Hielscher – Ultraschall-Technologie

Ultraschall-Lyse für das Western Blotting

  • Der Western Blot ist ein Analyseverfahren zum Nachweis spezifischer Proteine in Gewebe- oder Zellproben.
  • Um ein Western Blot oder ein Enzym-Assay durchzuführen, ist es oftmals notwendig, die Zellen aufzuschließen, damit das intrazelluläre Material (z.B. Proteine, DNA, subzellulare Fragmente) verfügbar wird.
  • Ultraschall ist eine zuverlässige und einfach zu handhabende Methode für den kontrollierten Zellaufschluss sowie die Extraktion.

Ultraschall-gestützter Zellaufschluss

Die Protein-Extraktion aus Gewebe und Zellkulturen ist ein wichtiger vorbereitender Schritt für viele biologische, biochemische und analytische Techniken (z.B. PAGE, Western Blotting, ELISA, Massenspektrometrie, etc.) oder die Proteinaufreinigung. Um einen hohen Protein-Ausbeute zu erhalten, müssen die Zellen und das Gewebe effizient aufgeschlossen bzw. lysiert werden. Egal ob Pflanzenzellen oder tierisches Gewebe - Ultraschall ist die ideale Methode, um Zelllysate einfach und schnell herzustellen.

Vorteile der Ultraschalllyse

  • schnell & effizient
  • einfache Bedienung
  • hohe Protein-Ausbeute
  • reproduzierbar
  • präzise kontrollierbar
  • skalierbar

Immunopräzipitations-Protokoll für das Western Immunoblotting

A. Reagenzien

Verwenden Sie für die Vorbereitung der Lösungen gereinigtes Wasser, z.B. Milli-Q.

  • 1 X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
  • 1 x Zelllyse-Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2.5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glyzerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    Wichtig: Geben Sie 1 mM PMSF erst unmittelbar vor der Anwendung hinzu.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G reichen für eine IP aus, allerdings ist die Menge von den verwendeten Primärantikörpern und dem Probenvolumen abhängig. Sie können auch vorgemischte Protein A / G Agarose verwenden (z.B. Protein A für das Kaninchen-IgG und Protein G für das Mäuse-IgG)
  • 3 x SDS-Probenpuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6.8 bei 25°C), 6 % w/V SDS, 30 % Glycerin, 150 mM DTT, 0,03 % w/V Bromphenolblau
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter für die Ultraschall-Probenvorbereitung

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Ultraschall-Behandlung ist ein wichtiger Schritt bei der Probenvorbereitung

UP200St mit Mikro-Spitze für die Probenvorbereitung

B. Vorbereitung der Zelllysate

  • Entnehmen Sie die Zellen. Um die Zellen bei der Ernte nicht zu denaturieren, entfernen Sie das Medium und waschen Sie Zellen mit eiskaltem PBS.
  • Gießen Sie das PBS ab, fügen Sie 0,5 ml eiskaltes 1X Lysepuffer auf jede Schale (10 cm) hinzu und inkubieren Sie die Schalen für 5 Minuten auf Eis.
  • Schaben Sie die Zellen von den Schalen ab und übertragen Sie diese in Mikrozentrifugenröhrchen. Kühlen Sie diese weiterhin auf Eis.
  • Beschallen Sie die Proben zweimal für jeweils 10 Sek. in eiskaltem Immunopräzipitation-Buffer (IP-Puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 % NP-40 und dem Protease-Inhibitor-Mix). Für die Ultraschall-gestützte Probenvorbereitung eignen sich der VialTweeter oder Ultraschallgeräte mit einer Mikrospitze wie z.B. der UP100H oder UP200Ht besonders gut.
  • Zentrifugieren Sie die Lysates bei 15.000g für 10 Min. bei 4°C.
  • Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. (Falls nötig, können Sie die Lysate bei –80°C lagern.)
  • Fügen Sie dem Überstand die Primärantikörper hinzu. Inkubieren Sie den Überstand mit den Primärantikörpern für 1 Std. bei 4°C unter leichtem Rühren. Die Primärantikörper werden normalerweise in 10-mal konzentrierterer Dosis als beim Western Blot hinzugefügt. (Anfangs können Sie mit 1μg pro 100μL beginnen).
  • Der Überstand wird dann mit einer Mischung aus jeweils der gleichen Mengen Protein-A-Agarose (Invitrogen) und Protein-G-Agarose für eine weitere 1 Std. inkubiert / bebrütet.
  • Waschen Sie die Agarose-Pellets dreimal mit dem IP-Puffer. Extrahieren Sie danach die gebundenen Proteine mit dem SDS-PAGE-Puffer durch das Erhitzen auf 95°C für 5 Min.

C. Immunopräzipitation

  • Nehmen Sie 200μl Lysat und fügen Sie die Primärantikörper hinzu. Inkubieren Sie das Lysat auf einem Wippschüttler bei 4°C über Nacht.
  • Fügen Sie entweder Protein A oder G-Agarose (20μl der 50%igen Mixtur). Unter leichtem Schaukeln für 1–3 Stunden bei 4°C inkubieren.
  • Zentrifugieren Sie die Probe für 30 Sekunden bei 4°C in einer Mikrozentrifruge. Waschen Sie Pellets fünfmal mit 500 µl 1X Lysepuffer. Kühlen Sie die Probe auch während des Waschens auf Eis.
  • Resuspendieren Sie das Pellet mit 20μl 3X SDS-Puffer. Vortexmischen Sie die Probe und mikrozentrifugieren Sie diese anschließend für 30 Sekunden.
  • Erhitzen Sie die Probe 2–5 Minuten auf 95–100°C und mikrocentrifugieren sie diese für 1 Minute bei 14.000 X g.
  • Geben Sie die Probe (15–30μl) auf SDS-PAGE Gel (12-15%).
  • Analysieren Sie die Probe mittels Western Blot.

Kontakt/ Weitere Informationen

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Weitere Ultraschall-Protokolle

Western Blot-Analyse mit dem Ultraschallgerät UP50H

Das folgende Protokoll wurde in der Studie von Kriebisch et al. (2011) eingesetzt:
Der gesamte Proteingehalt wurde aus MC3T3-E1-Zellen isoliert, die mit 1,25(OH)2D3 (10−8 M) oder Vehikel behandelt wurden. Die Zellen wurden mit einem Puffer bestehend aus 50mM Tris-HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) und 0,5% Natriumdeoxycholat (Merck) lysiert. Das Zelllysat wurde für 2 × 10s bei einer Amplitudeneinstellung von 80% mit dem UP50H Ultraschallprozessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Deutschland) beschallt. Danach wurde das Material für 10 min bei 14.000 u/min zentrifugiert; der Überstand wurde für den Western Blot verwendet. 25μg des Proteins wurden in Pufferlösung und Reduktionsmittel (Invitrogen) gekocht und anschließend durch SDS-PAGE mithilfe von 4–12 % Polyacrylamidgel (Invitrogen) abgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran (GE health care) übertragen. Die Membran wurde für 1 h mit TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 150 mM NaCl) mit 1% Casein (Sigma-Aldrich) und 1% Tris (1 M) blockiert. Nach der Verblockung wurde die Membran unter leichtem Rühren über Nacht bei 4°C mit dem Primärantikörper (Anti-Human-Antikörper vom Kaninchen CBS 1/500, entwickelt im Labor Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, Michigan, USA) inkubiert. Die Inkubation mit einer Meerrettichperoxidase (HPR)-konjugierten Sekundärantikörper (Dako) wurde für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle Blots wurden mittels Chemiluminescence (Perkin Elmer) entwickelt.

Literatur



Über das Western Blotting

Blots sind Analyseverfahren, mit denen DNA, RNA und Proteine auf ein Substrat übertragen werden, so dass sie separiert werden können.
Der Southern Blot dient zum Nachweis von DNA, der Northern Blot für RNA und der Western Blot für Proteine.
Das Western Blotting wird auch Protein-Immunoblotting bezeichnet, da ein Antikörper verwendet wird, um das dazugehörige Antigen zu finden. Das Western Blotting gehört zu den wichtigsten Analyseverfahren, um spezifische Proteine in Proben zu nachzuweisen. Beim Western Blot werden die Proteine auf einer Membran immobilisiert, um sie dann mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern nachzuweisen.
Durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) werden native Proteine anhand ihrer 3D-Struktur getrennt; denaturierte Proteine können anhand der Polypeptidlänge separiert werden. Die Proteine werden dann auf eine Membran (meist Nitrozellulose oder PVDF), übertragen, wo sie mit Antikörpern angefärbt werden, um das Zielprotein nachzuweisen. Die Gel-Elektrophorese gehört zur Western Blot-Analyse, um die Problematik der Kreuzreaktivität der Antikörper zu bewältigen.
Danach werden die abgetrennten Proteine auf eine Matrix (meist auf Nitrozellulose oder PVDF-Membran) geblottet, wo sie mit Antikörpern angefärbt werden. Die Antikörper fungieren als Sonde und werden speziell auf das Zielprotein abgestimmt und ausgewählt. Die Analyse der Position und die Intensität der spezifischen Reaktion gibt Aufschluss über die Expression der Zielproteine. Mittels Western Blot können aufgrund der hohen Auflösung bei der Gelelektrophorese sowie aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Immunoassays auch Zielproteine nachgewiesen werden, welche in sehr geringen Mengen von 1ng vorhanden sind. Die Western Blot-Methode wird in Molekularbiologie, Biochemie, Immungenetik und anderen Bereichen der Molekularforschung verwendet.
Andere verwandte Techniken sind die Dot Blot-Analyse, die Immunhistochemie und Immunzytochemie, bei denen Antikörper verwendet werden, um Proteine in Gewebe und Zellen nachzuweisen, sowie der Enzymimmunoassay (ELISA).