Ultraschall-Probenvorbereitung von C. Elegans

C. elegans, ein Nematodenwurm, ist ein in der Biologie weit verbreiteter Modellorganismus. Für die Probenvorbereitung vor der Analyse ist die Lyse, Protein- und Lipidextraktion sowie RNA-Fragmentierung notwendig. Diese Prozesse der Probenvorbereitung können mittels Ultrascahall zuverlässig ausgeführt werden. Ultraschall-Zellaufschlussgeräte sind zuverlässige, hochentwickelte und einfach zu bedienende Homogenisatoren für die schnelle, reproduzierbare Vorbereitung von C. elegans-Proben.

Ultraschall-Probenvorbereitung von C. Elegans

C. elegans sind Fadenwürmer, welche in Labors zur Forschungsarbeit in der Genomik, Entwicklungsbiologie und zur Erforschung von Krankheiten weit verbreitet sind. Viele Gene im Genom von C. elegans haben funktionelle Homologe im menschlichen Genom. Dadurch ist der Fadenwurm ein äußerst nützliches Modell zur Untersuchung menschlicher Krankheiten. Weitere Vorteile, welche C. elegans zu einem präferierten Modellorganismus machen, sind die einfache und kostengünstige Kultivierung auf Platten mit Bakterien (z.B. E. coli), die Transparenz der Würmer, die unproblematische Handhabung sowie die Möglichkeit, die Würmer einzufrieren und dadurch über einen längeren Zeitraum zu lagern.
Protein- und Lipidanalysen gehören zu den regelmäßigen Verfahren im Labor, und die Ultraschallprobenvorbereitung ist die etablierte Methode zur Lyse von C. elegans Nematoden in jedem Entwicklungsstadium (d.h. Embryonen, Larven L1-L4, adulte Tiere). Da C. elegans auch als Proteinexpressionssystem zur Überexpression von bestimmten Proteinen verwendet wird, ist eine zuverlässige, reproduzierbare Lyse- und Proteinextraktionsmethode, die hohe Proteinausbeuten erzielt, erforderlich. Für den Ultraschall-gestützten Zellaufschluss und die Proteinextraktion stehen sowohl Ultraschallstabhomogenisatoren als MultiSample-Ultraschallgeräte zur Verfügung. Hielscher Ultrasonics hat den idealen Ultraschall-Zellaufschlussapparat für Ihr Laborverfahren, der eine bequeme Probenvorbereitung für alle Arten von Probengrößen ermöglicht.

Ultraschallprotokolle für den Zellaufschluss von C. Elegans

Die Ultraschall-Homogenisierung und Lyse von C. elegans sowie die anschließende Protein- und Lipidextraktion können mittels unterschiedlichen Verfahren unter Verwendung verschiedener Homogenisierungs- und Lysepuffer etc. durchgeführt werden. Allen Lyse-Protokollen ist gemeinsam, dass die Proben kontinuierlich auf Eis gehalten werden müssen, um eine thermisch-induzierte Proteinzersetzung zu vermeiden. Nachfolgend stellen wir Ihnen einige zuverlässige und schnelle Ultraschall-Lyse- und Extraktionsprotokolle für die Herstellung hochwertiger protein- oder lipidhaltiger C. elegans-Proben vor.

Vorteile der ultraschall-gestützten C. elegans-Lyse

• Zuverlässig
• reproduzierbar
• präzise Temperaturkontrolle
• zuverlässige Prozesssteuerung
• schonende Methode
• einfach anzuwenden
• sicher

Ultraschall-gestützte Proteinextraktion aus C. elegans-Proben

Die Ultraschall-Lyse und Proteinextraktion von C.elegans-Würmern kann mit verschiedenen Protokollen durchgeführt werden. Im Folgenden stellen wir Ihnen einige zuverlässige und schnelle Lyse-Protokolle für reproduzierbare Proteinextraktionsergebnisse vor.

Schnelle Herstellung eines zytosolischen Extraktes aus C. elegans Würmern mittels Ultraschall

Mit dem folgenden Protokoll können Sie C. elegans Lysate in weniger als 30 Minuten herstellen.
Ernte der C. elegans-Würmer
Die C.elegans-Würmer werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (engl. phosphate buffered saline = PBS) abgeerntet oder von einer Platte mit 1,5 ml PBS abgewaschen. Zentrifugieren Sie die Teströhrchen 1 Minute lang bei 2000 U/min, um das Pellet zu erhalten. Die Proben sind jederzeit auf Eis zu lagern.
Waschen Sie die Würmer anschließend zweimal mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
Waschen Sie die Würmer anschließend zweimal mit ddH₂O.
Anschließend werden die Würmer in mindestens 500 ul Homogenisierungspuffer (HB) resuspendiert. Die C. elegans-Proben sind nun für die Ultraschall-Lyse bereit.
Um die Qualität des Proteinextrakts zu erhöhen, sollten Sie die bakterielle Kontamination reduzieren, indem Sie die Würmer jeweils 5 Minuten lang in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und sterilem, ultrareinem Wasser (ddH₂O) waschen oder ein Saccharose-Floatationsverfahren durchführen. Lagern Sie die Wurmproben kontinuierlich auf Eis.

Protokoll für die ultraschall-gestützte Lyse von C. elegans

• Stellen Sie sicher, dass Sie den Ultraschall-Homogenisator im Voraus vorbereiten, damit er während der Prozedur der Prbenvorbereitung einsatzbereit ist (Sonotrode montiert, Beschallungsprogramm voreingestellt).

Wenn Ihr Ultraschallgerät auf einem Ständer montiert ist, platzieren Sie das Eisbad mit den Probenröhrchen unter der Ultraschallsonotrode und führen Sie die Ultraschallsonotrode in das 1,5-ml-Röhrchen ein.

• Bei der Lyse von C. elegans mit dem UP200St oder UP200Ht (z.B. Sonotrode mit 2mm Mikrospitze S26d2; siehe Bild links) sollte der Ultraschall mit 40% Amplitude für 1s mit 30s Pausen dazwischen durchgeführt werden. 5 Ultraschallzyklen mit je 1 Sekunde Beschallung und 30 Sekunden Pausen dazwischen sind ideal für die C. elegans Lyse. Wenn Sie die Lyse zum ersten Mal durchführen, können Sie den Lyseverlauf in kleinen Aliquots der Probe nach jedem Impuls mit einem Mikroskop überprüfen.
• Die Lyse ist erfolgreich abgeschlossen, wenn die Würmer komplett aufgeschlossen sind. Eine Überbeschallung führt zur Zerstörung der Nuklei und wird sichtbar, wenn die Probe zähflüssig wird oder schäumt. Um eine Zersetzung der Probe zu verhindern, verwenden Sie bei Bedarf mehrere kurze Pulse. Verlängern Sie die Zeit der einzelnen Ultraschallimpulse nicht, um sicherzustellen, dass qualitativ hochwertige Proteinextrakte hergestellt werden.
• Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugieren der beschallten Würmer bei 14.000 rpm für 10min bei 4ºC.
• Dann wird der Überstand in ein frisches Röhrchen überführt und für die Immunpräzipitation oder andere Tests vorbereitet.

Hinweis zum Homogenisierungspuffer: Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer für das obige Ultraschall-Lyse-Protokoll wie folgt vor:

Hochdurchsatz-Lyse von C. elegans in 96-Well-Platten unter Verwendung des UIP400MTP-Plattenschalldämpfers

C. elegans Lyse (erwachsene Fadenwürmer)
UIP400MTP 80% Amplitude, 20 Zyklen (jeder Beschallungszyklus: 30 Sekunden EIN, 30 Sekunden AUS)
Lysepuffer:

• Option 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Option 2) für die Co-Immunopräzipitation (Co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (vollständiger Proteinase-Inhibitor-Cocktail)

DNA-Fragmentierung im Hochdurchsatzverfahren
C. elegans (erwachsene Nematoden) DNA 200-300bp: UIP400MTP Plattenschalldämpfer – Einstellung 80% Amplitude, 30 Impulse – jeweils 30sec an, 30sec aus

UIP400MTP Plate Sonicator für die Probenvorbereitung im Hochdurchsatzverfahren beschallt Proben in Multiwell-, Mikrotiter- und 96-Well-Platten gleichmäßig

Ultraschall-Lyse von C. elegans für quantitative Affinitätsreinigungs-Assays

C. elegans-Embryonen (∼2 Millionen pro Replikat) wurden frisch in biologischer Triplikatform durch Bleichen junger gravider Hermaphroditen geerntet und mittels Ultraschall im Pulsmodus (Zyklus: 0,5 s, Amplitude: 40-45%, 5 Ultraschallpulse pro Zyklus, 5 Zyklen, Pausen-Intervall zwischen den Beschallungen: 30 s; UP200S Ultraschall-Prozessor mit Mikrospitze S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in Lysepuffer (Gesamtvolumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% Glycerin, Protease-Inhibitormischung, 0,1% Nonidet P-40 Substitute) beschallt. Die Proben werden kontinuierlich auf Eis gehalten. Nach der Beschallung wurde Nonidet P-40 Substitute bis zu 1% zugesetzt und die Lysate wurden im Rotationsmischer bei 4°C für 30 min inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 × g für 20 min bei 4°C. Das gereinigte Lysat wurde dann ohne Störung der oberen Lipidschicht abgesaugt und entweder in die Anti-GFP-Agarosebeads oder die blockierten Kontrollbeads halbiert (40-50 μl). Nach einer 60-90-minütigen Behanlung im Rotationsmischer bei 4°C wurden die Beads einmal mit Lysepuffer, der 0,1% Nonidet P-40 Substitute enthielt, gewaschen, gefolgt von zweimaligem Waschen entweder in Puffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder Puffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder in beiden. Für GFP:MBK-2-Pull-Downs wurden zwei getrennte Versuche unter verschiedenen Waschbedingungen durchgeführt. Die Proteine wurden durch orbitales Schütteln in 50 μl von 6 m Harnstoff/2 M Thioharnstoff bei Raumtemperatur eluiert. Für die MBK-1::GFP-Pull-Down-Experimente wurden die Proteine zweimal durch Schütteln in 50μl von 8 m Guanidiniumchlorid bei 90°C eluiert, gefolgt von einer Ethanol-Fällung. Die eluierten Proteinproben wurden dann in Lösung aufgeschlossen.
(vgl. Chen et al., 2016)

Ultraschall-gestützte Wurmhomogenisierung und Lyse

Für die C.elegans Lyse und das Proteinextraktionsverfahren wurden pro Probe 30.000 Nemotoden der entsprechenden Entwicklungsstufe geerntet und in eiskaltem S-Basal gewaschen, durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 2 min. konzentriert, sechsmal mit eiskaltem S-Basal gewaschen, um Restbakterien zu entfernen, und dann bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert. Zur Proteinextraktion wurde den gravid-adulten Würmern nach der letzten S-Basal-Wäsche erlaubt, ein kompaktes Pellet zu bilden. Anschließend wurden die Wurmpellets in 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer [20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, Proteasehemmer (Sigma P2714)] resuspendiert und sofort verarbeitet.
∼30.000 gravid-erwachsene Würmer (entsprechend ∼100 mg Feuchtgewicht), wurden mit einer Ultraschallsonotrode (z.B. UP50H mit Mikrospitze MS2) bei 40% Amplitude für 10 Zyklen von 3 s an, 30 s aus, in 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer auf Eis beschallt. (vgl. Baskharan et al. 2012)

Ultraschall-gestützte Lipidextraktion aus C. elegans

In der Lipidomik, einem Zweig der Metabolomik, wird das Lipidkomplement biologischer Systeme charakterisiert und analysiert. C. elegans sind in der Lipidomik weit verbreitet, um die Wechselwirkung von metabolischen Lipiden und ihre Auswirkungen auf Gesundheit und Lebensspanne zu untersuchen.
Die Ultraschall-Lyse und -Extraktion wird zur Freisetzung von Lipiden wie Sphingolipiden aus C. elegans-Embryonen, -Larven und adulten Würmern verwendet. Ultraschall wird zur Herstellung von Wurmhomogenaten und anschließend zur Extraktion der Lipide aus der Probe eingesetzt.
Protokoll für die Ultraschall-Lipidextraktion aus C. elegans
Das C. elegans-Pellet auf Eis auftauen und in 0,5 ml Ultrawasser resuspendieren. Die C. elegans-Proben werden in 1,5mL-Reagenzgefäßen beschallt, wobei die Proben kontinuierlich auf Eis gehalten werden.
Die Beschallung kann mit einer Ultraschall-Sonotrode wie dem UP200Ht, der Ultraschall-Probenvorbereitungseinheit VialTweeter (gleichzeitige Beschallung von 10 Proben) oder dem UIP400MTP (für die Beschallung von Multiwell-Platten wie z.B. 96-Well-Platten) erfolgen. Bei der Ultraschall-Lyse mit dem UP200Ht wird die Mikrospitze S26d2 verwendet. Stellen Sie den Ultraschallzyklus-Modus im Digitalmenü ein. Stellen Sie die Amplitude auf 10% und den Beschallungszyklusmodus mit 2 Sekunden Impulsen von 20 Zyklen mit einer Pause von 30 Sekunden zwischen den einzelnen Ultraschallpulsationen ein.
Überführen Sie die Überstände in Glasröhrchen mit Schraubverschluss. Führen Sie die Folchextraktion durch Zugabe von 1 ml Ultrawasser in jedes Glasröhrchen, gefolgt von der Zugabe von 6 ml 
of Chloroform/Methanol (Verhältnis = 2:1) Gemisch zu jedem Glasröhrchen durch.
Jedes Glasröhrchen wird 4 Mal für 30 Sekunden mit einem Vortex-Mischer behandelt. Anschließend werden die Röhrchen bei 1.258 x g für 15 min (Eppendorf, 5810 R) zur verbesserten Phasentrennung zentrifugiert. Die untere hydrophobe Fraktion wird mit einer Glaspasteurpipette in ein sauberes Glasröhrchen pipettiert. Die untere hydrophobe Fraktion wird unter Stickstofffluss in einem Stickstoffverdampfer getrocknet. Das getrocknete Pellet wird bei -80°C im Gefrierschrank bis zur Verwendung gelagert.

Ultraschall-Probenpräparation von Wurmlysaten

Wurm-Lysat: Würmer im L4-Stadium werden geerntet und dreimal mit M9-Puffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl, und 0,87 mM MgSO₄) gewaschen, um alle Bakterien zu entfernen. Nachdem so viel M9-Puffer wie möglich entfernt worden war, werden die Würmer in Lysepuffer resuspendiert: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM Phosphat β-Glycerin, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid und Proteaseinhibitor. Die Würmer werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und dreimal bei 37°C aufgetaut, dann wurden die Würmer auf Trockeneis mit dem Ultraschall-Probenvorbereitungsgerät VialTweeter, das die gleichzeitige Sonifizierung von 10 Probenröhrchen erlaubt, beschallt. Die Beschallung wird bei 50% Amplitude in 10 Zyklen von 2 Sekunden mit einer Pause von 30 Sekunden zwischen den Beschallungspulsen durchgeführt. Danach werden die Proben bei 12000 rpm bei 4°C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und bei -70°C gelagert. Ein Aliquot wird für die Proteinquantifizierung mittels Bradford-Assay verwendet.
Bestimmung von Gesamtglutathion, GSH und GSSG: Für die Quantifizierung des Glutathions werden Lysate am Tag der Analyse hergestellt. Die mit Glutathion gefütterten Larven und die Kontroll-L4-Larven werden geerntet und dreimal mit M9-Puffer gewaschen. Nachdem so viel M9-Puffer wie möglich entfernt worden ist, werden die Würmer in eiskalter Metaphosphorsäure (5% w/v) resuspendiert. Dann werden die Würmer in Eis mit einem Ultraschall-VialTweeter bei 50% Amplitude in zehn Beschallungszyklen von 2 Sekunden mit 30 Sekunden Pause zwischen jedem Zyklus beschallt. Danach werden die Würmer bei 12000 U/min bei 4 ̊C für 15 Minuten zentrifugiert.
(vgl. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Probenvorbereitung vor der Immunpräzipitation und dem Western Blotting

Zur Gewinnung embryonaler Extrakte werden die Larven von C. elegans L1 in groß angelegten flüssigen S-medium-Kulturen bis zum Erwachsenenalter gezüchtet. Die Embryonen werden unter Verwendung der Standardbleichmethode entnommen und in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% Glycerin, 0,05% NP-40, 1 Protease-Inhibitor-Cocktail und 1 Phosphatase-Inhibitor-Cocktail I und II) suspendiert, schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für den Zellaufschluss werden die C. elegans Embryo-Proben mit einem Ultraschallgerät mit Mikrospitze wie z.B. dem UP200Ht mit S26d2 für 10 Impulse über 10 s bei 30% Amplitude beschallt. Wenn eine größere Anzahl von Proben vorbereitet werden muss, ist die Ultraschalleinheit VialTweeter oder der MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP für Well-Platten empfehlenswert. Nach der Beschallung werden die Extrakte durch Zentrifugation bei 30.000 g für 20 min bei 4°C vorgereinigt. Das vorgereinigte Extrakt (300µg Gesamtproteins) wurde mit 40µg eines affinitätsgereinigten Anti-CDC-25.1-Antikörpers, der mit Protein A-Agarose quervernetzt ist, inkubiert. Als Kontrolle werde eine ähnliche Menge Kaninchen-Immunglobulin (Ig)G, das mit Protein A-Agarose quervernetzt ist, in einem Gesamtvolumen von 200µl Lysepuffer mit 1% NP-40 verwendet, dessen Einschluss die unspezifische Bindung von Proteinen an die Matrix reduzierte. Die Proben werden 1 h bei 4°C rotiert, die Beads werden dreimal mit Lysepuffer gewaschen und mit 30µl Glycin/HCl und 200 mM NaCl, pH 2,2 eluiert. Nach der Immunpräzipitation werden die Eluate in 30µl SDS-Probenpuffer verdünnt, für 4 min auf 95°C erhitzt, und typischerweise werden 3% der Gesamtmenge für den Input und 30% für die Eluate auf die SDS-PAGE aufgetragen, gefolgt von Western Blotting mit anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-Ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) oder antiβ-Actin (1:2000) Antikörpern. Wenn die Extrakte keiner Immunpräzipitation unterzogen werden, wird die gleiche Menge des Gesamtproteins aus diesen Extrakten in SDS-Probenpuffer resuspendiert, auf 95°C erhitzt und dann direkt auf die SDS-PAGE aufgetragen und mittels Western Blotting analysiert. (vgl. Segref et al. 2020)

Ultraschall-Lyse unter präziser Temperaturkontrolle

Die präzise und zuverlässige Temperaturkontrolle ist bei der Verarbeitung von biologischen Proben entscheidend. Hohe Temperaturen initiieren den thermisch induzierten Proteinabbau in Proben.
Wie alle mechanischen Probenpräparationstechniken erzeugt auch die Beschallung Wärme. Die Temperatur der Proben kann jedoch gut kontrolliert werden, wenn z.B. der VialTweeter oder ein anderes digitales Hielscher Ultrasachllgerät verwendet wird. Wir stellen Ihnen verschiedene Möglichkeiten vor, die Temperatur Ihrer Proben zu überwachen und zu kontrollieren, während Sie diese z.B. mit dem VialTweeter und VialPress für die Analyse vorbereiten.

1. Überwachung der Probentemperatur: Der Ultraschallprozessor UP200St, der den VialTweeter ansteuert, ist mit einer intelligenten Software und einem steckbaren Temperatursensor ausgestattet. Stecken Sie den Temperatursensor in den UP200St und führen Sie die Spitze des Temperatursensors in eines der Probenröhrchen ein. Über das digitale Farb-Touch-Display können Sie im Menü des UP200St einen bestimmten Temperaturbereich für Ihre Probenbeschallung einstellen. Das Ultraschallgerät stoppt automatisch, wenn die maximale Temperatur erreicht ist, und pausiert, bis die Probentemperatur auf den niedrigeren Wert der eingestellten Temperatur gesunken ist ∆. Dann beginnt die Beschallung automatisch wieder. Diese intelligente Funktion verhindert wärmeinduzierte Probenzersetzung.
2. Der VialTweeter-Block kann vorgekühlt werden. Legen Sie den VialTweeter-Block (nur die Sonotrode ohne Schallwandler!) in den Kühl- oder Gefrierschrank, um den Titanblock vorzukühlen und so den Temperaturanstieg in der Probe zu verzögern. Wenn möglich, kann auch die Probe selbst vorgekühlt werden.
3. Verwenden Sie Trockeneis zur Kühlung während der Sonifizierung. Verwenden Sie eine flache, mit Trockeneis gefüllte Schale und platzieren Sie den VialTweeter auf dem Trockeneis, so dass die Wärme schnell abgeführt werden kann.

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Die nachstehende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme, von kompakten, handgehaltenen Homogenisatoren und MultiSample-Ultraschallgeräten bis hin zu industriellen Ultraschallprozessoren für kommerzielle Anwendungen: