Peptidsynthese in fester Phase – Effizienter durch Ultraschallbehandlung

Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS, engl. solid phase peptide synthesis; auch Merrifield Synthese genannt) ist die gängige Methode für die Peptidsynthese. Die Ultraschallbehandlung ist eine zuverlässige Methode zur Intensivierung der Festphasen-Peptidsynthese und führt zu höheren Ausbeuten, verbesserter Reinheit, keiner Racemisierung und deutlich beschleunigter Reaktionsgeschwindigkeit. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschalllösungen für die Peptidsynthese, das Spalten sowie das Lösen von Peptiden an.

Ultraschallgestützte Peptidsynthese in fester Phase

Ultraschall wird bereits als etablierte Intensivierungsmethode in der organischen Synthese eingesetzt und ist für seine zahlreichen Vorteile bekannt, wie z.B. drastisch verkürzte Reaktionszeiten, höhere Ausbeuten, weniger unerwünschte Nebenprodukte, die Einleitung von Reaktionswegen, die auf andere Weise nicht erreicht werden können, und/oder bessere Selektivität. Große Vorteile können auch erzielt werden, wenn die Beschallung mit Peptidsynthesereaktionen gekoppelt wird. Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass die ultraschallgestützte Peptidsynthese eine optimale Ausbeute an Peptiden mit hoher Reinheit ohne Racemisierung in kurzer Reaktionszeit erzielt.

Verbesserte Festphasen-Peptidsynthese mit Ultraschall

Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ist eine chemische Reaktion, die den Aufbau einer Peptidkette durch aufeinander folgende Reaktionen von Aminosäurederivaten auf einem unlöslichen porösen Träger ermöglicht. Die traditionelle Festphasen-Peptidsynthese ist jedoch ein relativ ineffizienter und langsamer Prozess. Daher ist die Intensivierung der Peptidsynthese durch Ultraschall eine etablierte Methode, um eine effizientere und schnellere Synthese von Peptiden zu erzielen.
Silva et al. (2021) verglichen „klassisch“ Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) mit Ultraschall (US)-unterstützte SPPS auf der Grundlage der Herstellung von drei Peptiden, nämlich des für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 (FGFR3) spezifischen Peptids Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) sowie der neuartigen Peptide Pep2 (RQMATADEA-NH2) und Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH₂).
Die durch die USA unterstützte SPPS führte im Vergleich zur „klassisch“ Verfahren. Interessanterweise lieferte die ultraschallunterstützte SPPS Pep1 in höherer Reinheit (82 %) als die „klassisch“ SPPS (73 %). Die erhebliche Zeitersparnis in Verbindung mit der erzielten hohen Rohpeptidreinheit veranlasste das Forschungsteam, die ultraschallunterstützte SPPS auf das große Peptid Pep3 anzuwenden, das eine hohe Anzahl hydrophober Aminosäuren und Homooligosekquenzen aufweist. Bemerkenswerterweise gelang die Synthese dieses 25-mer-Peptids in weniger als 6 Stunden (347 min) bei mäßiger Reinheit (ca. 49 %).

Schnellere Peptidsynthese bei der Festphasen-Peptidsynthese mittels Ultraschall.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)

Merlino et al. (2019) führten ebenfalls eine umfassende Untersuchung der Auswirkungen von Ultraschall auf die Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese durch, die die Synthese verschiedener biologisch aktiver Peptide (bis zu 44-Mer) ermöglichte und dabei zu einer bemerkenswerten Einsparung an Material und Reaktionszeit führte. Sie zeigten, dass die Ultraschallbehandlung die wichtigsten Nebenreaktionen nicht verstärkte und die Synthese von Peptiden verbesserte, die mit „schwieriger Sequenzen“wurde mittels Ultraschall verbessert. Damit gehört die ultraschall-gestützte Festphasenpeptidsynthese (US-SPPS) zu den hocheffizientesten Peptidsynthesestrategien.

Die Verfügbarkeit von Ultrascahall-Hochleistungssystemen für die Ultraschallsynthese von Peptiden ermöglicht deutlich verbesserte Syntheseraten und eine Erhöhung der Reinheit der Endprodukte. (vgl. Wołczański et al., 2019)

Studie zur Racemisierung: Vergleich signifikanter 1H-NMR-Spektren von Modellpeptiden, die manuell mit dem klassischen Ansatz bei Raumtemperatur synthetisiert wurden, mit der Ultraschallmethode bei erhöhter Temperatur. Die chemischen Verschiebungen der α-Protonen von His und Cys und der Methylengruppe von Acm (linke Tafeln) und der ɣ-Methylprotonen von Val (rechte Tafeln) zeigen, dass die Beschallung bei 70 °C keine Racemisierung verursacht.
(Studie und Analyse: Wołczański et al., 2019)

Spaltung von Peptiden mit Ultraschall

Nach der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) müssen die synthetisierten Peptide von den Polymerharzen, welche als Schutzgruppen dienen, abgespalten werden. Dieser Schritt wird auch als Entschützung bezeichnet. Vergleicht man die übliche Schüttelmethode mit der Ultraschallmethode zur Peptidabspaltung vom Harz, so benötigt die Schüttelmethode ca. 1 Stunde, während die Ultraschallabspaltung in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden kann. Die Ultraschall-Peptidspaltung kann für die Spaltung von geschützten Aminosäuren und Peptiden, die über Benzylesterbindungen an Polystyrolharze gebunden sind, eingesetzt werden.

Die ultraschall-gestützte Abspaltung von Peptiden von Polystyrolharz liefert hohe Ausbeuten an Peptiden in hoher Reinheit, ohne Racemisierung, in einem schnellen Verfahren.
(Studie und Grafik: ©Anuradha und Ravindranath, 1995)

Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Peptidsynthese

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschall-Lösungen für die direkte und indirekte Beschallung an. Leistungsstarke und präzise steuerbare Ultraschallprozessoren führen dem Reaktionsgefäß genau die richtige Menge an Ultraschallenergie zu. Egal ob Sie Spritzen, Röhrchen (Vial oder Tubes), Multiwell-Platten oder Glasreaktoren als Synthesegefäß verwenden, Hielscher Ultrasonics bietet den passenden Ultraschallprozessor für Ihre Peptidanwendung.

Viele Peptidsynthesen werden in Spritzen durchgeführt (z. B. in Fritterspritzenreaktoren). Das Hielscher Ultraschallgerät für die Spritzenanregung beschallt die Peptidlösung, indem er die Ultraschallwellen durch die Spritzenwand in die Flüssigkeit einkoppelt. Der Ultraschallgerät für die Spritzenanregung ist eine der beliebtesten Ultraschalllösungen für die ultraschall-gestützte Synthese von Peptiden.
Das Ultraschall-Cuphorn ist ein geeignetes Gerät zur Beschallung von bis zu 5 Reaktorgefäßen, während der VialTweeter bis zu zehn Reaktionsgefäße und zusätzlich fünf größere Gefäße mittels Anpressvorrichtung aufnehmen kann.
Für andere Reaktortypen wie den Merrifield- oder Kamysz-Festphasenreaktor sowie andere Behälter und Reaktoren aus Polypropylen oder Borosilikatglas bietet Hielscher Ultraschallgeräte für die indirekte und direkte Ultraschallbehandlung mit maßgeschneiderter Klemmbefestigung oder Flansch an.

Natürlich lassen sich größere Glasreaktoren mit Rührwerk, z. B. für die Synthese in der Lösungsphase, problemlos mit Ultraschallsonden (auch bekannt als Sonotroden oder Ultraschallhörner) beliebiger Größe ausstatten.

Für die Festphasen-Peptidsynthese in Multi-Well- bzw. Mikrotiterplatten ist das UIP400MTP das ideale Gerät. Die Ultraschallkavitation wird indirekt und gleichmäßig in die zahlreichen Probenvertiefungen eingekoppelt, was zu einem hervorragenden Stoffaustausch und einer optimalen Synthesereaktion führt. Sehen Sie sich das folgende Video an, um zu erfahren, wie das Der Mikroplatten-Ultraschallator UIP400MTP im Einsatz!