Ultraschallgestützte Vorbereitung von C. elegans-Proben

C. elegans, ein Fadenwurm, ist ein in der Biologie weit verbreiteter Modellorganismus. Die Probenvorbereitung vor der Analyse erfordert Lyse, Protein- und Lipidextraktion sowie RNA-Fragmentierung, die sich zuverlässig mittels Ultraschall durchführen lassen. Ultraschall-Zellaufschlussgeräte sind zuverlässige, ausgereifte und einfach zu bedienende Geräte für die schnelle Vorbereitung von C. elegans-Proben.

Ultraschallgestützte Vorbereitung von C. elegans-Proben

Caenorhabditis elegans sind Fadenwürmer, die in Forschungslaboren häufig für Untersuchungen in der Genomik, Entwicklungsbiologie und Krankheitsforschung eingesetzt werden. Viele Gene im Genom von C. elegans haben funktionelle Entsprechungen beim Menschen. Dadurch ist der Fadenwurm ein äußerst nützliches Modell für menschliche Erkrankungen. Weitere Vorteile für den breiten Einsatz von C. elegans sind die einfache und kostengünstige Kultivierung auf bakterienhaltigen Platten (z.B. E. coli), seine Transparenz, die einfache Handhabung sowie die Möglichkeit, die Würmer einzufrieren und über längere Zeit zu lagern.
Protein- und Lipidanalysen gehören zu den Routineverfahren in Laboren, und die ultraschallgestützte Probenvorbereitung ist eine etablierte Methode zur Lyse von C. elegans-Nematoden in jedem Entwicklungsstadium (d. h. Embryonen, Larven L1–L4, adulte Tiere). Da C. elegans auch als Proteinexpressionssystem zur Überexpression bestimmter Zielproteine eingesetzt wird, ist eine zuverlässige, reproduzierbare Methode zur Lyse und Proteinextraktion erforderlich, die hohe Proteinausbeuten liefert. Ultraschallsysteme für den Zellaufschluss und die Extraktion sind als Homogenisatoren mit Sonotrode und als Mehrproben-Ultraschallgeräte erhältlich. Für eine komfortable Probenvorbereitung bei unterschiedlichsten Probengrößen und Probenzahlen bietet Hielscher Ultrasonics das ideale Ultraschall-Zellaufschlussgerät für Ihr Laborverfahren.

Ultraschallprotokolle für den Aufschluss und die Lyse von C. elegans

Die Ultraschallhomogenisierung und -lyse von C. elegans sowie die anschließende Protein- und Lipidextraktion lassen sich nach verschiedenen Verfahren mit unterschiedlichen Homogenisierungs- und Lysepuffern usw. durchführen. Allen Lyseprotokollen ist gemeinsam, dass die Proben durchgehend auf Eis gehalten werden müssen, um den Abbau von Proteinen zu verhindern. Im Folgenden stellen wir Ihnen einige zuverlässige und schnelle Ultraschallprotokolle für die Lyse und Extraktion zur Herstellung hochwertiger protein- oder lipidhaltiger C. elegans-Proben vor.

Vorteile der Ultraschalllyse von C. elegans

• zuverlässig
• reproduzierbar
• präzise temperaturgeregelt
• zuverlässige Prozesskontrolle
• schonende Methode
• einfach anzuwenden
• sicher

Ultraschallgestützte Proteinextraktion aus C. elegans-Proben

Die Ultraschalllyse und Proteinextraktion aus C. elegans-Würmern können nach verschiedenen Protokollen durchgeführt werden. Im Folgenden stellen wir Ihnen einige zuverlässige und schnelle Lyseprotokolle für reproduzierbare Ergebnisse bei der Proteinextraktion vor.

Schnelle Herstellung eines zytosolischen Extrakts aus C. elegans-Würmern durch Beschallung

Mit dem folgenden Protokoll können Sie C. elegans-Lysate in weniger als 30 Minuten herstellen.
Sammeln von C. elegans
Überführen Sie die gewünschten C. elegans-Würmer in ein 1,5ml-Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder waschen Sie sie mit 1,5ml PBS von einer Platte ab. Zentrifugieren Sie zur Pelletierung für 1min bei 2000rpm. Halten Sie die Proben durchgehend auf Eis.
Waschen Sie die Würmer anschließend zweimal mit PBS.
Waschen Sie die Würmer danach zweimal mit ddH₂O.
Resuspendieren Sie die Würmer in mindestens 500ul Homogenisierungspuffer (HB). Die Wurmproben sind nun für die Ultraschalllyse bereit.
Für eine höhere Qualität der Proteinextrakte können Sie die bakterielle Kontamination verringern, indem Sie die Würmer jeweils 5min in PBS und sterilem Reinstwasser (ddH₂O) waschen oder eine Saccharoseflotation durchführen. Halten Sie die Wurmproben durchgehend auf Eis.

Protokoll zur Ultraschalllyse von C. elegans

• Bereiten Sie das Ultraschallgerät im Voraus vor, damit der Ultraschallhomogenisator einsatzbereit ist (Sonotrode montiert, Beschallungsprogramm voreingestellt). 

Wenn Ihr Ultraschallgerät an einem Stativ montiert ist, stellen Sie das Eisbad mit Ihren Probenröhrchen unter die Sonotrode und führen Sie die Sonotrode in das 1,5ml-Röhrchen ein.

• Für die Lyse von C. elegans mit dem UP200St oder UP200Ht sollte die Ultraschallbehandlung mit einer Mikrospitze (z.B. 2mm-Sonotrode S26d2; siehe Abbildung links) bei 40% Amplitude für 1sec mit dazwischenliegenden Pausen von 30sec erfolgen. 5 Beschallungszyklen von jeweils 1 Sekunde mit Pausen von 30sec sind ideal für die Lyse von C. elegans. Wenn Sie die Lyse zum ersten Mal durchführen, können Sie den Fortschritt der Lyse nach jedem Impuls anhand kleiner Probenaliquote unter dem Mikroskop überprüfen.
• Die Lyse ist erfolgreich abgeschlossen, wenn die Würmer aufgeschlossen sind. Eine übermäßige Beschallung führt zum Aufbrechen der Zellkerne und wird daran erkennbar, dass die Probe viskos wird oder schäumt. Verwenden Sie bei Bedarf mehr Impulse, um eine Schädigung der Probe zu vermeiden. Verlängern Sie die Dauer der einzelnen Ultraschallimpulszyklen nicht, um hochwertige Proteinextrakte zu erhalten.
• Klären Sie das Zelllysat, indem Sie die durch Ultraschall lysierten Würmer bei 14.000rpm für 10min bei 4ºC zentrifugieren.
• Überführen Sie den Überstand anschließend in ein frisches Röhrchen und bereiten Sie ihn für die Immunpräzipitation oder andere Assays vor.

Hinweis zum Homogenisierungspuffer: Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer für das obige Ultraschalllyseprotokoll wie folgt vor:

Hochdurchsatz-Lyse von C. elegans in 96-Well-Platten mit dem Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Lyse von C. elegans (adulte Nematoden)
UIP400MTP 80% Amplitude, 20 Zyklen (je Beschallungszyklus: 30 sec EIN, 30 sec AUS)
Lysepuffer:

• Option 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Option 2) für die Co-Immunpräzipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete-Proteinaseinhibitor-Cocktail)

Hochdurchsatz-DNA-Fragmentierung
C. elegans (adulte Nematoden), DNA 200–300bp: Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP – 80% Amplitude einstellen, 30 Impulse – jeweils 30sec ein, 30sec aus

Das Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP für die Probenvorbereitung im Hochdurchsatz beschallt Proben in Multiwell-, Mikrotiter- und 96-Well-Platten gleichmäßig

Ultraschalllyse von C. elegans für quantitative Affinitätsreinigungsassays

C. elegans-Embryonen (∼2 Millionen pro Replikat) wurden in drei biologischen Replikaten durch Bleichbehandlung junger gravider Hermaphroditen frisch gewonnen und auf Eis beschallt (Zyklus: 0,5 s, Amplitude: 40–45%, 5 Impulse/Durchgang, 5 Durchgänge, Intervall zwischen den Durchgängen: 30 s; Ultraschallprozessor UP200S mit Mikrospitze S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in Lysepuffer (Gesamtvolumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% Glycerin, Proteaseinhibitormischung, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Nach der Beschallung wurde Nonidet P-40 Substitute bis zu einer Konzentration von 1% zugegeben, und die Lysate wurden bei 4°C für 30 min unter Überkopfrotation inkubiert und anschließend bei 20.000 × g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Das geklärte Lysat wurde danach abgesaugt, ohne die obere Lipidschicht zu stören, und je zur Hälfte zu den Anti-GFP-Agarose-Beads bzw. den blockierten Kontroll-Beads (40–50 μl) gegeben. Nach Überkopfrotation bei 4°C für 60–90 min wurden die Beads einmal mit Lysepuffer mit 0,1% Nonidet P-40 Substitute gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten entweder in Puffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder Puffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder beiden. Für GFP:MBK-2-Pull-downs wurden zwei separate Experimente mit unterschiedlichen Waschbedingungen durchgeführt. Die Proteine wurden durch orbitales Schütteln in 50 μl einer Lösung aus 6 m Harnstoff/2 M Thioharnstoff bei Raumtemperatur eluiert. Für die MBK-1::GFP-Pull-down-Experimente wurden die Proteine zweimal durch Schütteln in 50μl einer 8 m Guanidiniumchloridlösung bei 90°C eluiert und anschließend mit Ethanol gefällt. Die eluierten Proteinproben wurden danach in Lösung verdaut.
(vgl. Chen et al., 2016)

Ultraschallhomogenisierung und -lyse von Würmern

Für die Lyse und Proteinextraktion aus C. elegans wurden pro Probe 30.000 Nematoden des jeweiligen Stadiums gesammelt, in eiskaltem S-Basal-Medium gewaschen, durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 2 min konzentriert, sechsmal mit eiskaltem S-Basal-Medium gewaschen, um verbliebene Bakterien zu entfernen, und anschließend bis zur Verwendung auf Eis gelagert. Für die Proteinextraktion ließ man die graviden adulten Würmer nach dem letzten Waschschritt mit S-Basal-Medium ein kompaktes Pellet bilden. Die Wurmpellets wurden anschließend in 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer [20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, Proteaseinhibitoren (Sigma P2714)] resuspendiert und sofort weiterverarbeitet.
∼30.000 gravide adulte Würmer (entsprechend ∼100 mg Nassgewicht) wurden auf Eis mit einem Ultraschallgerät mit Sonotrode (z.B. UP50H mit Mikrospitze MS2) bei 40% Amplitude über 10 Zyklen mit jeweils 3 sec ein und 30 sec aus in 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer beschallt. (vgl. Baskharan et al. 2012)

Ultraschallgestützte Lipidextraktion aus C. elegans

In der Lipidomik, einem Teilgebiet der Metabolomik, wird die Gesamtheit der Lipide biologischer Systeme charakterisiert und analysiert. C. elegans wird in der Lipidomik häufig eingesetzt, um die Wechselwirkungen von Lipiden im Stoffwechsel und ihre Auswirkungen auf Gesundheit und Lebensdauer zu untersuchen.
Ultraschalllyse und -extraktion werden eingesetzt, um Lipide wie Sphingolipide aus C. elegans-Embryonen, -Larven und adulten Würmern freizusetzen. Die Ultraschallbehandlung dient zur Herstellung von Wurmhomogenaten und zur anschließenden Extraktion der Lipide aus der Probe.
Protokoll zur ultraschallgestützten Lipidextraktion aus C. elegans
Tauen Sie das C. elegans-Pellet auf Eis auf und resuspendieren Sie es mit 0,5 ml Ultrawasser. Beschallen Sie die C. elegans-Proben in 1,5mL-Probenröhrchen und halten Sie die Proben dabei durchgehend auf Eis.
Für die Beschallung eignen sich ein Ultraschallgerät mit Sonotrode wie das UP200Ht, die Ultraschall-Probenvorbereitungseinheit VialTweeter (gleichzeitige Beschallung von 10 Proben) oder das UIP400MTP (zur Beschallung von Multiwell-Platten wie 96-Well-Platten). Verwenden Sie für die Ultraschalllyse mit dem UP200Ht die Mikrospitze S26d2. Stellen Sie den Ultraschall-Zyklusmodus im digitalen Menü vorab ein. Stellen Sie die Amplitude auf 10% und den Beschallungszyklusmodus auf Impulse von 2 sec über 20 Zyklen mit jeweils einer Pause von 30 sec zwischen den Ultraschallimpulsen ein.
Überführen Sie die Überstände in Glasröhrchen mit Schraubverschluss. Führen Sie eine Folch-Extraktion durch, indem Sie in jedes Glasröhrchen 1 ml Ultrawasser und anschließend 6 ml eines Chloroform/Methanol-Gemischs (Verhältnis = 2:1) geben.
Vortexen Sie jedes Glasröhrchen für jeweils 30 sec insgesamt 4-mal. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.258 x g für 15 min (Eppendorf, 5810 R), um die Phasentrennung weiter zu verbessern. Überführen Sie die untere hydrophobe Fraktion mit einer Pasteurpipette aus Glas in ein sauberes Glasröhrchen. Trocknen Sie die untere hydrophobe Fraktion unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer. Lagern Sie das getrocknete Pellet bis zur Verwendung in einem Gefrierschrank bei -80 °C. 


Ultraschallgestützte Herstellung von Wurmlysaten

Wurmlysat: Würmer im L4-Stadium wurden geerntet und dreimal mit M9-Puffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl und 0,87 mM MgSO₄) gewaschen, um alle Bakterien zu entfernen. Nachdem möglichst viel M9-Puffer entfernt worden war, wurden die Würmer in Lysepuffer resuspendiert: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-Glycerophosphat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid und Proteaseinhibitor. Die Würmer wurden dreimal in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 37°C aufgetaut. Anschließend wurden sie auf Trockeneis mit einer Ultraschalleinheit VialTweeter zur gleichzeitigen Vorbereitung von 10 Probenröhrchen beschallt. Die Beschallung erfolgte bei 50% Amplitude in 10 Zyklen von jeweils 2 sec mit einer Pause von 30 sec zwischen den Beschallungsimpulsen. Danach wurden die Proben bei 12.000 rpm und 4°C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei -70°C gelagert. Ein Aliquot wurde zur Proteinquantifizierung mittels Bradford-Assay verwendet.
Bestimmung von Gesamtglutathion, GSH und GSSG: Für die Glutathionquantifizierung wurden die Lysate am selben Tag hergestellt, an dem die Bestimmung erfolgte. Mit Glucose gefütterte L4-Larven und Kontrolllarven wurden geerntet und dreimal mit M9-Puffer gewaschen. Nachdem möglichst viel M9-Puffer entfernt worden war, wurden die Würmer in eiskalter Metaphosphorsäure (5% w/v) resuspendiert. Anschließend wurden sie in Eis mit einem Ultraschallgerät VialTweeter bei 50% Amplitude in zehn Beschallungszyklen von jeweils 2 sec mit einer Pause von 30 sec zwischen den Zyklen beschallt. Danach wurden sie bei 12.000 rpm und 4 ̊C für 15 min zentrifugiert.
(vgl. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Vorbereitung von C. elegans-Proben vor Immunpräzipitation und Western Blotting

Kurz zusammengefasst wurden für embryonale Extrakte C. elegans-L1-Larven in großvolumigen Flüssigkulturen mit S-Medium bis zum Adultstadium kultiviert. Embryonen wurden mit der Standard-Bleichmethode gewonnen und in Lysepuffer suspendiert (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% Glycerin, 0,05% NP-40, 1􏰅 Proteaseinhibitor-Cocktail und 1􏰅 Phosphataseinhibitor-Cocktail I und II), rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren und durch Ultraschall-Zellaufschluss lysiert. Hierzu wurde ein Ultraschallgerät mit Mikrospitze wie das UP200Ht mit S26d2 für 10 Impulse über 10 s bei 30% Amplitude eingesetzt. Wenn eine größere Anzahl von Proben vorbereitet werden muss, werden das Ultraschallgerät VialTweeter oder das Mehrproben-Ultraschallgerät UIP400MTP für Well-Platten empfohlen. Nach der Beschallung wurden die Extrakte durch Zentrifugation bei 30.000g für 20 min bei 4°C vorgeklärt. Der vorgeklärte Extrakt (300µg Gesamtprotein) wurde mit 40µ􏰂g affinitätsgereinigtem Anti-CDC-25.1-Antikörper (diese Studie), der an Protein-A-Agarose quervernetzt war, inkubiert. Als Kontrolle wurde eine vergleichbare Menge an Kaninchen-Immunglobulin (Ig)G verwendet, das an Protein-A-Agarose quervernetzt war. Die Inkubation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 200µl Lysepuffer mit 1% NP-40, dessen Zugabe die unspezifische Bindung von Proteinen an die Matrix verringerte. Die Proben wurden für 1 h bei 4°C rotiert, die Beads dreimal mit Lysepuffer gewaschen und mit 30µl Glycin/HCl und 200 mM NaCl, pH 2,2, eluiert. Nach der Immunpräzipitation wurden die Eluate in 30µ􏰂l SDS-Probenpuffer verdünnt und für 4 min auf 95°C erhitzt. Üblicherweise wurden 3% der Gesamtmenge als Input und 30% der Eluate auf die SDS-PAGE aufgetragen. Anschließend erfolgte ein Western Blotting mit Anti-CDC-25.1- (1:400), Anti-LIN-23- (1:750), Anti-Ubiquitin- (1:1000), Anti-GSK3􏰁- (1:500) oder Anti-􏰁β-Aktin-Antikörpern (1:2000). Wenn Extrakte keiner Immunpräzipitation unterzogen wurden, wurde dieselbe Menge an Gesamtprotein aus diesen Extrakten in SDS-Probenpuffer resuspendiert, auf 95°C erhitzt, anschließend direkt auf die SDS-PAGE aufgetragen und mittels Western Blotting analysiert. (vgl. Segref et al. 2020)

Ultraschalllyse unter präziser Temperaturkontrolle

Eine präzise und zuverlässige Temperaturkontrolle ist beim Umgang mit biologischen Proben entscheidend. Hohe Temperaturen lösen einen thermisch bedingten Proteinabbau in den Proben aus.
Wie alle mechanischen Verfahren zur Probenvorbereitung erzeugt die Beschallung Wärme. Bei Verwendung des VialTweeter lässt sich die Temperatur der Proben jedoch gut kontrollieren. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben zu überwachen und zu regeln, während Sie diese mit dem VialTweeter und dem VialPress für die Analyse vorbereiten.

1. Überwachung der Probentemperatur: Der Ultraschallprozessor UP200St, der den VialTweeter antreibt, ist mit einer intelligenten Software und einem anschließbaren Temperatursensor ausgestattet. Schließen Sie den Temperatursensor an den UP200St an und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touchdisplay können Sie im Menü des UP200St einen bestimmten Temperaturbereich für die Beschallung Ihrer Proben einstellen. Das Ultraschallgerät stoppt automatisch, sobald die Höchsttemperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den unteren Wert des eingestellten Temperaturintervalls ∆ gesunken ist. Anschließend startet die Beschallung automatisch erneut. Diese intelligente Funktion verhindert einen hitzebedingten Abbau.
2. Der VialTweeter-Block kann vorgekühlt werden. Stellen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühlschrank oder das Gefriergerät. Das Vorkühlen des Titanblocks hilft, den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Wenn möglich, kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
3. Verwenden Sie Trockeneis zur Kühlung während der Beschallung. Füllen Sie eine flache Schale mit Trockeneis und stellen Sie den VialTweeter darauf, damit die Wärme schnell abgeführt werden kann.

Finden Sie das optimale Ultraschall-Zellaufschlussgerät für Ihre Lyseanwendung

Hielscher Ultrasonics ist ein langjährig erfahrener Hersteller leistungsstarker Ultraschall-Zellaufschlussgeräte und Homogenisatoren für Labor-, Tisch- und Industrieanlagen. Die Größe Ihrer bakteriellen Zellkultur, Ihr Forschungs- oder Produktionsziel und das pro Stunde oder Tag zu verarbeitende Zellvolumen sind wesentliche Faktoren bei der Auswahl des passenden Ultraschall-Zellaufschlussgeräts für Ihre Anwendung.
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Lösungen für die gleichzeitige Beschallung mehrerer Proben (bis zu 10 Probengefäße) sowie großer Probenzahlen (d. h. Mikrotiterplatten / 96-Well-Platten). Das Angebot reicht vom klassischen Labor-Ultraschallgerät mit Sonotrode in verschiedenen Leistungsstufen von 50 bis 400 Watt bis hin zu vollständig industriellen Ultraschallprozessoren mit bis zu 16.000 Watt pro Gerät für den kommerziellen Zellaufschluss und die Proteinextraktion in der Großproduktion. Alle Hielscher-Ultraschallgeräte sind für den 24/7/365-Betrieb unter Volllast ausgelegt. Robustheit und Zuverlässigkeit sind zentrale Eigenschaften unserer Ultraschallgeräte.
Alle digitalen Ultraschallhomogenisatoren sind mit intelligenter Software, einem Farb-Touchdisplay und automatischer Datenprotokollierung ausgestattet. Dadurch wird das Ultraschallgerät zu einem komfortablen Arbeitsmittel in Labor- und Produktionsanlagen.
Teilen Sie uns mit, welche Zellarten und welches Volumen Sie wie häufig und mit welchem Ziel in Ihren biologischen Proben verarbeiten müssen. Wir empfehlen Ihnen das am besten geeignete Ultraschall-Zellaufschlussgerät für Ihre Prozessanforderungen.

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme: von kompakten Handhomogenisatoren und Mehrproben-Ultraschallgeräten bis hin zu industriellen Ultraschallprozessoren für kommerzielle Anwendungen: