Ultraschallgestützte Proteinextraktion aus Gewebe und Zellkulturen
- Die Proteinextraktion ist ein wesentlicher Schritt der Probenvorbereitung in der Proteomik.
- Proteine können aus pflanzlichem und tierischem Gewebe, Hefen und Mikroorganismen extrahiert werden.
- Die Beschallung ist eine zuverlässige, effiziente Methode zur Proteinextraktion, die innerhalb kurzer Extraktionszeiten hohe Proteinausbeuten liefert.
Proteinextraktion aus Geweben und Zellen
Die Proteinextraktion aus Geweben und kultivierten Zellen ist ein wesentlicher Schritt der Probenvorbereitung bei zahlreichen biochemischen und analytischen Verfahren wie ELISA, PAGE, Western Blotting, Massenspektrometrie oder Proteinreinigung. Zellaufschluss, Lyse und Extraktion mittels Ultraschall sind präzise steuerbare, nichtthermische Verfahren zur Gewährleistung hoher Proteinausbeuten.
Proteinextraktion aus Zellen mit dem Ultraschallhomogenisator UP200St
- Schnell
- Hohe Ausbeuten
- Hocheffizient
- Präzise Kontrolle der Parameter
- Reproduzierbare Ergebnisse
- Lineare Skalierbarkeit
Allgemeine Hinweise zur ultraschallgestützten Lyse und Proteinextraktion
- Temperaturkontrolle: Um eine hohe Proteinausbeute ohne thermische Denaturierung zu gewährleisten, muss die Temperatur während der Extraktion kontrolliert werden. Die modernen Ultraschallhomogenisatoren von Hielscher – auch Ultraschalldesintegratoren oder Sonifikatoren genannt – sind präzise steuerbar. Sie werden mit einem steckbaren Temperatursensor geliefert. In den Einstellungen des Ultraschallhomogenisators lässt sich eine Höchsttemperatur festlegen. Sobald diese Höchsttemperatur erreicht ist, stoppt das Ultraschallgerät automatisch, bis die Probe abgekühlt ist.
- Puffer: Die Wahl eines geeigneten Puffers und des richtigen Puffervolumens ist vom jeweiligen Gewebe abhängig und muss durch Ausprobieren ermittelt werden.
- Isolierung / Reinigung: Proteinlysate können einen Überschuss an Biomolekülen wie DNA oder Kohlenhydraten enthalten, die durch Proteinfällung (Desoxycholat-Trichloressigsäure) oder Pufferaustausch entfernt werden können.
Chittapalo und Noomhorm (2009) berichteten in ihrer Studie, dass die Proteinausbeute durch Beschallung zunahm und dass die ultraschallgestützte Gewebehomogenisierung und Lyse bestehende Extraktionsverfahren erheblich verbessern können – wodurch sich neue Möglichkeiten für die kommerzielle Extraktion eröffnen.
Ultraschall-CupHorn zur gleichzeitigen, hocheffektiven Probenvorbereitung mehrerer Proben unter gleichen Bedingungen für die Proteinisolierung und DNA-Fragmentierung.
Proteinextraktion aus tierischem Gewebe
Zur Aufbereitung ganzer Gewebe (z. B. Niere, Herz, Lunge, Muskel usw.) sollte das Gewebe mit sauberen Werkzeugen in sehr kleine Stücke zerteilt werden, vorzugsweise auf Eis und so schnell wie möglich, um einen Abbau durch Proteasen zu verhindern (Lysepuffer: z. B. RIPA oder hypotonischer Lysepuffer mit einem Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktail). Nach dem Zerteilen wird die Probe zum Schockgefrieren in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Die Probe kann für eine spätere Verwendung bei -80°C gelagert oder zur sofortigen Homogenisierung auf Eis gehalten werden. Unmittelbar vor der Ultraschallextraktion wird eiskalter Lysepuffer (mit den Proteaseinhibitoren DTT, Leupeptin und Aprotinin) zügig in das Probenröhrchen gegeben (pro ~10 mg Gewebe werden ca. ~600 μL Puffer empfohlen). Pro Probenröhrchen werden ca. 20–60mg Gewebe empfohlen.
Die ultraschallgestützte Homogenisierung, Lyse und Extraktion erfolgt mit einem Ultraschallhomogenisator wie dem UP100H oder UP200Ht, der mit einer Mikrospitzen-Sonotrode ausgestattet ist. Die Beschallungsdauer beträgt 60–90 sec. im Ultraschall-Zyklusmodus mit 15 sec. Beschallung und 10 sec. Pause. Die Probe sollte während der gesamten Zeit in Eis gehalten werden.
Nach der ultraschallgestützten Homogenisierung / Extraktion wird das Lysat bei siebenundzwanzigtausendfacher Erdbeschleunigung (27.000g) für ca. 20 min zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand gesammelt, sodass die Proteinkonzentration mit einem Proteinassay wie dem Pierce-BCA-Proteinassay bestimmt werden kann.
Proteinextraktion aus Blutserum
Um eine homogene Mischung aus Serum und Phosphatpuffer zu erhalten, wird die Probe vor der ultraschallgestützten Zelllyse zunächst mit einem Vortexmischer gemischt. Für die ultraschallgestützte Lyse wird die Probe mit einem Ultraschall-Laborhomogenisator wie dem UP100H über 8 Zyklen bei 20% Amplitude beschallt, wobei jeder Zyklus aus 5 Sekunden Beschallung und 15 Sekunden Pause besteht. Die Proteinextraktion erfolgt durch zyklische Beschallung (Pulsationsmodus), wobei die Probe auf Eis gestellt wird, um eine Überhitzung und einen thermischen Abbau der Probe zu vermeiden. Da Serum große Mengen hochmolekularer Proteine enthält (wie Albumin, α1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobulin, Immunglobulin G und Immunglobulin A), die die Trennung niedermolekularer Proteine während der IEF beeinträchtigen, wird empfohlen, diese mithilfe einer Depletionssäule aus dem Serum abzureichern.
Proteinextraktion aus pflanzlichem Gewebe
Frisches, weiches Pflanzengewebe, z. B. Moos, lässt sich leicht aufschließen, indem das zerkleinerte Probenmaterial zur Beschallung einfach in Lysepuffer gegeben wird. Zähe, verholzte Pflanzengewebe wie Samen, Tannennadeln usw. sollten trocken gemahlen werden. Einige harte, holzige Pflanzenmaterialien müssen vor der Extraktion durch Beschallung in flüssigem Stickstoff eingefroren und gemahlen werden. Für pflanzliche Zellkultursuspensionen reicht meist eine Ultraschallbehandlung von 30 bis 150 Sekunden in einem Lysepuffer aus. Widerstandsfähigeres Material wie Kürbiskerne erfordert eine intensivere Beschallung, wie nachfolgend beschrieben.
Protokoll zur ultraschallgestützten Extraktion von Albumin aus Kürbiskernen
Für die ultraschallgestützte Extraktion des Proteins Albumin aus fein gemahlenem Kürbiskernpulver werden 10 g entfettetes Kürbiskernpulver und 100 mL deionisiertes Wasser als Lösungsmittel in ein 250mL-Becherglas gegeben. Die Proteinextraktion erfolgt in zwei Schritten: Zunächst erfolgt die Beschallung der Probe mit einem Ultraschallgerät UP400St (400W, 24kHz), das mit der Sonotrode S24d7 ausgestattet ist. Das Becherglas wird während der Ultraschallhomogenisierung in ein kaltes Wasserbad gestellt. Der steckbare Temperatursensor und die Einstellungen zur Temperaturkontrolle des Ultraschallgeräts UP400St gewährleisten, dass die Probentemperatur stets unter 30°C bleibt. Durch die präzise Temperaturkontrolle während der Beschallung wird eine Denaturierung des Albumins vermieden. Im zweiten Schritt erfolgt die Extraktion mit einem Mischer bei einer Drehzahl von 200 rpm und bei 30°C. Anschließend wird das Becherglas in einen thermostatisierten Schüttler überführt. Globulin wird durch Dialyse mit destilliertem Wasser entfernt. Nach der Entfernung des Globulins kann dem Proteinextrakt eine Probe zur Bestimmung des Albuminprofils entnommen werden. Anschließend wird der Extrakt zur Albuminkoagulation mit 0,1 M HCl auf pI=3,0 eingestellt. Die feste Phase wird durch Zentrifugation bei 5000g und 20°C abgetrennt und erneut in deionisiertem Wasser gelöst. Die Albuminkoagulation wird zweimal durchgeführt, um den Proteinanteil im Albuminkonzentrat zu erhöhen.
Die ultraschallgestützte alkalische Proteinextraktion zur Herstellung von Proteinkonzentrat aus Reiskleie zeigt, dass die Ultraschallbehandlung im Vergleich zu herkömmlichen Extraktionsmethoden eine höhere Proteinausbeute bei deutlich kürzerer Extraktionszeit ermöglicht.
Protokoll zur Probenvorbereitung für funktionsfähiges iNOS-Enzym
Um vollständig funktionsfähiges iNOS-Enzym zu erhalten (z. B. für das Wirkstoffscreening), wird folgendes Protokoll empfohlen: Die Zellsuspension sollte auf Eis gestellt und mit einem UP100H bei 10µm Amplitude im Zyklusmodus mit 5 sec. Beschallung und 25 sec. Pause auf Eis beschallt werden. Das Verfahren sollte ca. 3 Mal wiederholt werden. Die Pause zwischen den Beschallungszyklen verringert den Temperaturanstieg und reduziert dadurch das Risiko einer Denaturierung.
Ultraschallgestützte Proteinsolubilisierung
Die Beschallung kann die Proteinsolubilisierung beschleunigen, die normalerweise mehrere Stunden erfordert. Um die Probe nicht zu überhitzen und Proteinabbau sowie Modifikationen in harnstoffhaltigen Lösungen zu verhindern, sollten die Ultraschallimpulse nicht länger als wenige Sekunden dauern.
Ultraschallgerät UP200Ht mit 2mm-Mikrospitze S26d2 zur Beschallung kleiner Proben.
Ultraschallgeräte zur Proteinextraktion
Hielscher Ultrasonics bietet ein breites Sortiment an Ultraschallhomogenisatoren zum Aufschluss von Zellen, Geweben, Bakterien, Mikroorganismen, Hefen und Sporen.
Die Labor-Ultraschallgeräte von Hielscher sind leistungsstark und einfach zu bedienen. Sie sind für den 24/7-Betrieb ausgelegt und als robuste, effiziente Labor- und Tischgeräte konzipiert. Bei allen Geräten lassen sich die Energieabgabe und die Amplitude präzise steuern. Das umfangreiche Zubehörsortiment eröffnet weitere Konfigurationsmöglichkeiten. Die digitalen Ultraschallgeräte wie VialTweeter, UP200Ht, UP200St und UP400St verfügen über eine integrierte Temperaturkontrolle und eine eingebaute SD-Karte zur automatischen Datenaufzeichnung.
Für die indirekte, gleichzeitige Beschallung mehrerer Proben ohne Kreuzkontamination bieten wir den VialTweeter oder den Ultraschall-CupHorn an.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über unsere Ultraschallgeräte zur Probenvorbereitung, zum Zellaufschluss und zur Extraktion. Klicken Sie auf den Gerätetyp, um weitere Informationen zum jeweiligen Ultraschallhomogenisator zu erhalten. Unser gut geschultes technisches Fachpersonal mit langjähriger Erfahrung hilft Ihnen gerne bei der Auswahl des am besten geeigneten Ultraschallgeräts für Ihre Probenvorbereitung!
| Batch-Volumen | Durchfluss | Empfohlene Geräte |
|---|---|---|
| bis zu 10 Vials oder Röhrchen | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell- / Mikrotiterplatten | n.a. | UIP400MTP |
| mehrere Röhrchen / Gefäße | n.a. | CupHorn |
| 1 bis 500mL | 10 bis 200mL/min | UP100H |
| 10 bis 1000mL | 20 bis 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 bis 2000mL | 20 bis 400mL/min | UP400St |
Abhängig von Ihrer Anwendung, Ihrem Material und Ihrem Probenvolumen empfehlen wir Ihnen die am besten geeignete Gerätekonfiguration für Ihre Probenvorbereitung. Kontaktieren Sie uns noch heute!
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Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher verfügen über eine Browser-Fernsteuerung und eine automatische Datenprotokollierung auf einer integrierten SD-Karte.
VialTweeter zur indirekten Beschallung.
Wissenswertes
Proteomik
Die Proteomik ist das Forschungsgebiet, das Proteine und das Proteom untersucht. Proteine erfüllen eine Vielzahl lebenswichtiger Funktionen in Organismen. Das Proteom ist die Gesamtheit der Proteine, die zu einem bestimmten Zeitpunkt von einem Genom, einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus exprimiert werden. Das Proteom verändert sich im Laufe der Zeit und je nach den Anforderungen oder Belastungen, denen eine Zelle oder ein Organismus ausgesetzt ist. Genauer gesagt ist es die Gesamtheit der exprimierten Proteine in einem bestimmten Zelltyp oder Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt unter definierten Bedingungen. Der Begriff „Proteom“ setzt sich aus den Wörtern Protein und Genom zusammen. Die Proteomik ist die Erforschung des Proteoms.
Protein
Proteine sind große Biomoleküle, sogenannte Makromoleküle – sie bestehen aus einer oder mehreren langen Ketten von Aminosäureresten. Proteine kommen in allen pflanzlichen und tierischen Organismen vor und sind für die meisten biologischen Funktionen entscheidend. Da Proteine viele biologische Informationen enthalten, werden sie für analytische Zwecke extrahiert, z. B. für die Proteomforschung. Zu den wichtigsten Funktionen von Proteinen gehören die Katalyse von Stoffwechselreaktionen, die DNA-Replikation, die Reaktion auf Reize und der Transport von Molekülen von einem Ort zum anderen. Proteine unterscheiden sich hauptsächlich in ihrer Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz ihrer Gene vorgegeben wird und üblicherweise zur Faltung des Proteins in eine bestimmte dreidimensionale Struktur führt, die seine Aktivität bestimmt. Proteine gehören – neben Peptiden – zu den Hauptbestandteilen von Lebensmitteln. Daher ist die Proteomik ein leistungsfähiges Werkzeug in der Lebensmittelwissenschaft, um Prozesse, Lebensmittelsicherheit und die ernährungsphysiologische Bewertung zu optimieren.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ist ein präanalytisches Verfahren zur Trennung und Voranreicherung von Analyten. In Kombination mit Ultraschall kann die Cloud-Point-Extraktion intensiviert werden, wodurch das Verfahren effizienter, schneller und umweltfreundlicher wird. Mit Ultraschall ist die Cloud-Point-Extraktion eine deutlich effizientere Methode zur Analytenvorbereitung. Erfahren Sie mehr über die ultraschallgestützte Cloud-Point-Extraktion!
Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ist die wichtigste Methode zur Trennung und Analyse von Makromolekülen wie DNA, RNA und Proteinen sowie deren Fragmenten anhand ihrer Größe und Ladung. Sie wird in der klinischen Chemie zur Trennung von Proteinen nach Ladung und/oder Größe eingesetzt (IEF in Agarose, weitgehend größenunabhängig). In der Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik dient sie dazu, ein Gemisch aus DNA- und RNA-Fragmenten nach ihrer Länge zu trennen, die Größe von DNA- und RNA-Fragmenten abzuschätzen oder Proteine nach ihrer Ladung zu trennen.
Zellkulturen
Die Zellkultur ist ein kontrollierter Wachstumsprozess, bei dem Zellen unter kontrollierten Bedingungen kultiviert werden. Die Zellkulturbedingungen unterscheiden sich je nach Zelltyp. Im Allgemeinen besteht die Umgebung einer Zellkultur aus einem geeigneten Gefäß (z. B. einer Petrischale) mit einem Substrat oder Medium, das die wesentlichen Nährstoffe (Aminosäuren, Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralstoffe), Wachstumsfaktoren, Hormone und Gase (CO2, O2) bereitstellt und die physikalisch-chemischen Umgebungsbedingungen (pH-Puffer, osmotischer Druck, Temperatur) reguliert. Die meisten Zellen benötigen eine Oberfläche oder ein künstliches Substrat, während andere Zellkulturen frei schwebend im Kulturmedium kultiviert werden können (Suspensionskultur, Zellsuspension).
Massenkulturen tierischer Zelllinien werden zur industriellen Herstellung viraler Impfstoffe und anderer biotechnologisch gewonnener Produkte eingesetzt. Menschliche Stammzellen werden kultiviert, um die Zellzahl zu erhöhen und die Zellen für Transplantationszwecke in verschiedene somatische Zelltypen zu differenzieren.
Gewebeproben
Der Begriff Gewebe bezeichnet eine zelluläre Zwischenstufe, bei der sich das Zellmaterial auf einer Organisationsebene zwischen einzelnen Zellen und einem vollständigen Organ befindet. In einem Gewebe sind ähnliche Zellen gleichen Ursprungs zusammengefasst, die gemeinsam eine bestimmte Funktion erfüllen. Durch die funktionelle Zusammenfassung mehrerer Gewebe entstehen die komplexen Strukturen von Organen.
Gewebeproben werden für die Forschung in Biologie, Histologie/Histopathologie, Parasitologie, Biochemie und Immunhistochemie sowie zur Kultivierung und DNA-Extraktion entnommen. Es wird zwischen tierischem Gewebe (Untergruppe: Säugetiergewebe) und pflanzlichem Gewebe unterschieden. Tierische Gewebe werden in die vier Grundtypen Binde-, Muskel-, Nerven- und Epithelgewebe eingeteilt. Pflanzliches Gewebe wird in die folgenden drei Gewebesysteme untergliedert: Epidermis, Grundgewebe und Leitgewebe.
Gewebeproben können aus tierischen oder pflanzlichen Teilen, z. B. Knochen, Muskeln oder Blättern, hergestellt werden.
Körperflüssigkeiten
Blut, Serum, Plasma, Liquor, Speichel und Synovialflüssigkeit sind Körperflüssigkeiten, die eine reichhaltige Quelle diagnostisch relevanter Informationen darstellen. Daher ist eine sorgfältige Aufbereitung von Körperflüssigkeitsproben für die Analyse wichtig. Die erste Schwierigkeit liegt im großen dynamischen Konzentrationsbereich der in Körperflüssigkeiten vorhandenen Bestandteile.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Der Bradford-Assay, der Lowry-Assay und der Bicinchoninsäure-Assay (BCA) sind gängige Tests zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Rinderserumalbumin (BSA) ist einer der am häufigsten verwendeten Proteinstandards.
Lysepuffer
Der Lysepuffer muss entsprechend dem Zellmaterial oder Gewebe (Gewebekultur, Pflanze, Bakterien, Pilze usw.) ausgewählt werden. Dabei ist auch zu berücksichtigen, ob die Zellen in einer Struktur vorliegen und um welche Art von Struktur es sich handelt. Zahlreiche Lysepuffer zur Extraktion von Proteinen, Membranen und Organellen enthalten ein oder mehrere Detergenzien. Das Detergens wird üblicherweise durch Ausprobieren oder – sofern verfügbar – anhand eines bestehenden Proteinextraktionsprotokolls ausgewählt. Das Detergens muss mit dem Ausgangsgewebe und den Proteinen kompatibel sein. Im Allgemeinen wird das mildeste Detergens gewählt, das für ein bestimmtes Gewebe / Protein wirksam ist, um die größtmögliche Funktionalität des Extrakts zu erhalten. Darüber hinaus hält ein mildes Detergens bei der Extraktion von Membranen und Organellen die Membran intakt. Häufig in Lysepuffern verwendete Detergenzien sind überwiegend nichtionisch oder zwitterionisch, z. B. CHAPS, Desoxycholat, Triton™ X-100, NP40 und Tween 20.
Beispielsweise können Gewebe wie Gehirn, Leber, Darm, Niere, Milz usw. einfach mit RIPA gepuffert werden – allerdings sollten Proteaseinhibitoren und DTT (z. B. für die Gelelektrophorese) enthalten sein.
Lysepuffer für Skelettmuskelgewebe (eiskalt): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, ergänzt um einen Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktail.
Tabelle gängiger Puffer und ihrer pH-Bereiche. Diese Puffer werden üblicherweise in Konzentrationen von 20–50 mM verwendet.
| Puffer | pH-Bereich |
|---|---|
| Citronensäure – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natriumcitrat – Citronensäure | 3,0 – 6,2 |
| Natriumacetat – Essigsäure | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylsäure-Natriumsalz – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdihydrogenphosphat – Dinatriumhydrogenphosphat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolaminhydrochlorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natriumtetraborat – Borsäure | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Bei den meisten Puffern ist der pH-Wert temperaturabhängig. Dies gilt besonders für Tris-Puffer. Der pKa-Wert verändert sich von 8,06 bei 25°C auf 8,85 bei 0°C.
(pH und pKa eines Puffers: Der pH-Wert misst die Konzentration der Wasserstoffionen in einer wässrigen Lösung. Der pKa-Wert (= Säuredissoziationskonstante) ist ein verwandtes, jedoch spezifischeres Maß, da er hilft vorherzusagen, wie sich ein Molekül bei einem bestimmten pH-Wert verhält.)
TRIzol
TRIzol ist eine chemische Lösung, die zur Extraktion von RNA/DNA/Protein bei der Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion verwendet wird. Die ultraschallgestützte TRIzol-Extraktion liefert hohe DNA-, RNA- und Proteinausbeuten aus derselben Probe und übertrifft damit andere Extraktionsmethoden.
Literatur/Quellen
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.