Entparaffinierung und Proteinextraktion aus FFPE

Erleichtern Sie die Proteinextraktion aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten durch eine optimierte Kombination aus Entparaffinierung, Solubilisierung und Ultraschallbehandlung mit einem VialTweeter Mehrfachröhrchen-Ultraschallgerät. Dieses Protokoll unterstützt die anschließende massenspektrometriebasierte Proteomik und ist mit Arbeitsabläufen zur SP3-Aufreinigung und zum enzymatischen Verdau kompatibel.

Diese Standardarbeitsanweisung (SOP) richtet sich an Laborpersonal, das FFPE-Gewebeproben mittels Hochleistungs-Ultraschallbehandlung für die proteomische Analyse aufbereitet. Sie ist für die parallele Verarbeitung von bis zu zehn FFPE-Proben mit dem VialTweeter Mehrfachröhrchen-Ultraschallgerät optimiert.

Protokoll: Proteinextraktion aus FFPE-Proben mit dem VialTweeter

Materialien und Reagenzien

Reagenzien

• Xylol (Histologie-Qualität)
• Ethanol (absolut, 96%)
• Lysepuffer:

6 M Guanidinhydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
40 mM CAA (2-Chloracetamid)

• Proteaseinhibitor (optional; z. B. cOmplete™ mini EDTA-free)

Ausstattung

• VialTweeter Mehrfachröhrchen-Ultraschallgerät
• Low-Binding-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 1,5 mL oder 2,0 mL
• Heizblock oder Inkubator (Temperatureinstellungen von 95°C und 80°C)
• Mikrozentrifuge
• Thermomixer (optional, aber empfohlen)

Ausgangsprobenmenge

• 1–2 FFPE-Gewebeschnitte mit einer Dicke von 10 µm pro Probe (d. h. pro Röhrchen)

ODER

• Insgesamt ~100 µg Gewebe pro Probe (d. h. pro Röhrchen)

Hinweis: Verwenden Sie für die Mikrotomie frische Klingen, um die Kontamination durch Paraffinreste zu minimieren.

Durchführung

1. Entparaffinierung
   1. Überführen Sie die FFPE-Schnitte in Low-Binding-Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Geben Sie 1 mL Xylol hinzu und vortexen Sie kurz.
   3. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   4. Zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 14.000 × g; verwerfen Sie den Überstand.
   5. Wiederholen Sie den Waschschritt mit Xylol ein weiteres Mal (Schritte 2–4).
   6. Waschen Sie das Pellet mit 1 mL 96%igem Ethanol, vortexen Sie und zentrifugieren Sie anschließend 2 Minuten bei 14.000 × g. Verwerfen Sie den Überstand.
   7. Wiederholen Sie den Waschschritt mit Ethanol ein weiteres Mal (insgesamt 2 Waschschritte mit Ethanol).
   8. Lassen Sie das Pellet bei geöffneten Deckeln 10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen, damit das restliche Ethanol verdunstet.
2. Proteinextraktion und Ultraschallbehandlung
   1. Geben Sie zu jedem trockenen Pellet 200 µL Lysepuffer.

      Hinweis: Obwohl das Ultraschallgerät bis zu 1 mL aufnehmen kann, sind 200 µL für die anschließende Verarbeitung optimal.

   2. Mischen Sie durch Vortexen oder vorsichtiges Pipettieren.
3. Erste thermische Inkubation
   1. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 min bei 95 °C unter Schütteln bei 400 rpm in einem Thermomixer oder Heizblock.
   2. Lassen Sie die Proben 5 min bei Raumtemperatur abkühlen.
4. Erste Ultraschallbehandlung mit dem VialTweeter
   1. Setzen Sie die Röhrchen in den VialTweeter ein.
   2. Stellen Sie am VialTweeter UP200St die unten angegebenen Werte ein und führen Sie die Ultraschallbehandlung durch.
Einstellungen des Ultraschallgeräts
• Stellen Sie die Amplitude (A) auf 100% ein.
• Stellen Sie den Pulsationsmodus (C) auf 100% ein.
• Periodentaktgeber: Ein
• Einschaltzeit: 60s
• Ausschaltzeit: 30s
• Grenzwert: 15 min (entspricht 10 Zyklen)
(Hinweis zur Berechnung: (60 s eingeschaltet + 30 s ausgeschaltet) × 10 Zyklen = 900 s = 15 min)
5. Zweite thermische Inkubation
   Entnehmen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie erneut 15 min bei 95 °C und 400 rpm.
6. Zweite Ultraschallbehandlung
   Wiederholen Sie die Ultraschallbehandlung mit dem VialTweeter bei denselben Einstellungen (wie oben) für weitere 10 Zyklen (insgesamt 15 min).
7. Klärung des Lysats
   1. Zentrifugieren Sie die Proben 10 min bei 13.000 × g und 23°C (Raumtemperatur).
   2. Überführen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Safe-lock-Eppendorf-Röhrchen mit einem Volumen von 2,0 mL. Vermeiden Sie es, das Pellet aufzuwirbeln.
8. Anschließende Verarbeitung
   Das Lysat ist nun für die SP3-Aufreinigung und den enzymatischen Verdau bereit.

Hinweise und bewährte Vorgehensweisen

1. Das Überhitzungsrisiko während der Ultraschallbehandlung wird durch programmierte Ein-/Aus-Zyklen verringert.
2. Vermeiden Sie nach der Ultraschallbehandlung das Vortexen, um eine Proteinaggregation zu verhindern.

Abfallentsorgung und Sicherheit

Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte im Labormaßstab: