Deparaffinisierung und Proteinextraktion aus FFPE-Proben
Vereinfachen Sie die Proteinextraktion aus Vereinfachen Sie die Proteinextraktion aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten durch eine optimierte Kombination aus Entparaffinierung, Solubilisierung und ultraschallgestützter Probenbearbeitung mit dem VialTweeter Mehrproben-Ultraschallgerät. Dieses hocheffiziente Protokoll ist speziell auf die Anforderungen der massenspektrometriebasierten Proteomik abgestimmt und voll kompatibel mit SP3-basierten Reinigungsverfahren sowie enzymatischen Aufschluss-Workflows. Die standardisierte, parallele Beschallung mehrerer Proben verbessert die Reproduzierbarkeit und ermöglicht eine zeiteffiziente Verarbeitung auch geringer Probenmengen.
Dieses SOP richtet sich an Laborpersonal, das in der proteomischen Analyse von FFPE-Gewebeproben arbeitet. Es ist optimiert für bis zu zehn FFPE-Proben, die parallel mit dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator beschallt werden.
VialTweeter-Sonicator für die gleichzeitige Beschallung von 10 Proben, z.B. für die Lyse und Proteinextraktion aus FFPE-Proben
Protokoll: Proteinextraktion aus FFPE-Proben mit dem VialTweeter
Materialien und Reagenzien
Reagenzien
- Xylol (Histologie-Qualität)
- Ethanol (absolut 96%)
- Lysepuffer:
- Proteasehemmer (optional; z.B. cOmplete™ mini EDTA-free)
6 M Guanidinhydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
40 mM CAA (2-Chloracetamid)
Ultraschallprozessoren
- VialTweeter Multi-Tube-Sonicator
- 1,5 mL oder 2,0 mL Low-Binding Mikrozentrifugenröhrchen
- Heizblock oder Inkubator (einstellbar auf 95°C und 80°C)
- Mikrozentrifuge
- Thermomixer (optional, aber empfohlen)
Proben
- 1–2 Proben mit 10 μm dickem FFPE-Gewebe pro Vial)
- Insgesamt ~100 μg Gewebe pro Probe (d. h. pro Vial)
oder
Hinweis: Verwenden Sie frische Klingen für die Mikrotomie, um die Kontamination mit Paraffinresten zu minimieren.
Vorgehensweise
- Entparaffinierung
- Übertragen Sie FFPE-Proben in Low-Binding Mikrozentrifugenröhrchen.
- Geben Sie 1 mL Xylol zu und vortexen Sie die Proben kurz.
- 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 2 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugieren; Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie die Xylol-Wäsche noch einmal (Schritte 2–4).
- Waschen Sie das Pellet mit 1 mL 96 % Ethanol, vortexen Sie und zentrifugieren Sie die Proben asnschließend für 2 Minuten bei 14.000 × g. Den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie die Ethanolwäsche noch einmal (insgesamt 2 Ethanolwäschen).
- Lassen sie das Pellet 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit geöffneten Deckeln an der Luft trocknen, um das restliche Ethanol zu verdampfen.
- Proteinextraktion und Beschallung
- Geben Sie 200 μl Lysepuffer zu den getrockneten Pellets.
Hinweis: Obwohl die Tubes des Sonicators bis zu 1 ml aufnehmen können, sind 200 μl optimal für die nachgelagerte Verarbeitung. - Homogenisieren sie die Proben durch Vortexen oder sanftes Pipettieren.
- Geben Sie 200 μl Lysepuffer zu den getrockneten Pellets.
- Erste thermische Inkubation
- Die Tubes werden 30 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und mit einem Thermomischer oder Wärmeblock bei 400 U/min gerührt.
- Lassen Sie die Proben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auskühlen.
- Erste Beschallung mit dem VialTweeter
- Setzen Sie die Röhren in den VialTweeter ein.
- Stellen Sie den VialTweeter UP200St auf die folgenden Werte ein und beschallen Sie.
- Zweite thermische Inkubation
Nehmen Sie die Tubes aus dem VialTweeter und inkubieren Sie diese erneut bei 95°C für 15 min und 400 U/min. - Zweite Beschallung
Wiederholen Sie die Beschallung auf dem VialTweeter mit den gleichen Einstellungen (siehe oben) für weitere 10 Zyklen (insgesamt 15 Minuten). - Klärung des Lysats
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 × g für 10 min bei 23°C (Raumtemperatur).
- Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in einem neuen 2,0-ml-Safe-Lock-Eppendorf-Röhrchen. Vermeiden Sie es, das Pellet zu schütteln.
- Weiterverarbeitung
Das Lysat ist nun bereit für die SP3-Aufreinigung und den enzymatischen Verdau.
• Stellen Sie die Amplitude (A) auf 100% ein
• Stellen Sie den Pulsationsmodus (C) auf 100 % ein
• Periodenuhr: Ein
• Einschaltzeit: 60 s
• Ausschaltzeit: 30s
• Limit Value: 15 min (entspricht 10 Zyklen)
(Berechnungshinweis: (60 s Ein + 30 s Aus) × 10 Zyklen = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter mit 10 Eppendorf-Tubes
Hinweise und bewährte Praktiken
- Reduzieren Sie das Risiko einer thermischen Zersetzung während der Beschallung indem Sie gepulsten Ultraschall (EIN/AUS-Zyklen) nutzen.
- Vortexen Sie die Proben nach der Beschallung nicht, um eine Proteinaggregation zu verhindern.
Entsorgungs- und Sicherheitshinweise
Die nachstehende Tabelle gibt Ihnen einen Hinweis auf die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Labor-Ultraschallgeräte:
| Empfohlenes Ultraschallgerät | Batch-Volumen | Durchfluss |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96-Well-Platten Sonicator | Multiwell-/Mikrotiterplatten | n.a. |
| Ultraschall-CupHorn | CupHorn für Vials und Becher | n.a. |
| GDmini2 | Ultraschall-Mikroströmungsreaktor | n.a. |
| VialTweeter | 0,5 bis 1,5 ml | n.a. |
| UP100H | 1 bis 500ml | 10 bis 200ml/min |
| UP200Ht, UP200St | 10 bis 1000mL | 20 bis 200mL/min |
| UP400St | 10 bis 2000ml | 20 bis 400ml/min |
| Ultraschall-Sieb | n.a. | n.a. |
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Literatur / Literaturhinweise
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Häufig gestellte Fragen
Warum werden Gewebeproben als FFPE fixiert?
Die Konservierung von in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE) stabilisiert die Gewebemorphologie und die Proteinstrukturen durch die Bildung kovalenter Vernetzungen mittels Formaldehyd. Die Einbettung in Paraffin ermöglicht eine langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, wobei die histologische und molekulare Integrität für retrospektive Analysen erhalten bleibt.
Wie entparaffiniere ich FFPE-Proben?
Bei der Entparaffinierung wird das Paraffin durch aufeinanderfolgende Waschungen mit Lösungsmitteln entfernt: in der Regel zwei Inkubationen mit Xylol, gefolgt von zwei Waschungen mit Ethanol (96 %). Nach Zentrifugation und Trocknung ist das Gewebe für die nachfolgende Extraktion bereit. Durch dieses Verfahren wird die Probe für die Lyse und den enzymatischen Verdau wieder zugänglich gemacht.
Weshalb werden Proben thermisch inkubiert?
Unter thermischer Inkubation versteht man die kontrollierte Aussetzung einer Probe an eine bestimmte Temperatur für einen bestimmten Zeitraum, um biochemische oder physikalische Veränderungen zu bewirken. In der Proteomik wird sie häufig eingesetzt, um Proteine zu denaturieren, Formaldehyd-Vernetzungen in FFPE-Gewebe umzukehren oder die Wirksamkeit von Lysispuffern zu verbessern. Die Temperatur und die Dauer sind entscheidende Parameter, die auf die Zielreaktion oder den Probentyp zugeschnitten sind.
Was ist der SP3-Aufschluss?
Die Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) ist ein Bead-basierter Proteomics-Workflow. Er verwendet paramagnetische Beads zur Bindung von Proteinen und ermöglicht so eine effiziente Reinigung, Konzentration und einen enzymatischen Verdau unter denaturierenden Bedingungen auf dem Bead. SP3 minimiert den Probenverlust und ist mit geringem Probenaufkommen und FFPE-Proben sehr gut kompatibel.
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