Proteinextraktion aus Gewebeproben und Zellkulturen
- Die Proteinextraktion ist ein wichtiger Schritt der Probenvorbereitung in der Proteomik.
- Proteine können aus pflanzlichem und tierischen Gewebe, Hefen und Mikroorganismen extrahiert werden.
- Ultraschall ist eine zuverlässige, effiziente Methode der Proteinextraktions, mit der hohe Proteinerträge innerhalb einer kurze Extraktionszeit gewonnen werden.
Proteinextraktion aus Gewebe und Zellen
Die Proteinextraktion aus Geweben und Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt der Probenvorbereitung, der bei vielen biochemischen und analytischen Verfahren wie ELISA, PAGE, Western Blotting, Massenspektrometrie oder Proteinaufreinigung durchgeführt wird. Der Zellaufschluss, die Lyse und die Extraktion von intrazellulären Stoffen mit Ultraschall ist ein genau kontrollierbares, nicht-thermisches Verfahren, das eine hohe Ausbeute an Proteinen und anderen Molekülen gewährleistet.
Proteinextraktion aus Zellen mit dem Ultraschallhomogenisator UP200St
- Schnell
- hohe Erträge
- Hocheffizient
- Präzise Kontrolle über die Parameter
- reproduzierbare Ergebnisse
- lineare Skalierbarkeit
Allgemeine Anweisungen für die ultraschall-gestützten Zellaufschluss und die Proteinextraktion
- Temperaturregelung: Um einen hohen Proteinertrag ohne thermische Denaturierung zu gewährleisten, muss die Temperatur während der Extraktion kontrolliert werden. Hielscher's Ultraschallhomogenisatoren – auch Ultraschall-Desintegrator oder Ultraschallfinger genannt – sind präzise regelbar. Alle digitalen Ultraschallgeräte werden mit eine steckbaren Temperatursensor geliefert. Im digitalen Menü des Ultraschallhomogenisators kann eine maximale Temperatur eingestellt werden. Sobald dieses Temperatur-Maximum erreicht wird, stoppt der Ultraschallprozessor automatisch bis sich das Probenmaterial wieder abgekühlt hat.
- Puffer: Die Wahl eines geeigneten Puffers und das richtige Puffervolumen variiert je nach Gewebeart. Sie müssen durch Trial-and-Error-Test herausgefunden werden.
- Isolierung / Reinigung: Proteinlysate können ein Übermaß an Biomolekülen, z.B. DNA oder Kohlenhydrate, enthalten, die mittels Proteinfällung (Deoxycholate-Trichloressigsäure) oder einen Pufferwechsel entfernt werden können.
Chittapalo und Noomhorm (2009) berichteten in ihrer Studie, dass die Proteinausbeute durch Ultraschall gesteigert werden konnte und dass das Ultraschallverfahren zur Homogenisierung und Lyse von Gewebe die bestehenden Extraktionsverfahren erheblich verbessern kann – wodurch die Ultraschallextraktion andere herkömmliche gerade bei der Verarbeitung großer Volumina übertrifft.
Ultraschall-CupHorn für die gleichzeitige, hocheffiziente Probenvorbereitung mehrerer Proben unter gleichen Bedingungen für die Proteinisolierung und DNA-Fragmentierung.
Proteinextraktion aus tierischem Gewebe
Für die Präparation von ganzem Gewebe (z.B. Niere, Herz, Lunge, Muskel usw.) sollte das Gewebe mit sauberen Werkzeugen, vorzugsweise auf Eis, in sehr kleine Stücke zerlegt werden, um einen Abbau durch Proteasen (z.B. Lysepuffer wie RIPA oder hypotoner Lysepuffer mit Protease- und Phosphatasehemmercocktail) zu verhindern. Nach der Präparation wird die Probe in flüssigen Stickstoff getaucht, um sie dann einzufrieren. Die Probe kann bei -80°C für den späteren Gebrauch gelagert oder auf Eis gehalten werden, um sofort homogenisiert zu werden. Unmittelbar vor der Ultraschallextraktion wird Eiskaltlysepuffer (mit den Proteaseinhibitoren DTT, Leupeptin und Aprotinin) schnell in das Probengefäß gegeben (pro ~10 mg Gewebe werden ca. ~600 μL Puffer empfohlen). Pro Probenröhre werden ca. 20-60 mg Gewebe empfohlen.
Ultraschallhomogenisierung, Zellaufschluss und Extraktion werden mit einem Ultraschallhomogenisator wie dem UP100H oder UP200Ht durchgeführt, der mit einer Mikrospitze / Mikro-Sonotrode ausgestattet ist. Die Beschallungsdauer beträgt 60-90 Sekunden bei einem Ultraschallzyklus von 15 Sekunden Beschallung und 10 Sekunden Ruhezeit. Die Probe sollte die ganze Zeit auf Eis gelagert werden.
Nach der Ultraschallhomogenisierung / Extraktion wird das Lysat bei 27.000g für ca. 20 min. zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand aufgefangen, so dass die Proteinkonzentrat mit einem Protein-Assay, z.B. mittels Pierce Protein Assay BCA, analysiert werden kann.
Proteinextraktion aus Blutserum
Um ein homogenes Gemisch aus Serum und Phosphatpuffer zu erhalten, wird die Probe vor der Ultraschall-Zelllyse zunächst geschüttelt. Für die Ultraschall-Lyse wird die Probe mit einem Ultraschall-Laborhomogenisator wie dem UP100H für 8 Zyklen bei 20 % Amplitude beschallt, wobei die Zyklen jeweils 5 Sekunden ein- und 15 Sekunden ausgeschaltet werden. Die Proteinextraktion erfolgt durch zyklische Beschallung (Pulsationsmodus) und durch Abstellen der Probe auf Eis, damit eine Überhitzung und ein thermischer Abbau der Probe vermieden wird. Da Serum eine große Menge an Proteinen mit hohem Molekulargewicht (wie Albumin, α1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobulin, Immunglobulin G und Immunglobulin A) enthält, die die Abtrennung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht während der IEF stören, wird empfohlen, diese mit Hilfe einer Abreicherungssäule aus dem Serum zu entfernen.
Proteinextraktion aus Pflanzengewebe
Frisches, weiches Pflanzengewebe, wie z.B. Moos usw., kann leicht aufgeschlossen werden, indem das zerkleinerte Probenmaterial einfach in den Lysepuffer gegeben und beschallt wird. Harte, hölzerne Pflanzengewebe, wie z.B. Samen, Tannennadeln usw., sollten vor der Ultraschallextraktion trocken gemahlen werden. Einige harte, holzige Pflanzenmaterialien müssen gefroren und in flüssigem Stickstoff gemahlen werden, bevor sie mit Ultraschall extrahiert werden können. Für Pflanzenzellkultursuspensionen ist eine Ultraschallbehandlung zwischen 30 und 150 Sekunden in einem Lysepuffer meist ausreichend. Härteres Material wie Kürbiskerne erfordern eine intensivere Ultraschallbehandlung, wie nachfolgend beschrieben.
Protokoll für die Ultraschall-Extraktion von Albumin aus Kürbiskernen
Für die Ultraschall-Proteinextraktion von Albumin aus fein gemahlenem Kürbiskernpulver werden 10 g entfettetes Kürbiskernpulver und 100 ml entionisiertes Wasser als Lösungsmittel in ein 250-ml-Glasgefäß gegeben. Die Proteinextraktion erfolgt in zwei Schritten: Zunächst wird die Probe mit dem Ultraschallstab UP400St (400W, 24kHz) mit der Sonotrode S24d7 Das Becherglas wird während der Ultraschall-Homogenisierung in ein kaltes Wasserbad gestellt. Der steckbare Temperatursensor und die Temperatureinstellungen des Ultraschallgeräts UP400St sorgen dafür, dass die Probentemperatur immer unter 30°C gehalten wird. Durch die präzise Temperaturkontrolle während der Beschallung wird eine Denaturierung von Albumin vermieden. Zweitens wurde die Extraktion mit einem Mixer bei einer Geschwindigkeit von 200 U/min und einer Temperatur von 30°C durchgeführt. Danach wird das Becherglas in einen thermostatischen Schüttler überführt. Das Globulin wird durch Dialyse mit destilliertem Wasser entfernt. Nach der Globulinentfernung kann der Proteinextrakt für die Bestimmung des Albuminprofils entnommen werden und wird anschließend mit 0,1 M HCl zur Albumin-Koagulation auf pI=3,0 eingestellt. Die feste Phase wird durch Zentrifugation bei 5000g, 20°C abgetrennt und in deionisiertem Wasser wieder aufgelöst. Die Albumin-Koagulation wird zweimal durchgeführt, um den Proteinanteil im Albumin-Konzentrat zu erhöhen.
Die ultraschall-gestützte alkalische Proteinextraktion für die Herstellung von Proteinkonzentrat aus Reiskleie zeigt, dass durch die Beschallung – im Vergleich zu konventionellen Extraktionsmethoden - ein deutlich höherer Proteingehalt in deutlich kürzerer Extraktionszeit erzielt wird.
Probenvorbereitungs-Protokoll für funktionale iNOS Enzyme
Um ein voll funktionsfähiges iNOS-Enzym zu erhalten (z. B. für das Arzneimittel-Screening), wird das folgende Protokoll empfohlen: Die Zellsuspension wird auf Eis gelegt und mit einem UP100H bei einer Amplitude von 10µm im Zyklusmodus von 5 Sekunden Beschallung und 25 Sekunden Ruhe auf Eis beschallt. Der Vorgang sollte ca. 3 Mal wiederholt werden. Die Ruhezeit zwischen den Beschallungszyklen reduziert den Temperaturanstieg und damit das Risiko einer Denaturierung.
Ultraschall-gestützte Solubilisierung von Proteinen
Ultraschall kann die Solubilisierung von Proteinen, welche in der Regel mehrere Stunden andauert, deutlich beschleunigen. Um die Probe nicht zu überhitzen und einen Proteinabbau und die Modifikation von harnstoffhaltigen Lösungen zu verhindern, sollten die Beschallungszyklen nicht länger als einige Sekunden dauern.
Ultraschallhomogenisator UP200Ht mit 2mm-Mikrospitze S26d2 für die Beschallung von kleinen Proben.
Ultraschallhomogenisatoren für die Proteingewinnung
Hielscher Ultrasonics bietet eine breite Produktpalette von Ultraschallhomogenisatoren für den Zellaufschluss von Zellen, Gewebeproben, Bakterien, Mikroorganismen, Hefen und Sporen.
Hielscher Labor-Ultraschallgeräte sind leistungsstark und einfach zu bedienen. Gebaut für den 24/7-Betrieb, sind sie als robuste und effiziente Labor- und Tischgeräte konzipiert. Bei allen Geräten lassen sich die Energieabgabe und die Amplitude präzise steuern. Das breite Zubehörsortiment eröffnet weitere Ausstattungsmöglichkeiten. Die digitalen Ultraschallgeräte wie der VialTweeter, UP200Ht, UP200St und UP400St verfügen über eine integrierte Temperaturkontrolle und eine eingebaute SD-Karte zur automatischen Datenaufzeichnung.
Für die indirekte, kreuzkontaminationsfreie und gleichzeitige Beschallung von mehreren Proben bieten wir den VialTweeter oder das Ultraschall-CupHorn an.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über unsere Ultraschallgeräte für die Probenvorbereitung, den Zellaufschluss und die Extraktion. Klicken Sie auf den Gerätetyp, um mehr Informationen zu den einzelnen Ultraschall-Homogenisatoren zu erhalten. Unser gut geschultes und langjährig erfahrenes Fachpersonal hilft Ihnen gerne bei der Auswahl des Ultraschallhomogenisators, der am besten für Ihre Probenvorbereitung geeignet ist!
| Batch-Volumen | Durchfluss | Empfohlenes Ultraschallgerät |
|---|---|---|
| bis zu 10 Vials bzw. Röhrchen | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell-/Mikrotiterplatten | n.a. | UIP400MTP |
| mehrere Vials/Gefäße | n.a. | CupHorn |
| 1 bis 500ml | 10 bis 200ml/min | UP100H |
| 10 bis 1000mL | 20 bis 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 bis 2000ml | 20 bis 400ml/min | UP400St |
Je nach Anwendung, Material und Probenvolumen empfehlen wir Ihnen gerne das passende Setup für Ihre Probenvorbereitung. Kontaktieren Sie uns noch heute!
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Hielscher's digitale Ultraschallhomogenisatoren verfügen über eine Browser-Fernsteuerung sowie automatische Datenprotokollierung auf einer integrierten SD-Card.
VialTweeter für die indirekte Beschallung.
Wissenswertes
Proteomik
Die Proteomik befasst sich mit der Erforschung der Proteine und des Proteoms. Proteine erfüllen eine Vielzahl von lebenswichtigen Funktionen innerhalb von Organismen. Das Proteom ist die Gesamtmenge der Proteine, die durch ein Genom, Zelle, Gewebe oder einen Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert werden. Das Proteom schwankt über die Zeit und mit unterschiedlichen Anforderungen oder Belastungen, welche auf eine Zelle oder einen Organismus einwirken. Bei einem Proteom handelt es sich also um die Menge der exprimierten Proteine in einer bestimmten Zelle bzw. einem bestimmten Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt unter definierten Bedingungen. Der Begriff "Proteom" setzt sich aus den Begriffen "Protein" und "Genom" zusammen. Die Proteomik erforscht das Proteom.
Protein
Proteine sind große Biomoleküle, sogenannte Makromoleküle – welche sich aus einem oder mehreren langkettigen Aminosäureresten zusammensetzt. Proteine kommen in allen pflanzlichen und tierischen Organismen vor und sind essentiell wichtig für den Ablauf der meisten biologischen Funktionen. Da Proteine eine Vielzahl von biologischen Informationen enthalten, werden sie für analytische Zwecke, z.B. in der Proteomforschung, extrahiert. Zu den wichtigsten Funktion von Proteinen gehören die Katalyse von Stoffwechselreaktionen, die DNA-Replikation, die Reaktion auf Reize sowie der Molekültransport. Proteine unterscheiden sich hauptsächlich durch ihre Abfolge der Aminosäuren voneinander, welche sich nach der Nukleotidsequenz ihrer Gene richtet. Diese resultiert normalerweise in einer Proteinfaltung in einer spezifischen dreidimensionalen Struktur, durch welche die Proteinaktivität bestimmt wird. Proteine sind – neben den Peptiden – einers der wichtigsten Bestandteile in Nahrungsmitteln. Die Proteomik ist daher ein einflussreiches Hilfsmittel in der Ernährungswissenschaft, um Prozesse, Lebensmittelsicherheit sowie die ernährungswissenschaftliche Bewertung zu optimieren.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ist ein präanalytisches Verfahren zur Trennung und Vorkonzentration von Analyten. In Kombination mit Ultraschall kann die Cloud Point Extraktion intensiviert werden, wodurch das Verfahren effizienter, schneller und umweltfreundlicher wird. In Verbindung mit Ultraschall ist die Cloud Point Extraktion eine wesentlich effizientere Methode der Analytenvorbereitung. Lesen Sie mehr über die ultraschall-gestützte Cloud Point Extraktion!Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ist eine wichtige Methode zur Auftrennung und Analyse von Makromolekülen (z.B. DNA, RNA und Proteine sowie deren Bruchstücke), basierend auf deren Größe und Ladung. Sie wird in der klinischen Chemie verwendet, um Proteine durch Ladung und/oder Größe (IEF Agarose, im wesentlichen größenunabhängig) zu trennen. In der Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik werden DNA- und RNA-Fragmente entsprechend ihrer Länge aus Suspensionen zu spearieren, um die Größe der DNA- und RNA-Fragmente zu schätzen oder um Proteine entsprechend ihrer Ladung zu trennen.
Zellkulturen
Eine Zellkultur ist ein kontrollierter Wachstumsprozess, bei dem Zellen unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden. Die Wachstumsbedingungen von Zellkulturen variieren für jeden Zelltyp. Im Allgemeinen besteht die umgebung einer Zellkultur aus einem geeignetens Gefäß (z.B. Petrischale) mit Substrat oder Medium, welches die essentiellen Nährstoffe (Aminosäuren, Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralien), Wachstumsfaktoren, Hormone und Gase (CO2, O2) liefert und die physio-chemischen Umgebungsbedingungen (pH-Puffer, osmotischer Druck, Temperatur) reguliert. Die meisten Zellen benötigen eine Oberfläche oder ein künstlichens Substrat, während andere Zellkulturen frei schwebend in einem Kulturmedium kultiviert werden können (Suspensionskultur, Zellsuspension).
Die Massenkultivierung von tierischen Zellklinien wird in der industriellen Produktion eingesetzt, um virale Impfstoffe und andere biotechnologische Produkte herzustellen. Menschliche Stammzellen werden beispielsweise gezüchtet, um die Anzahl der Zellen zu steigern sowie um die Zellen in verschiedene somatische Zelltypen für Transplantationszwecke zu differenzieren.
Gewebeproben
Der Begriff "Gewebe" beschreibt ein zelluläres Zwischenprodukt, bei dem sich das das Zellmaterial auf einer Stufe zwischen Zelle und komplettem Organ befindet. In einem Gewebe befinden sich ähnliche Zellen denselben Ursprungs, die zusammen eine bestimmte Funktion ausführen. Durch die funktionale Gruppierung von mehreren Gewebarten bilden sich die komplexen Strukturen der Organe.
Das Gewebe wird für die Forschung in den Bereichen Biologie, Histologie/Histopathologie, Parasitologie, Biochemie, Immunhistochemie sowie zur Kultivierung und Extraktion von DNA entnommen. Man kann zwischen tierischem (Unterteilung: Säugetiergewebe) und pflanzlichem Gewebe unterscheiden. Tierisches Gewebe wird in die vier Grundtypen Binde-, Muskel-, Nerven- und Epithelgewebe eingeteilt. Pflanzengewebe wird in die folgenden drei Gewebesysteme unterteilt: die Epidermis, das Grundgewebe und das Gefäßgewebe.
Gewebeproben können aus tierischen oder pflanzlichen Bestandteilen, z.B. Knochen, Muskeln, Blättern etc. bestehen.
Körperflüssigkeiten
Blut, Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis, Speichel und Gelenkflüssigkeit sind Körperflüssigkeiten, welche eine wichtige Quelle für diagnostisch relevante Informationen bieten. Daher ist eine zuverlässige Vorbereitung der Körperflüssigkeitsproben für die Analyse äußerst wichtig. Eine Schwierigkeit resultiert aus dem breiten dynamischen Bereich der Komponenten, welche in Körperflüssigkeiten vorhanden sind.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Bradford-Test, Lowry-Test und das Bicinchoninsäure (BCA)-Assay sind gewöhnlich verwendete Assays, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Rinderserumalbumin (BSA) gehört zu den am häufigsten verwendete Proteinstandards.
Lyse-Puffer
Lysepuffer muss unter Berücksichtigung des Zellmaterials oder Gewebes (Gewebekultur, Pflanzen, Bakterien, Pilze, etc.) gewählt werden. Zudem muss berücksichtigt werden, ob sich die Zelle in einem strukturellen Gewebe befindet und um welche Art von Gewebe es sich dabei handelt. Zahlreiche Lysepuffer, die für die Extraktion von Proteinen, Membranen und Organellen verwendet werden, sind mit einem oder mehreren Detergentien formuliert. Das Detergens muss in der Regel durch Ausprobieren (trial-and-error) oder – wenn vorhanden – entsprechend einem vorhandenen Proteinextraktions-Protokoll gewählt werden. Das Detergens muss sowohl mit dem Gewebe als auch mit den Proteinen kompatibel sein. In der Regel wird das mildeste Detergens, welches für eine spezifisches Gewebe bzw. Protein funktioniert, gewählt, um die maximale Funktionalität des Extraktes sicherzustellen. Außerdem hält ein mildes Detergens bei der Membran- und Organellextraktion die Zellmembran intakt. Zu den häufig verwendeten Detergentien in Lysepuffern zählen nicht-ionische oder zwitter-ionische Detergenzien, z.B. CHAPS, Deoxycholate, Triton™ x-100, NP40 und Tween 20.
Gewebeproben wie z.B. Gehirn, Leber, Darm, Nieren, Milz etc. können beispielsweise einfach mit RIPA gepuffert werden – wobei allerdings Protease-Inhibitoren und DTT (z.B. für die Gelelektrophorese) enthalten sein sollten.
Lysepuffer für Skelettmuskelgewebe (eiskalt): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol. Der Puffer wird zusätzlich mit einem Protease- und Phosphatase- Inhibitor Cocktail versetzt.
Tabelle häufig verwendeter Puffer und ihrer pH-Bereiche. Im Allgemeinen werden diese Puffer in Konzentrationen von 20-50 mM verwendet.
| Puffer | pH-Bereich |
|---|---|
| Zitronensäure – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natriumcitrat – Zitronensäure | 3,0 – 6,2 |
| Natriumacetat – Essigsäure | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylsäure Natriumsalz – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihydrogen-Natriumphosphat – Dinatriumhydrogenphosphat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamin Hydrochlorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natriumtetraborat – Borsäure | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Die meisten Puffer weisen eine pH-Abhängigkeit bezüglich der Temperatur auf. Dies gilt insbesondere für Tris-Puffer. So ändert sich der pKa-Wert beispielsweise von 8,06 bei 25°C auf 8,85 bei 0°C.
(pH-Wert und pKa eines Puffers: Der pH misst die Konzentration von Wasserstoffionen in einer wäßrigen Lösung. pKa (= Säure-Dissoziationskonstante) ist ein verwandter, allerdings genauerer Messwert, der vorhersagt, wie sich ein Molekül bei einem bestimmten pH-Wert verhalten wird.)
TRIzol
TRIzol ist eine chemische Lösung zum Extrahieren von RNA/DNA/Protein, welche bei der Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion verwendet wird. Durch die ultraschall-gestützte TRIzol-Extraktion lassen sich hohe Erträge von DNA, RNA und Proteinen aus der gleichen Probe gewinnen. Dadurch übertrifft die ultraschall-gestützte TRIzol-Extraktion andere Extraktionsmethoden deutlich an Effizienz.
Literatur
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.