Hielscher – Ultraschall-Technologie

Proteinextraktion aus Gewebeproben und Zellkulturen

  • Die Proteinextraktion ist ein wichtiger Schritt der Probenvorbereitung in der Proteomik.
  • Proteine können aus pflanzlichem und tierischen Gewebe, Hefen und Mikroorganismen extrahiert werden.
  • Ultraschall ist eine zuverlässige, effiziente Methode der Proteinextraktions, mit der hohe Proteinerträge innerhalb einer kurze Extraktionszeit gewonnen werden.

Proteingewinnung

Die Extraktion von Proteinen aus Gewebe- und Zellkulturen zählt zu den typischen Verfahren der Probenvorbereitung, welcher für viele biochemische und analytische Techniken wie ELISA, PAGE, Western Blotting, Massenspektrometrie oder Proteinaufreinigung durchgeführt werden müssen. Für Zellaufschluss, Lyse und Extraktion ist Ultraschall eine häufig eingesetzte Technik, da sie präzise steuerbar ist und hohe Proteinerträge sichert.

Proteinextraktion aus tierischem Gewebe

Bei der Vorbereitung von Gewebeproben (z.B. Niere, Herz, Lunge, Muskeln etc.) sollte das Gewebe zuerst mit sauberem Werkzeug in sehr kleine Stücke zerlegt werden. Dabei sollte die Probe möglichst auf Eis gekühlt und schnellstmöglich mit Proteasen (z.B. einem Lysepuffer wie RIPA oder hypotonen Lysepuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor Cocktail) versetzt werden. Nach dem Zerkleinern wird die Probe in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Probe kann bei -80°C für eine spätere Verwendung gelagert werden oder auf Eis sofortig homogenisiert werden. Unmittelbar vor der Ultraschallextraktion wird eiskalter Puffer (mit Protease-Inhibitoren DTT, Leupeptin und Aprotinin) rasch in das Probengefäß (pro ~10 mg Gewebe werden ca. ~600 μL Puffer empfohlen) hinzugefügt. Pro Tube wird eine Probenmenge von ca. 20-60mg Gewebe empfohlen.
Die Homogenisierung, Lyse und Extraktion erfolgt mit einem Ultraschallhomogenisator wie z.B. dem UP200Ht oder UP200St, an die eine Sonotrode mit Mikrospitze angeschraubt wird. Die Beschallung dauert 60-90 Sek., wobei die Homogenisierung zyklisch im Wechsel von 15 Sek. Beschallung und 10 Sek. Ruhezeit erfolgt. Die Probe sollte ständig auf Eis gekühlt werden werden.
Nach der Ultraschallhomogenisierung / Extraktion wird das Lysat bei 27.000g für ca. 20 min. zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand aufgefangen, so dass die Proteinkonzentrat mit einem Protein-Assay, z.B. mittels Pierce Protein Assay BCA, analysiert werden kann.

Beschallung ist eine wichtige Methode der Probenvorbereitung

Ultraschall-Homogenisator UP200St

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Proteinextraktion aus Blutserum

Für eine homogene Mischung des Serums mit dem Phosphatpuffer wird die Probe zuerst mit einem Vortex-Mischer suspsendiert, bevor sie mit Ultraschall lysisert wird. Für die ultraschall-gestüzte Lyse wird die Probe mit einem Ultraschall-Laborhomogenisator, z.B. dem UP100H , bei 20% Amplitude für 8 Beschallungszyklen mit jeweils 5 Sekunden Ultraschall und 15 Sekunden Pause lysiert. Die Beschallung erfolgt in zyklischer Beschallung der Probe auf Eis, um ein Überhitzung und dem thermischen Abbau der Probe zu vermeiden. Da Serum eine große Menge hochmolekularer Proteine (z.B. Albumin, α1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobulin, Immunglobulin G und Immunglobulin A) aufweist, welche mit der Abtrennung der niedermolekularen Proteine während der IEF (isoelektrischen Fokussierung) interferieren, empfiehlt es sich, diese aus dem Serum mittels Depletionssäule abzureichern.

Proteinextraktion aus Pflanzengewebe

Frisches, weiches Pflanzengewebe, z.B. Moos etc., kann leicht aufgeschlossen werden, indem das zerkleinerte Probenmaterial in einem Lysepuffer beschallt wird. Hartes, fasriges Pflanzengewebe, wie z.B. Samen, Tannennadeln usw. sollten zuerst getrocknet und gemahlen werden. Sehr harte, hölzerne Materialien müssen zunächst in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann gemahlen werden, bevor sie mit Ultraschall lysiert und extrahiert werden können. Für kultivierte pflanzliche Zellsuspensionen reicht meist eine Ultraschallbehandlung zwischen 30 und 150 Sekunden in einem Lyse-Puffer aus, um die Zellen aufzuschließen. Härtere Materialien wie z.B. Kürbiskerne erfordern eine intensivere Beschallung, wie sie unten beschrieben wird.

Protokoll für die Ultraschall-Extraktion von Albumin aus Kürbiskernen

Ultraschallhomogenisator UP400St mit S24d40 - für die Proteinextraktion aus pflanzlichem und tierischem Gewebe (zum Vergrößern anklicken!)Für die ultraschall-gestütze Albumingewinnung aus fein gemahlenem Kürbiskernen, werden 10g entfettetes Kürbiskernulver und 100mL deionisiertes Wasser als Lösungsmittel in einem 250mL-Becherglas gemischt. Die Proteinextraktion erfolgt in zwei Schritten: Zuerst wird die Probe mit dem Ultraschallstabhomogenisator UP400St (400W, 24kHz) mit montierter Sonotrode S24d7 beschallt. Das Becherglas wird während der Ultraschall-Homogenisierung in ein kaltes Wasserbad platziert. Über die Einstellung im digitalen Menü des Ultraschallgerätes UP400St , welches mit einem Stckbaren Temperatursensor ausgerüstet ist, wird sichergestellt, dass die Probentemperatur nicht 30°C übersteigt. Durch die präzise Temperaturkontrolle während Beschallung wird eine Denaturierung des Albumins vermieden. Anschließend wird die Probe bei 200 u/min und 30°C mit einem Labormischer behandelt. Danach wird das Becherglas in einen thermostatischen Schüttler gestellt. Das Globulin wird mittels Dialyse mit destilliertem Wasser ausgefällt. Nachdem das Globulin entfernt wurde, wird eine Stichprobe des Proteinextrakts zur Bestimmung des Albuminprofils genommen und anschließend mit 0,1 M HCl auf pI=3,0 (isoelektrischer Punkt) für die Albuminkoagulierung eingestellt. Die Feststoffphase wird durch Zentrifugation bei 5000g und 20°C abgetrennt in deionisiertem Wasser gelöst. Die Albuminkoagulierung wird zweimal durchgeführt, um das Protein-Verhältnis im Albumin-Konzentrat zu erhöhen.

Die ultraschall-gestützte alkalische Proteinextraktion für die Herstellung von Proteinkonzentrat aus Reiskleie zeigt, dass durch die Beschallung – im Vergleich zu konventionellen Extraktionsmethoden - ein deutlich höherer Proteingehalt in deutlich kürzerer Extraktionszeit erzielt wird.

Ultraschallgerät VialTweeter für Proteinextraktion aus Gewebeproben (zum Vergrößern anklicken!)

VialTweeter für die indirekte Beschallung.

Vorteile

  • Schnell
  • hohe Erträge
  • Hocheffizient
  • Präzise Kontrolle über die Parameter
  • reproduzierbare Ergebnisse
  • die lineare Skalierbarkeit

Probenvorbereitungs-Protokoll für funktionale iNOS Enzyme

Um voll funktionsfähige iNOS Enzyme (z.B. für ein Drogenscreening) zu erhalten, empfiehlt sich das folgende Protokoll: Die Zellsuspension wird auf Eis gelegt und mit einem UP100H pulsierend beschallt, wobei ein Zyklus von 5 Sek. Ultraschall und 25 Sek. Pause bei 10µm Amplitude eingestellt wird. Der Ultraschallzyklus sollte ca. 3 Mal wiederholt werden. Die Pause zwischen den Beschallungszyklen reduziert einen Temperaturanstieg und damit das Risiko einer Denaturierung der Proteine.

Ultraschall-gestützte Solubilisierung von Proteinen

Ultraschall kann die Solubilisierung von Proteinen, welche in der Regel mehrere Stunden andauert, deutlich beschleunigen. Um die Probe nicht zu überhitzen und einen Proteinabbau und die Modifikation von harnstoffhaltigen Lösungen zu verhindern, sollten die Beschallungszyklen nicht länger als einige Sekunden dauern.

Generelle Hinweise

Temperaturregelung: Um einen hohen Proteinertrag ohne thermische Denaturierung zu gewährleisten, muss die Temperatur während der Extraktion kontrolliert werden. Hielscher's Ultraschallhomogenisatoren – oft auch Ultraschalldesintegratoren oder Ultraschallgeber genannt – sind präzise regelbar. Alle digitalen Ultraschallgeräte werden mit eine steckbaren Temperatursensor geliefert. Im digitalen Menü des Ultraschallhomogenisators kann eine maximale Temperatur eingestellt werden. Sobald dieses Temperatur-Maximum erreicht wird, stoppt der Ultraschallprozessor automatisch bis sich das Probenmaterial wieder abgekühlt hat.
Puffer: Die Wahl eines geeigneten Puffers und das richtige Puffervolumen variiert je nach Gewebeart. Sie müssen durch Trial-and-Error-Test herausgefunden werden.
Isolierung / Reinigung: Proteinlysate können ein Übermaß an Biomolekülen, z.B. DNA oder Kohlenhydrate, enthalten, die mittels Proteinfällung (Deoxycholate-Trichloressigsäure) oder einen Pufferwechsel entfernt werden können.

Chittapalo und Noomhorm (2009) berichteten, dass der Proteinertrag mittels Ultraschall steigern lässt und dass die Ultraschallhomogenisierung und Lyse bestehende Extraktionsverfahren deutlich verbessert – wodurch die Ultraschallextraktion andere herkömmliche gerade bei der Verarbeitung großer Volumina übertrifft.

Sound protection with Hielscher's sound enclosure SPB-L and ultrasonic device UP200St. (Click to enlarge!)

Ultraschall-Homogenisator UP200St für die effiziente Proteinextraktion

Präzise Kontrolle über Beschallungsparameter (zum Vergrößern anklicken!)

Webbrowser-Steuerung für eine präzise Bedienung und Kontrolle des Ultraschallprozesses

Ultraschallhomogenisatoren für die Proteingewinnung

Hielscher Ultrasonics bietet eine breite Produktpalette von Ultraschallhomogenisatoren für den Zellaufschluss von Zellen, Gewebeproben, Bakterien, Mikroorganismen, Hefen und Sporen.
Hielscher's Labor-Ultraschallgeräte sind leistungsstark und einfach zu bedienen. Für 24/7-Betrieb gebaut, überzeugen unsere Ultraschallhomogenisatoren als robuste und effiziente Labor- und Technikumsgeräte. Bei allen Geräten lässt sich der Energieeintrag und die Amplitude exakt steuern. Die Vielfalt an Zubehör ermöglicht verschiedene Einsatzmöglichkeiten. Unsere digitalen Geräte wie der VialTweeter, UP200Ht, UP200St und UP400St verfügen über eine integrierte Temperaturregelung sowie eine integrierte SD-Karte für die automatische Datenerfassung.
Für die indirekte, kreuzkontaminationsfreie und simultane Beschallung mehrerer Proben eignen sich besonders der VialTweeter oder das Ultraschall-CupHorn.
Je nach Anwendung, Material und Probenvolumen empfehlen wir Ihnen gerne das passende Setup für Ihre Probenvorbereitung. Kontaktieren Sie uns noch heute!

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Literatur

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
  • Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.


Wissenswertes

Proteomik

Die Proteomik befasst sich mit der Erforschung der Proteine und des Proteoms. Proteine erfüllen eine Vielzahl von lebenswichtigen Funktionen innerhalb von Organismen. Das Proteom ist die Gesamtmenge der Proteine, die durch ein Genom, Zelle, Gewebe oder einen Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert werden. Das Proteom schwankt über die Zeit und mit unterschiedlichen Anforderungen oder Belastungen, welche auf eine Zelle oder einen Organismus einwirken. Bei einem Proteom handelt es sich also um die Menge der exprimierten Proteine in einer bestimmten Zelle bzw. einem bestimmten Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt unter definierten Bedingungen. Der Begriff "Proteom" setzt sich aus den Begriffen "Protein" und "Genom" zusammen. Die Proteomik erforscht das Proteom.

Protein

Proteine sind große Biomoleküle, sogenannte Makromoleküle – welche sich aus einem oder mehreren langkettigen Aminosäureresten zusammensetzt. Proteine kommen in allen pflanzlichen und tierischen Organismen vor und sind essentiell wichtig für den Ablauf der meisten biologischen Funktionen. Da Proteine eine Vielzahl von biologischen Informationen enthalten, werden sie für analytische Zwecke, z.B. in der Proteomforschung, extrahiert. Zu den wichtigsten Funktion von Proteinen gehören die Katalyse von Stoffwechselreaktionen, die DNA-Replikation, die Reaktion auf Reize sowie der Molekültransport. Proteine unterscheiden sich hauptsächlich durch ihre Abfolge der Aminosäuren voneinander, welche sich nach der Nukleotidsequenz ihrer Gene richtet. Diese resultiert normalerweise in einer Proteinfaltung in einer spezifischen dreidimensionalen Struktur, durch welche die Proteinaktivität bestimmt wird. Proteine sind – neben den Peptiden – einers der wichtigsten Bestandteile in Nahrungsmitteln. Die Proteomik ist daher ein einflussreiches Hilfsmittel in der Ernährungswissenschaft, um Prozesse, Lebensmittelsicherheit sowie die ernährungswissenschaftliche Bewertung zu optimieren.

Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese ist eine wichtige Methode zur Auftrennung und Analyse von Makromolekülen (z.B. DNA, RNA und Proteine sowie deren Bruchstücke), basierend auf deren Größe und Ladung. Sie wird in der klinischen Chemie verwendet, um Proteine durch Ladung und/oder Größe (IEF Agarose, im wesentlichen größenunabhängig) zu trennen. In der Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik werden DNA- und RNA-Fragmente entsprechend ihrer Länge aus Suspensionen zu spearieren, um die Größe der DNA- und RNA-Fragmente zu schätzen oder um Proteine entsprechend ihrer Ladung zu trennen.

Zellkulturen

Eine Zellkultur ist ein kontrollierter Wachstumsprozess, bei dem Zellen unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden. Die Wachstumsbedingungen von Zellkulturen variieren für jeden Zelltyp. Im Allgemeinen besteht die umgebung einer Zellkultur aus einem geeignetens Gefäß (z.B. Petrischale) mit Substrat oder Medium, welches die essentiellen Nährstoffe (Aminosäuren, Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralien), Wachstumsfaktoren, Hormone und Gase (CO2, O2) liefert und die physio-chemischen Umgebungsbedingungen (pH-Puffer, osmotischer Druck, Temperatur) reguliert. Die meisten Zellen benötigen eine Oberfläche oder ein künstlichens Substrat, während andere Zellkulturen frei schwebend in einem Kulturmedium kultiviert werden können (Suspensionskultur, Zellsuspension).
Die Massenkultivierung von tierischen Zellklinien wird in der industriellen Produktion eingesetzt, um virale Impfstoffe und andere biotechnologische Produkte herzustellen. Menschliche Stammzellen werden beispielsweise gezüchtet, um die Anzahl der Zellen zu steigern sowie um die Zellen in verschiedene somatische Zelltypen für Transplantationszwecke zu differenzieren.

Gewebeproben

Der Begriff "Gewebe" beschreibt ein zelluläres Zwischenprodukt, bei dem sich das das Zellmaterial auf einer Stufe zwischen Zelle und komplettem Organ befindet. In einem Gewebe befinden sich ähnliche Zellen denselben Ursprungs, die zusammen eine bestimmte Funktion ausführen. Durch die funktionale Gruppierung von mehreren Gewebarten bilden sich die komplexen Strukturen der Organe.
Gewebeproben werden für Forschungszwecke in der Histologie/Histopathologie, Parasitologie, Biochemie, Biologie und Immunohistochemistry entnommen, aber auch um DNA zu züchten und zu extrahieren. Es wird zwischen tierischem und pflanzlichem Gewebe unterschieden. Tierisches Gewebe untergliedert sich in die vier Grundtypen des Binde-, Muskel-, Nerven- und Epithelgewebes. Pflanzengewebe gliedert sich in folgende Gewebearten: das Bildungsgewebe, Parenchym, Leitgewebe, Festigungsgewebe und die Epidermis.
Gewebeproben können aus tierischen oder pflanzlichen Bestandteilen, z.B. Knochen, Muskeln, Blättern etc. bestehen.

Körperflüssigkeiten

Blut, Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis, Speichel und Gelenkflüssigkeit sind Körperflüssigkeiten, welche eine wichtige Quelle für diagnostisch relevante Informationen bieten. Daher ist eine zuverlässige Vorbereitung der Körperflüssigkeitsproben für die Analyse äußerst wichtig. Eine Schwierigkeit resultiert aus dem breiten dynamischen Bereich der Komponenten, welche in Körperflüssigkeiten vorhanden sind.

Bestimmung der Proteinkonzentration

Bradford-Test, Lowry-Test und das Bicinchoninsäure (BCA)-Assay sind gewöhnlich verwendete Assays, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Rinderserumalbumin (BSA) gehört zu den am häufigsten verwendete Proteinstandards.

Lyse-Puffer

Lysepuffer muss unter Berücksichtigung des Zellmaterials oder Gewebes (Gewebekultur, Pflanzen, Bakterien, Pilze, etc.) gewählt werden. Zudem muss berücksichtigt werden, ob sich die Zelle in einem strukturellen Gewebe befindet und um welche Art von Gewebe es sich dabei handelt. Zahlreiche Lysepuffer, die für die Extraktion von Proteinen, Membranen und Organellen verwendet werden, sind mit einem oder mehreren Detergentien formuliert. Das Detergens muss in der Regel durch Ausprobieren (trial-and-error) oder – wenn vorhanden – entsprechend einem vorhandenen Proteinextraktions-Protokoll gewählt werden. Das Detergens muss sowohl mit dem Gewebe als auch mit den Proteinen kompatibel sein. In der Regel wird das mildeste Detergens, welches für eine spezifisches Gewebe bzw. Protein funktioniert, gewählt, um die maximale Funktionalität des Extraktes sicherzustellen. Außerdem hält ein mildes Detergens bei der Membran- und Organellextraktion die Zellmembran intakt. Zu den häufig verwendeten Detergentien in Lysepuffern zählen nicht-ionische oder zwitter-ionische Detergenzien, z.B. CHAPS, Deoxycholate, Triton™ x-100, NP40 und Tween 20.
Gewebeproben wie z.B. Gehirn, Leber, Darm, Nieren, Milz etc. können beispielsweise einfach mit RIPA gepuffert werden – wobei allerdings Protease-Inhibitoren und DTT (z.B. für die Gelelektrophorese) enthalten sein sollten.
Lysepuffer für Skelettmuskelgewebe (eiskalt): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol. Der Puffer wird zusätzlich mit einem Protease- und Phosphatase- Inhibitor Cocktail versetzt.
Tabelle häufig verwendeter Puffer und ihrer pH-Bereiche. Im Allgemeinen werden diese Puffer in Konzentrationen von 20-50 mM verwendet.

Puffer pH-Bereich
Zitronensäure – NaOH 2,2 – 6,5
Natriumcitrat – Zitronensäure 3,0 – 6,2
Natriumacetat – Essigsäure 3,6 – 5,6
Cacodylsäure Natriumsalz – HCl 5,0 – 7,4
MES – NaOH 5,6 – 6,8
Dihydrogen-Natriumphosphat – Dinatriumhydrogenphosphat 5,8 – 8,0
Imidazol – HCl 6,2 – 7,8
MOPS – KOH 6,6 – 7,8
Triethanolamin Hydrochlorid – NaOH 6,8 – 8,8
Tris – HCl 7,0 – 9,0
HEPES – NaOH 7,2 – 8,2
Tricine – NaOH 7,6 – 8,6
Natriumtetraborat – Borsäure 7,6 – 9,2
Bicine – NaOH 7,7 – 8,9
Glycin – NaOH 8,6 – 10,6

Die meisten Puffer weisen eine pH-Abhängigkeit bezüglich der Temperatur auf. Dies gilt insbesondere für Tris-Puffer. So ändert sich der pKa-Wert beispielsweise von 8,06 bei 25°C auf 8,85 bei 0°C.
(pH-Wert und pKa eines Puffers: Der pH misst die Konzentration von Wasserstoffionen in einer wäßrigen Lösung. pKa (= Säure-Dissoziationskonstante) ist ein verwandter, allerdings genauerer Messwert, der vorhersagt, wie sich ein Molekül bei einem bestimmten pH-Wert verhalten wird.)

TRIzol

TRIzol ist eine chemische Lösung zum Extrahieren von RNA/DNA/Protein, welche bei der Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion verwendet wird. Durch die ultraschall-gestützte TRIzol-Extraktion lassen sich hohe Erträge von DNA, RNA und Proteinen aus der gleichen Probe gewinnen. Dadurch übertrifft die ultraschall-gestützte TRIzol-Extraktion andere Extraktionsmethoden deutlich an Effizienz.