Festphasen-Peptidsynthese – effizienter durch Beschallung
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ist die gängige Methode zur Peptidsynthese. Die Ultraschallbehandlung ist ein zuverlässiges Verfahren zur Intensivierung der Festphasen-Peptidsynthese: Sie erhöht die Ausbeuten, verbessert die Reinheit und steigert die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich, ohne eine Racemisierung zu verursachen. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die Synthese, Abspaltung und das Auflösen von Peptiden.
Ultraschallgestützte Festphasen-Peptidsynthese
Die Ultraschallbehandlung wird bereits häufig zur Intensivierung der organischen Synthese eingesetzt und ist für ihre Vorteile bekannt: drastisch verkürzte Reaktionszeiten, höhere Ausbeuten, weniger Nebenprodukte, die Einleitung von Reaktionswegen, die auf andere Weise nicht zugänglich wären, und/oder eine bessere Selektivität. Auch die Einkopplung von Ultraschall in Peptidsynthesereaktionen bietet erhebliche Vorteile. Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass die ultraschallgestützte Peptidsynthese innerhalb kurzer Reaktionszeiten eine optimierte Ausbeute an Peptiden mit hoher Reinheit ohne Racemisierung erzielt.
- Hohe Peptidausbeuten
- Deutlich schnellere Synthese
- Höhere Peptidreinheit
- Keine Racemisierung
- Parallele Synthese verschiedener Peptide
- Auf jedes Volumen skalierbar
Ultraschall-CupHorn zur gleichmäßigen Beschallung mehrerer Reaktionsgefäße für eine verbesserte Peptidsynthese.
Grafische Darstellung der Merrifield-Festphasen-Peptidsynthese. Die Ultraschallbehandlung wird zur Förderung und Intensivierung der Synthesereaktion sowie zur Abspaltung der synthetisierten Peptide vom Harz eingesetzt.
Grafik: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studie | Untersuchte Peptide | Reaktionszeit (klassische SPPS gegenüber US-SPPS) | Reinheit des Rohprodukts (klassische SPPS gegenüber US-SPPS) | Racemisierung und Nebenreaktionen | Wesentliche Erkenntnisse |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-Enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-Endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Bei Cys/His nicht beobachtet, selbst bei 70°C | ~7–12-mal schnellere Synthese; deutliche Verbesserungen der Reinheit, insbesondere bei aggregationsanfälligen Sequenzen wie TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | Mehr als 3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (nur Ultraschall) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nicht untersucht; leichter Rückgang der Reinheit bei Pep2 festgestellt | Verkürzung der Synthesezeit um den Faktor 14 bei Pep1; deutlich höhere Rohausbeuten. |
| Merlino et al. (2019) | Modellpentapeptide, Peptide bis zum 44-mer, „schwierige Sequenzen“ (Aβ 1–42, ACP 65–74) | 60 min → 30 min (Modell) | 84% → 93% (Modell); deutlich höher als bei thermischer Erwärmung (~45°C) | Kein signifikanter Anstieg bei Cys/His-Enantiomeren | Hochwirksam bei schwierigen bzw. aggregationsanfälligen Sequenzen; ermöglicht einen geringeren Reagenzienüberschuss bei gleichbleibend hoher Reinheit. |
Verbesserte Festphasen-Peptidsynthese durch Ultraschall
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ist eine chemische Reaktion, die den Aufbau einer Peptidkette durch aufeinanderfolgende Reaktionen von Aminosäurederivaten auf einem unlöslichen porösen Träger ermöglicht. Die herkömmliche Festphasen-Peptidsynthese ist jedoch ein relativ ineffizienter und langsamer Prozess. Daher ist die Intensivierung der Peptidsynthese durch Ultraschall ein anerkanntes Verfahren für eine wirksamere und schnellere Synthese von Peptiden.
Silva et al. (2021) verglichen die „klassische“ Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) mit der ultraschallgestützten (US) SPPS anhand der Herstellung von drei Peptiden: dem für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 (FGFR3) spezifischen Peptid Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) und den neuartigen Peptiden Pep2 (RQMATADEA-NH2) und Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Die US-gestützte SPPS verkürzte die Zeit für den Peptidaufbau gegenüber der „klassischen“ Methode um den Faktor 14 (Pep1) bzw. 4 (Pep2). Interessanterweise lieferte die ultraschallgestützte SPPS Pep1 mit höherer Reinheit (82%) als die „klassische“ SPPS (73%). Die deutliche Zeitersparnis in Verbindung mit der erzielten hohen Reinheit der Rohpeptide veranlasste das Forschungsteam, die US-gestützte SPPS auf das große Peptid Pep3 anzuwenden, das eine hohe Anzahl hydrophober Aminosäuren und homooligomerer Sequenzen aufweist. Bemerkenswerterweise gelang die Synthese dieses 25-mer-Peptids in weniger als 6 Stunden (347 min) bei mäßiger Reinheit (ca. 49%).
Schnellere Peptidsynthese durch Festphasen-Peptidsynthese unter Einsatz ultraschallinduzierter Durchmischung.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) führten ebenfalls eine umfassende Untersuchung der Ultraschalleffekte auf die Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese durch. Die ultraschallgestützte Synthese ermöglichte die Herstellung verschiedener biologisch aktiver Peptide bis zum 44-mer bei erheblichen Einsparungen an Material und Reaktionszeit. Sie zeigten, dass die Ultraschallbehandlung die wichtigsten Nebenreaktionen nicht verstärkte und die Synthese von Peptiden mit „schwierigen Sequenzen“ verbesserte. Damit zählt die ultraschallgestützte Festphasen-Peptidsynthese (US-SPPS) zu den derzeit hocheffizienten Strategien der Peptidsynthese.
Die Verfügbarkeit leistungsstarker Systeme für die ultraschallgestützte Synthese von Peptiden ermöglicht deutlich höhere Syntheseraten und eine Steigerung der Reinheit der Rohprodukte. (Vgl. Wołczański et al., 2019)
Untersuchung der Racemisierung. Vergleich aussagekräftiger 1H-NMR-Spektren von Modellpeptiden, die manuell mit dem klassischen Verfahren bei Raumtemperatur bzw. mit der Ultraschallmethode bei erhöhter Temperatur synthetisiert wurden. Die chemischen Verschiebungen der α-Protonen von His und Cys sowie der Methylengruppe von Acm (linke Abbildungen) und der γ-Methylprotonen von Val (rechte Abbildungen) zeigen, dass die Beschallung bei 70°C keine Racemisierung verursacht.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)
Ultraschallgestützte Abspaltung von Peptiden
Nach der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) müssen die synthetisierten Peptide von den Polymerharzen abgespalten werden. Dieser Schritt wird auch als Entschützung bezeichnet. Beim Vergleich von herkömmlichem Schütteln und Ultraschallbehandlung zur Abspaltung der Peptide vom Harz benötigt die Schüttelmethode ca. 1 Stunde, während die ultraschallgestützte Abspaltung in 15 bis 20 min durchgeführt werden kann. Die ultraschallgestützte Peptidabspaltung lässt sich zur Abspaltung geschützter Aminosäuren und Peptide einsetzen, die über Benzylesterbindungen an Polystyrolharze gebunden sind.
Die ultraschallgestützte Abspaltung von Peptiden vom Polystyrolharz liefert in einem schnellen Verfahren hohe Ausbeuten an Peptiden mit hoher Reinheit ohne Racemisierung.
(Studie und Grafik: ©Anuradha und Ravindranath, 1995)
Reaktor mit ultraschallinduzierter Durchmischung für eine verbesserte und beschleunigte Peptidsynthese. Das Bild zeigt das Ultraschallgerät UP200St in einem gerührten Glasreaktor.
Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Peptidsynthese
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die direkte und indirekte Beschallung. Leistungsstarke und präzise steuerbare Ultraschallprozessoren führen dem Reaktionsgefäß genau die richtige Menge an Ultraschallenergie zu. Ob Sie Spritzen, Röhrchen, Multiwell-Platten oder Glasreaktoren als Synthesegefäß verwenden: Hielscher Ultrasonics bietet das für Ihre Peptidanwendung am besten geeignete Ultraschallgerät.
- die Synthese maßgeschneiderter Peptide
- die Peptidproduktion im Großmaßstab
- die Synthese von Peptidbibliotheken
Viele Peptidsynthesen werden in Spritzen durchgeführt (z. B. in Spritzenreaktoren mit Fritte). Das Ultraschallgerät zur Spritzenbeschallung von Hielscher beschallt die Peptidlösung, indem es die Ultraschallwellen durch die Spritzenwand in die Flüssigkeit einkoppelt. Dieses Gerät zählt zu den beliebtesten Ultraschalllösungen für die ultraschallgestützte Synthese von Peptiden.
Der Ultraschall-CupHorn eignet sich zur Beschallung von bis zu 5 Reaktionsgefäßen, während der VialTweeter bis zu zehn Reaktionsröhrchen und über Klemmzubehör zusätzlich fünf größere Gefäße aufnehmen kann.
Für andere Reaktortypen wie den Merrifield- oder Kamysz-Festphasenreaktor sowie weitere Gefäße und Reaktoren aus Polypropylen oder Borosilikatglas bietet Hielscher Ultraschallgeräte für die indirekte und direkte Beschallung mit kundenspezifischer Klemmbefestigung oder Flansch an.
Selbstverständlich lassen sich auch größere gerührte Glasreaktoren, z. B. für die Synthese in der Lösungsphase, problemlos mit Ultraschallsonden (auch bekannt als Sonotroden oder Ultraschallhörner) beliebiger Größe ausstatten.
- verschiedene Ultraschallgerätetypen
- direkte und indirekte Beschallung
- präzise Intensitätssteuerung
- präzise Temperaturregelung
- kontinuierlicher oder gepulster Ultraschall
- intelligente Funktionen, programmierbare Geräte
- für jedes Volumen verfügbar
- lineare Skalierbarkeit
Für die Festphasen-Peptidsynthese in Multiwell- bzw. Mikrotiterplatten ist der UIP400MTP das ideale Gerät. Die Ultraschallkavitation wird indirekt und gleichmäßig in die zahlreichen Probenvertiefungen eingekoppelt, um den Stofftransport und die Synthesereaktion zu verbessern. Sehen Sie im folgenden Video den Mikrotiterplatten-Ultraschallprozessor UIP400MTP im Einsatz!
Kontaktieren Sie uns! / Fragen Sie uns!
Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren für Mischanwendungen, Dispergierung, Emulgierung und Extraktion im Labor-, Pilot- und Industriemaßstab.
Wissenswertes zur ultraschallgestützten Peptidsynthese
Was sind Peptide?
Peptide sind Verbindungen, in denen mehrere Aminosäuren über Amidbindungen, sogenannte Peptidbindungen, miteinander verknüpft sind. Wenn sie zu komplexen Strukturen verbunden sind, die typischerweise aus 50 oder mehr Aminosäuren bestehen, werden diese großen Peptidstrukturen als Proteine bezeichnet. Peptide sind ein wesentlicher Baustein des Lebens und erfüllen zahlreiche Funktionen im Körper.
Wie funktioniert die Peptidsynthese?
In der organischen Chemie, Molekularbiologie und den Biowissenschaften bezeichnet die Peptidsynthese den Prozess der Herstellung von Peptiden. Peptide werden chemisch durch eine Kondensationsreaktion zwischen der Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure synthetisiert. In der Regel werden Schutzgruppenstrategien eingesetzt, um unerwünschte Nebenreaktionen mit den verschiedenen Aminosäureseitenketten zu vermeiden.
Die chemische Peptidsynthese in vitro beginnt meist mit der Kopplung der Carboxylgruppe der hinzukommenden Aminosäure (C-Terminus) an den N-Terminus der wachsenden Peptidkette. Im Gegensatz zu dieser Synthese in C-zu-N-Richtung verläuft die natürliche Proteinbiosynthese langer Peptide in lebenden Organismen in entgegengesetzter Richtung. Das bedeutet, dass bei der Biosynthese der N-Terminus der hinzukommenden Aminosäure mit dem C-Terminus der Proteinkette verknüpft wird (N-zu-C-Richtung).
Die meisten Protokolle zur Peptidsynthese in Forschung und Entwicklung basieren auf Festphasenverfahren, während Verfahren der Lösungsphasensynthese in der industriellen Peptidproduktion im Großmaßstab eingesetzt werden.
Was ist der aktuelle Stand der Technik in der Peptidsynthese?
SUS-SPPS (nachhaltige ultraschallgestützte SPPS) reduziert den Prozess nachweislich auf nur zwei Schritte pro Zyklus (kombinierte Kopplung/Blockierung freier Aminogruppen/Entschützung + einmaliges Waschen) und senkt dadurch den Lösungsmittelverbrauch und den Zeitaufwand deutlich. (Vgl. Mottola et al., 2025)
Ultraschallgestützte TAPS ist eine aufkommende Kombination mit nachgewiesenen Erfolgen bei Totalsynthesen (z. B. Lipobactin) und wird von Auftragsentwicklungs- und -herstellungsunternehmen (CDMOs) für die Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe (APIs) untersucht.
Entdecken Sie die Vorteile der ultraschallgestützten Peptidsynthese mittels TAGGING!
Die kontinuierliche Prozessführung wird als weitere Verbesserung untersucht – Plattformen für die kontinuierliche Eintopfsynthese mithilfe silylierter Tags wurden bereits beschrieben.
Das Forschungsgebiet entwickelt sich in Richtung der Prinzipien der grünen Chemie. Sowohl Ultraschall als auch TAPS tragen zu einem geringeren Lösungsmittelverbrauch, einem reduzierten Reagenzieneinsatz und einer verbesserten Nachhaltigkeit bei.
Literatur / Quellen
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren vom Labormaßstab bis zum Industriemaßstab.