Effiziente Peptidsynthese mittels Ultraschall
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS, engl. solid phase peptide synthesis; auch Merrifield Synthese genannt) ist die gängige Methode für die Peptidsynthese. Die Ultraschallbehandlung ist eine zuverlässige Methode zur Intensivierung der Festphasen-Peptidsynthese und führt zu höheren Ausbeuten, verbesserter Reinheit, keiner Racemisierung und deutlich beschleunigter Reaktionsgeschwindigkeit. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die Peptidsynthese, das Spalten sowie das Lösen von Peptiden an.
Peptidsynthese mit Ultraschall
Ultraschall wird bereits als etablierte Intensivierungsmethode in der organischen Synthese eingesetzt und ist für seine zahlreichen Vorteile bekannt, wie z.B. drastisch verkürzte Reaktionszeiten, höhere Ausbeuten, weniger unerwünschte Nebenprodukte, die Einleitung von Reaktionswegen, die auf andere Weise nicht erreicht werden können, und/oder bessere Selektivität. Große Vorteile können auch erzielt werden, wenn die Beschallung mit Peptidsynthesereaktionen gekoppelt wird. Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass die ultraschallgestützte Peptidsynthese eine optimale Ausbeute an Peptiden mit hoher Reinheit ohne Racemisierung in kurzer Reaktionszeit erzielt.
- Hohe Peptidausbeute
- Deutlich schnellere Synthese
- Höhere Peptidreinheit
- Keine Racemisierung
- Parallele Synthese von verschiedenen Peptiden
- Linear skalierbar auf jedes Volumen
Ultraschall-Cuphorn zur gleichmäßigen Beschallung mehrerer Reaktorgefäße für eine verbesserte Peptidsynthese.
Grafik zur Veranschaulichung der Merrifield-Festphasen-Peptidsynthese. Niederfrequenter Ultraschall wird zur Förderung und Verbesserung der Synthesereaktion sowie zur Abspaltung der synthetisierten Peptide von der Schutzgruppe eingesetzt.
Grafik: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
Verbesserte Festphasen-Peptidsynthese mit Ultraschall
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ist eine chemische Reaktion, die den Aufbau einer Peptidkette durch aufeinander folgende Reaktionen von Aminosäurederivaten auf einem unlöslichen porösen Träger ermöglicht. Die traditionelle Festphasen-Peptidsynthese ist jedoch ein relativ ineffizienter und langsamer Prozess. Daher ist die Intensivierung der Peptidsynthese durch Ultraschall eine etablierte Methode, um eine effizientere und schnellere Synthese von Peptiden zu erzielen.
Silva et al. (2021) verglichen die "klassische" Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) mit der ultraschall-gestützten SPPS anhand der Herstellung von drei Peptiden, nämlich dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3(FGFR3)-spezifischen Peptid Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) und den neuartigen Peptiden Pep2 (RQMATADEA-NH2) und Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Die ultraschall-gestützte SPPS führte zu einer 14-fachen (Pep1) bzw. 4-fachen Zeitersparnis (Pep2) bei der Peptidsynthese im Vergleich zur "klassischen" Methode. Interessanterweise lieferte die ultraschall-gestützte SPPS Pep1 in höherer Reinheit (82 %) als die "klassische" SPPS (73 %). Die erhebliche Zeitersparnis in Verbindung mit der hohen Reinheit des Rohpeptids veranlasste das Forscherteam, die ultraschall-gestützte SPPS auf das große Peptid Pep3 anzuwenden, welches eine hohe Anzahl hydrophober Aminosäuren und homooligo-sequenzen aufweist. Bemerkenswerterweise konnte die Synthese dieses 25-meren Peptids in weniger als 6 Stunden (347 min) mit einer Reinheit von ca. 49 % erreicht werden.
Schnellere Peptidsynthese bei der Festphasen-Peptidsynthese mittels Ultraschall.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) führten ebenfalls eine umfassende Studie über die Auswirkungen von Ultraschall auf die Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese durch. Die ultraschall-gestützte Peptidsynthese verschiedener biologisch aktiver Peptide (bis zu 44-mer) ermöglichte eine bemerkenswerte Einsparung von Material und eine deutlich verkürzte Reaktionszeit. Die Forscher konnten nachweisen, dass Ultraschall die wichtigsten Nebenreaktionen nicht verschlimmert und die Synthese von Peptiden verbessert. Sogar die Synthese „schwieriger Sequenzen“wurde mittels Ultraschall verbessert. Damit gehört die ultraschall-gestützte Festphasenpeptidsynthese (US-SPPS) zu den hocheffizientesten Peptidsynthesestrategien.
Die Verfügbarkeit von Ultrascahall-Hochleistungssystemen für die Ultraschallsynthese von Peptiden ermöglicht deutlich verbesserte Syntheseraten und eine Erhöhung der Reinheit der Endprodukte. (vgl. Wołczański et al., 2019)
Studie zur Racemisierung: Vergleich signifikanter 1H-NMR-Spektren von Modellpeptiden, die manuell mit dem klassischen Ansatz bei Raumtemperatur synthetisiert wurden, mit der Ultraschallmethode bei erhöhter Temperatur. Die chemischen Verschiebungen der α-Protonen von His und Cys und der Methylengruppe von Acm (linke Tafeln) und der ɣ-Methylprotonen von Val (rechte Tafeln) zeigen, dass die Beschallung bei 70 °C keine Racemisierung verursacht.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)
Spaltung von Peptiden mit Ultraschall
Nach der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) müssen die synthetisierten Peptide von den Polymerharzen, welche als Schutzgruppen dienen, abgespalten werden. Dieser Schritt wird auch als Entschützung bezeichnet. Vergleicht man die übliche Schüttelmethode mit der Ultraschallmethode zur Peptidabspaltung vom Harz, so benötigt die Schüttelmethode ca. 1 Stunde, während die Ultraschallabspaltung in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden kann. Die Ultraschall-Peptidspaltung kann für die Spaltung von geschützten Aminosäuren und Peptiden, die über Benzylesterbindungen an Polystyrolharze gebunden sind, eingesetzt werden.
Die ultraschall-gestützte Abspaltung von Peptiden von Polystyrolharz liefert hohe Ausbeuten an Peptiden in hoher Reinheit, ohne Racemisierung, in einem schnellen Verfahren.
(Studie und Grafik: ©Anuradha und Ravindranath, 1995)
Mit Ultraschall gerührter Reaktor für eine verbesserte und beschleunigte Peptidsynthese. Das Bild zeigt das Ultraschallgerät UP200St in einem gerührten Glasreaktor.
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschall-Lösungen für die direkte und indirekte Beschallung an. Leistungsstarke und präzise steuerbare Ultraschallprozessoren führen dem Reaktionsgefäß genau die richtige Menge an Ultraschallenergie zu. Egal ob Sie Spritzen, Röhrchen (Vial oder Tubes), Multiwell-Platten oder Glasreaktoren als Synthesegefäß verwenden, Hielscher Ultrasonics bietet den passenden Ultraschallprozessor für Ihre Peptidanwendung.
- maßgeschneiderten Peptiden
- Peptiden im großen Maßstab
- Peptidbibliotheken
Viele Peptidsynthesen werden in Spritzen durchgeführt (z. B. in Fritterspritzenreaktoren). Das Hielscher Ultraschallgerät für die Spritzenanregung beschallt die Peptidlösung, indem er die Ultraschallwellen durch die Spritzenwand in die Flüssigkeit einkoppelt. Der Ultraschallgerät für die Spritzenanregung ist eine der beliebtesten Ultraschalllösungen für die ultraschall-gestützte Synthese von Peptiden.
Das Ultraschall-Cuphorn ist ein geeignetes Gerät zur Beschallung von bis zu 5 Reaktorgefäßen, während der VialTweeter bis zu zehn Reaktionsgefäße und zusätzlich fünf größere Gefäße mittels Anpressvorrichtung aufnehmen kann.
Für andere Reaktortypen wie den Merrifield- oder Kamysz-Festphasenreaktor und andere Polypropylen- oder Borosilikat-Gefäße/Reaktoren bietet Hielscher maßgeschneiderte Clamp-On-Ultraschallsysteme zur indirekten Beschallung an.
Für die Festphasen-Peptidsynthese in Multiwell-/Mikrotiterplatten ist das UIP400MTP das ideale Gerät. Die Ultraschallkavitation wird indirekt und gleichmäßig in die zahlreichen Probenvertiefungen eingekoppelt und sorgt so für einen hervorragenden Massentransfer und eine optimale Synthesereaktion. Sehen Sie sich das Video unten an, um die UIP400MTP in Aktion!
Natürlich können größere gerührte Glasreaktoren, z.B. für Peptidkupplungen in der Lösungsphase, problemlos mit Ultraschallsonden (auch Sonotroden oder Ultraschallhörner genannt) beliebiger Größe ausgestattet werden.
- verschiedene Ultraschallmodelle
- direkte als auch indirekte Beschallung
- präzise Intensitätssteuerung
- präzise Temperaturkontrolle
- kontinuierlicher oder gepulster Ultraschall
- intelligente Funktionen, programmierbare Geräte
- Verfügbar für jedes Volumen
- lineare Skalierbarkeit
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Literatur / Literaturhinweise
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Wissenswertes
Peptide
Peptide sind Verbindungen, bei denen mehrere Aminosäuren über Amidbindungen, so genannte Peptidbindungen, verknüpft sind. Wenn sie in komplexen Strukturen gebunden sind – die in der Regel aus 50 oder mehr Aminosäuren bestehen - , werden diese großen Peptidstrukturen als Proteine bezeichnet. Peptide sind ein wesentlicher Baustein des Lebens und erfüllen zahlreiche Funktionen im Körper.
Peptid-Synthese
In der organischen Chemie, der Molekularbiologie und den Biowissenschaften bezeichnet die Peptidsynthese den Prozess der Herstellung von Peptiden. Peptide werden chemisch durch eine Kondensationsreaktion der Carboxylgruppe einer Aminosäure mit der Aminogruppe einer anderen Aminosäure synthetisiert. Um unerwünschte Nebenreaktionen mit den verschiedenen Aminosäureseitenketten zu vermeiden, werden in der Regel Schutzgruppenstrategien eingesetzt.
Die chemische (In-vitro-)Peptidsynthese beginnt meist mit der Kopplung der Carboxylgruppe der eingehenden Aminosäure (C-Terminus) an den N-Terminus der wachsenden Peptidkette. Im Gegensatz zu dieser C-zu-N-Synthese verläuft die natürliche Proteinbiosynthese von langen Peptiden in lebenden Organismen in umgekehrter Richtung. Das bedeutet, dass bei der Biosynthese der N-Terminus der eingehenden Aminosäure mit dem C-Terminus der Proteinkette verbunden wird (N-zu-C).
Die meisten Forschungs- und Entwicklungsprotokolle für die Peptidsynthese basieren auf Methoden der Festphasensynthese, während in der großindustriellen Peptidproduktion Methoden der Lösungsphasensynthese anzutreffen sind.
Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.