den Mikroorganismen beeinflusst. Die Stofftransferrate ist ein Hauptfaktor, der die Produktsynthese während der Fermentation beeinflusst. Es ist bekannt, dass Ultraschall den Massentransfer fördert.
WÃ?hrend der Fermentation mÃ?ssen die Bedingungen im Bioreaktor stÃ?ndig Ã?berwacht und reguliert werden, damit die Zellen so schnell wie möglich wachsen können, um dann die gewünschten BiomolekÃ?le (z.B. Oligosaccharide wie HMOs; Insulin; rekombinante Proteine) zu produzieren. Theoretisch beginnt die Produktbildung, sobald die Zellkultur zu wachsen beginnt. Vor allem bei gentechnisch veränderten Zellen wie z.B. technisierten Mikroorganismen wird sie jedoch in der Regel später durch Zugabe einer chemischen Substanz zum Substrat induziert, die die Expression des Ziel-Biomoleküls hochreguliert. Ultraschall-Bioreaktoren (Sono-Bioreaktor) lassen sich präzise steuern und ermöglichen die spezifische Stimulation von Mikroben. Dies führt zu einer beschleunigten Biosynthese und höheren Ausbeuten.
Ultraschall-Lyse und -Extraktion: Die Fermentation von komplexen HMOs könnte durch niedrige Fermentationstiter und intrazellulär verbleibende Produkte eingeschränkt sein. Die Ultraschall-Lyse und -Extraktion wird verwendet, um intrazelluläres Material vor der Reinigung und nachgeschalteten Prozessen freizusetzen.

Ultraschall-geförderte Fermentation

Die Wachstumsrate von Mikroben wie Escherichia coli, technisches E.coli, Saccharomyces cerevisiae und Lactococcus lactis kann durch die Erhöhung der Stofftransferrate und der Zellwandpermeabilität durch Anwendung von kontrolliertem Niederfrequenz-Ultraschall beschleunigt werden. Als milde, nicht-thermische Verarbeitungstechnik bringt Ultraschall rein mechanische Kräfte in die Fermentationsbrühe ein.
Akustische Kavitation: Das Funktionsprinzip der Beschallung basiert auf der akustischen Kavitation. Die Ultraschallsonde (Sonotrode) koppelt niederfrequente Ultraschall d-Wellen in das Medium ein. Die Ultraschallwellen durchlaufen die Flüssigkeit und erzeugen abwechselnd Hochdruck- (Kompression) und Niederdruckzyklen (Verdünnung). Indem die Flüssigkeit in abwechselnden Zyklen komprimiert und gedehnt wird, entstehen winzige Vakuumblasen. Diese kleinen Vakuumblasen wachsen über mehrere Zyklen, bis sie eine Größe erreichen, bei der sie keine weitere Energie mehr aufnehmen können. An diesem Punkt des maximalen Wachstums implodiert die Vakuumblase heftig und erzeugt lokal extreme Bedingungen, die als Phänomen der Kavitation bekannt sind. Im kavitativen "Hot-Spot" können hohe Druck- und Temperaturunterschiede und intensive Scherkräfte mit Flüssigkeitsstrahlen von bis zu 280 m/sec beobachtet werden. Durch diese Kavitationseffekte wird ein gründlicher Massentransfer und Sonoporation (die Perforation von Zellwänden und Zellmembranen) erreicht. Die Nährstoffe des Substrates werden zu und in die lebenden ganzen Zellen geschwemmt, so dass die Zellfabriken optimal ernährt werden und das Wachstum sowie die Umwandlungsraten beschleunigt werden. Ultraschall-Bioreaktoren sind eine einfache, aber hochwirksame Strategie zur Verarbeitung von Biomasse in einem Eintopf-Biosyntheseprozess.
Eine genau kontrollierte, milde Beschallung intensiviert bekanntlich Gärungsprozesse.
Die Beschallung verbessert "die Produktivität vieler Bioprozesse, an denen lebende Zellen beteiligt sind, durch die Verbesserung der Substrataufnahme, die Steigerung der Produktion oder des Wachstums durch Erhöhung der Zellporosität und die potenziell verbesserte Freisetzung von Zellbestandteilen". (Naveena et al. 2015)
Lesen Sie mehr über ultraschallunterstützte Fermentation!
Vorteile der ultraschallintensivierten Fermentation

  • erhöhter Ertrag
  • Beschleunigte Fermentation
  • Zellspezifische Stimulation
  • Verbesserte Substrataufnahme
  • Erhöhte Zellporosität
  • einfach zu bedienen
  • sicher
  • Einfache Nachrüstung
  • lineares Scale-up
  • Batch- oder InIine-Verarbeitung
  • schneller ROI

Naveena et al. (2015) fanden heraus, dass die Ultraschall-Intensivierung bei der Bioverarbeitung mehrere Vorteile bietet, darunter niedrige Betriebskosten im Vergleich zu anderen verbessernden Behandlungsoptionen, einfache Bedienung und bescheidene Leistungsanforderungen.

Gerührter Ultraschalltank (Sono-Bioreaktor) für Batch-Verarbeitung

Mischtank mit 8kW-Ultraschallgeräten und Rührwerk

Hochleistungs-Ultraschall-Fermentationsreaktoren

An Gärungsprozessen sind lebende Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefe beteiligt, die als Zellfabriken fungieren. Während die Beschallung angewendet wird, um den Massentransfer zu fördern und die Wachstums- und Umwandlungsrate der Mikroorganismen zu erhöhen, ist es entscheidend, die Ultraschallintensität genau zu kontrollieren, um die Zerstörung der Zellfabriken zu vermeiden.
Hielscher Ultrasonics ist spezialisiert auf die Entwicklung, Herstellung und den Vertrieb von Hochleistungs-Ultraschallgeräten, die präzise gesteuert und überwacht werden können, um überlegene Fermentationserträge zu gewährleisten.
Präzise Kontrolle über die Ultraschall-Prozessparameter von Hielscher Ultrasonics' intelligente SoftwareDie Prozesskontrolle ist nicht nur für hohe Erträge und überlegene Qualität unerlässlich, sondern ermöglicht auch die Wiederholung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Insbesondere bei der Stimulation von Zellfabriken ist die zellspezifische Anpassung der Beschallungsparameter essentiell, um hohe Ausbeuten zu erzielen und Zellabbau zu verhindern. Deshalb sind alle digitalen Modelle der Hielscher-Ultraschallgeräte mit einer intelligenten Software ausgestattet, die es erlaubt, die Beschallungsparameter einzustellen, zu überwachen und zu überarbeiten. Ultraschall-Prozessparameter wie Amplitude, Temperatur, Druck, Beschallungsdauer, Arbeitszyklen und Energieeintrag sind unerlässlich, um die HMO-Produktion durch Fermentation zu fördern.
Die intelligente Software der Hielscher-Ultraschallgeräte zeichnet automatisch alle wichtigen Prozessparameter auf die integrierte SD-Karte auf. Die automatische Datenaufzeichnung des Beschallungsprozesses bildet die Grundlage für die Prozessstandardisierung und Reproduzierbarkeit / Wiederholbarkeit, die für die Good Manufacturing Practices (GMP) erforderlich sind.

Hielscher Ultraschall Cascatrode Cascatrode

CascatrodeTM in einem Ultraschall-Durchflusszellenreaktor

Ultraschall-Rektoren für Fermentation

Hielscher Ultraschall Cascatrode CascatrodeHielscher bietet Ultraschallsonden in verschiedenen Größen, Längen und Geometrien an, die sowohl für Batch- als auch für kontinuierliche Durchflussbehandlungen eingesetzt werden können. Ultraschallreaktoren, auch bekannt als Sono-Bioreaktoren, sind für jedes Volumen verfügbar, das die Ultraschall-Bioprozesstechnik von kleinen Laborproben bis hin zur Pilot- und vollkommerziellen Produktionsebene abdeckt.
Es ist bekannt, dass die Lage der Ultraschallsonotrode im Reaktionsgefäß die Verteilung von Kavitation und Mikroströmung im Medium beeinflusst. Sonotrode und Ultraschallreaktor sollten entsprechend dem Verarbeitungsvolumen der Zellbrühe gewählt werden. Während die Beschallung sowohl im Batch- als auch im kontinuierlichen Betrieb durchgeführt werden kann, wird für hohe Produktionsvolumen die Verwendung einer Anlage mit kontinuierlichem Durchfluss empfohlen. Beim Durchlauf durch eine Ultraschall-Durchflusszelle wird das gesamte Zellmedium genau der gleichen Beschallung ausgesetzt, wodurch die effektivste Behandlung gewährleistet ist. Die breite Palette an Ultraschallsonden und Durchflusszellenreaktoren von Hielscher Ultrasonics ermöglicht es, die ideale Ultraschall-Bioprozessanlage zusammenzustellen.

Hielscher Ultrasonics – Vom Labor über das Pilotprojekt zur Produktion

Hielscher Ultrasonics deckt das gesamte Spektrum an Ultraschallgeräten ab und bietet kompakte handgehaltene Ultraschall-Homogenisierer für die Probenvorbereitung bis hin zu Tisch- und Pilotsystemen sowie leistungsstarke industrielle Ultraschallgeräte, die problemlos LKW-Ladungen pro Stunde verarbeiten. Aufgrund der vielseitigen und flexiblen Installations- und Montagemöglichkeiten lassen sich Hielscher Ultraschallgeräte leicht in alle Arten von Batch-Reaktoren, Fed-Batches oder kontinuierliche Durchflussanlagen integrieren.
Diverses Zubehör sowie kundenspezifische Teile ermöglichen die ideale Anpassung Ihres Ultraschallaufbaus an Ihre Prozessanforderungen.
Hielscher-Ultraschallprozessoren sind für den 24/7-Betrieb unter Volllast und für den Schwerlastbetrieb unter anspruchsvollen Bedingungen gebaut. Sie sind zuverlässig und erfordern nur einen geringen Wartungsaufwand.
In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme:

Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 bis 20l 0,2 bis 4l/min UIP2000hdT
10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000hdT
n.a. 10 bis 100l/min UIP16000
n.a. größere Cluster aus UIP16000

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Hielscher Ultrasonics stellt leistungsstarke Ultraschall-Homogenisatoren für die Dispersion, Emulgierung und Zellenextraktion her.

Leistungsstarke Ultraschall-Homogenisatoren von Labor bis Pilot- und industrielle Maßstab.

Literatur / Literaturhinweise



Wissenswertes

Biosynthese mit Hilfe von Zellfabriken

Eine mikrobielle Zellfabrik ist eine Methode des Bioengineering, bei der mikrobielle Zellen als Produktionsanlage eingesetzt werden. Durch gentechnische Veränderung von Mikroben wird die DNA von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilzen, Säugetierzellen oder Algen verändert, wodurch Mikroben zu Zellfabriken werden. Zellfabriken dienen dazu, Substrate in wertvolle biologische Moleküle umzuwandeln, die z.B. in der Lebensmittel-, Pharma-, Chemie- und Kraftstoffproduktion eingesetzt werden. Verschiedene Strategien der zellfabrikbasierten Biosynthese zielen auf die Produktion nativer Metaboliten, die Expression heterologer Biosynthesewege oder die Proteinexpression ab.
Zellfabriken können entweder zur Synthese nativer Metaboliten, zur Expression heterologer Biosynthesewege oder zur Expression von Proteinen verwendet werden.

Biosynthese von nativen Metaboliten

Einheimische Metaboliten werden als biologische Moleküle definiert, die die als Zellfabrik verwendeten Zellen auf natürliche Weise produzieren. Zellfabriken produzieren diese biologischen Moleküle entweder intrazellulär oder als sezernierte Substanz. Letzteres wird bevorzugt, da es die Trennung und Reinigung der Zielverbindungen erleichtert. Beispiele für native Metaboliten sind Amino- und Nukleinsäuren, Antibiotika, Vitamine, Enzyme, bioaktive Verbindungen und Proteine, die auf anabolen Wegen der Zelle hergestellt werden.

Heterologe Biosynthesewege

Wenn man versucht, eine interessante Verbindung zu produzieren, ist eine der wichtigsten Entscheidungen die Wahl der Produktion im nativen Wirt und die Optimierung dieses Wirts oder die Übertragung des Pfades auf einen anderen bekannten Wirt. Wenn der ursprüngliche Wirt an einen industriellen Fermentationsprozess angepasst werden kann und dabei keine gesundheitlichen Risiken bestehen (z.B. Produktion von toxischen Nebenprodukten), kann dies eine bevorzugte Strategie sein (wie dies z.B. bei Penicillin der Fall war). In vielen modernen Fällen überwiegt jedoch das Potenzial der Verwendung einer industriell bevorzugten Zellfabrik und verwandter Plattformprozesse die Schwierigkeit der Übertragung des Pfades.

Protein-Expression

Die Expression von Proteinen kann über homologe und heterologe Wege erreicht werden. Bei der homologen Expression wird ein Gen, das natürlicherweise in einem Organismus vorhanden ist, überexprimiert. Durch diese Überexpression kann eine höhere Ausbeute eines bestimmten biologischen Moleküls erzielt werden. Bei der heterologen Expression wird ein bestimmtes Gen in eine Wirtszelle transferiert, da das Gen in der Natur nicht vorhanden ist. Mit Hilfe der Zelltechnik und der rekombinanten DNA-Technologie wird das Gen in die DNA des Wirtes eingefügt, so dass die Wirtszelle (große) Mengen eines Proteins produziert, das sie auf natürliche Weise nicht herstellen würde. Die Proteinexpression erfolgt in einer Vielzahl von Wirten aus Bakterien, z.B. E. coli und Bacillis subtilis, Hefen, z.B. Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamentösen Pilzen, z.B. als A. niger, und Zellen, die von multizellulären Organismen wie Säugetieren und Insekten stammen. Unzählige Proteine sind von großem kommerziellen Interesse, u.a. aus Massenenzymen, komplexen Biopharmazeutika, Diagnostika und Forschungsreagenzien. (vgl. A.M. Davy et al. 2017)