Ultraschalllyse für das Western Blotting

• Der Western Blot ist ein analytisches Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine in einer Probe aus Gewebehomogenat oder Zellextrakt.
• Zur Durchführung eines Western Blots oder zur Messung der Enzymaktivität erfordern viele Assays den Zugang zu den in der Zelle eingeschlossenen Materialien (z. B. Proteine, DNA, subzelluläre Fragmente).
• Die Beschallung ist eine zuverlässige und einfach anzuwendende Methode für den kontrollierten Zellaufschluss und die Zelllyse.

Zellaufschluss mittels Ultraschall

Die Proteinextraktion aus Geweben und kultivierten Zellen ist der erste Schritt vieler biologischer, biochemischer und analytischer Verfahren (PAGE, Western Blotting, ELISA, Massenspektrometrie usw.) oder der Proteinreinigung. Um eine hohe Proteinausbeute zu erzielen, müssen Zellmaterial und Gewebe effizient aufgeschlossen bzw. lysiert werden. Ob Pflanzenzelle oder tierisches Gewebe – mit der Beschallung bereiten Sie Ihr Zelllysat einfach und schnell vor.

Vorteile der Beschallung

• schnell und effizient
• einfache Bedienung
• hohe Proteinausbeute
• reproduzierbar / wiederholbar
• präzise kontrolliert
• skalierbar

Immunpräzipitationsprotokoll für das Western Immunoblotting

A. Reagenzien

Verwenden Sie zur Herstellung der Lösungen gereinigtes Wasser, beispielsweise Milli-Q-Wasser.

• 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
• 1X Zelllysepuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Wichtig: Fügen Sie unmittelbar vor der Verwendung 1 mM PMSF hinzu.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G reichen für die IP aus; dies kann jedoch von Ihrem Primärantikörper und dem Probenvolumen abhängen. Sie können auch vorgemischte Protein-A/G-Agarose verwenden (z. B. Protein A für den Pulldown von Kaninchen-IgG und Protein G für den Pulldown von Maus-IgG).
• 3X SDS-Probenpuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bei 25°C), 6% w/v SDS, 30% Glycerin, 150 mM DTT, 0,03% w/v Bromphenolblau

B. Herstellung von Zelllysaten

• Ernten Sie die Zellen. Um die Zellen unter nicht denaturierenden Bedingungen zu ernten, entfernen Sie die Medien und spülen Sie die Zellen einmal mit eiskaltem PBS.
• Entfernen Sie das PBS, geben Sie auf jede Platte (10 cm) 0,5 ml eiskalten 1X Zelllysepuffer und inkubieren Sie die Platten 5 Minuten auf Eis.
• Schaben Sie die Zellen von den Platten ab und überführen Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Proben auf Eis.
• Beschallen Sie zweimal für jeweils 10 Sekunden in eiskaltem Immunpräzipitationspuffer (IP-Puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 und die Proteaseinhibitormischung). Für die Beschallung eignen sich der VialTweeter oder ein Ultraschallgerät mit Sonotrode wie der UP100H oder der UP200Ht am besten.
• Zentrifugieren Sie die Lysate bei 15.000 g für 10 Minuten bei 4°C.
• Überführen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. (Bei Bedarf kann das Lysat bei –80°C gelagert werden.)
• Geben Sie den Primärantikörper zum Überstand. Inkubieren Sie den Überstand mit dem Primärantikörper für 1 h bei 4°C unter leichtem Schütteln. Der Primärantikörper wird üblicherweise in einer 10x höheren Konzentration als beim Western Blotting zugegeben. (Sie können mit 1μg pro 100μL beginnen.)
• Inkubieren Sie den Überstand anschließend für weitere 1 h mit einer Mischung aus gleichen Mengen Protein-A-Agarose (Invitrogen) und Protein-G-Agarose.
• Waschen Sie die Agarosepellets dreimal mit IP-Puffer. Extrahieren Sie anschließend die gebundenen Proteine mit dem SDS-PAGE-Ladepuffer durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten.

C. Immunpräzipitation

• Nehmen Sie 200 μl Zelllysat und geben Sie den Primärantikörper hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 4°C unter sanftem Schwenken.
• Geben Sie entweder Protein-A- oder Protein-G-Agarosekügelchen hinzu (20 μl einer 50%igen Kügelchensuspension). Inkubieren Sie für 1–3 Stunden bei 4°C unter sanftem Schwenken.
• Zentrifugieren Sie für 30 Sekunden bei 4°C in einer Mikrozentrifuge. Waschen Sie das Pellet fünfmal mit 500 µl 1X Zelllysepuffer. Halten Sie die Proben während der Waschschritte auf Eis.
• Resuspendieren Sie das Pellet mit 20 μl 3X SDS-Probenpuffer. Mischen Sie auf dem Vortexmischer und zentrifugieren Sie anschließend für 30 Sekunden in einer Mikrozentrifuge.
• Erhitzen Sie die Probe für 2–5 Minuten auf 95–100°C und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei 14.000 X g in einer Mikrozentrifuge.
• Tragen Sie die Probe (15–30 μl) auf ein SDS-PAGE-Gel (12–15%) auf.
• Analysieren Sie die Probe mittels Western Blotting.

Western-Blot-Analyse mit dem Ultraschallgerät UP50H

Das folgende Protokoll mit dem Sonotroden-Ultraschallgerät UP50H wurde in der Studie von Kriebisch et al. (2011) verwendet:
Gesamtprotein wurde aus MC3T3-E1-Zellen isoliert, die mit 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) oder dem Vehikel behandelt worden waren. Die Zellen wurden mit einem Puffer lysiert, der 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich), 150 mM NaCl (Fisher Scientific), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific), 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) und 0,5% Natriumdesoxycholat (Merck) enthielt. Das Zelllysat wurde für 2 × 10 s bei Zyklus 1 und Amplitude 80 mit dem UP50H-Ultraschallprozessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Deutschland) beschallt. Anschließend wurde das Material für 10 min bei 14.000 rpm zentrifugiert und der Überstand für das Western Blotting verwendet. Fünfundzwanzig μg Protein wurden in Probenpuffer und Reduktionsmittel (Invitrogen) aufgekocht, anschließend mittels SDS-PAGE auf 4–12%igen Polyacrylamidgelen (Invitrogen) getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (GE health care) übertragen. Die Membran wurde für 1 h mit TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) blockiert, das 1% Casein (Sigma-Aldrich) und 1% Tris (1 M) enthielt. Nach dem Blockieren wurde die Membran über Nacht bei 4°C unter leichtem Schütteln mit dem Primärantikörper inkubiert (Kaninchen-Antikörper gegen humanes CBS, 1/500, entwickelt im Labor von Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Die Inkubation mit einem an Meerrettichperoxidase (HPR) konjugierten Sekundärantikörper (Dako) erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur. Alle Blots wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz (Perkin Elmer) entwickelt.
 

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Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte im Labormaßstab:

Literatur / Quellen

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.