FFPE-Probenvorbereitung im Hochdurchsatz: Proteinextraktion und Nukleinsäurescherung

Mit dem Hochdurchsatz-Ultraschallgerät UIP400MTP stellt sich Hielscher Ultrasonics den Herausforderungen der Aufbereitung von in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE). Erfahren Sie, wie Ultraschall FFPE-Proben in großen Mengen für die FFPE-Entparaffinierung, Gewebelyse, Homogenisierung, Proteinextraktion und DNA/RNA-Scherung verarbeitet! Nutzen Sie die Vorteile der FFPE-Gewebeaufbereitung mit Ultraschall – Verarbeitung großer Probenzahlen in Multiwell-Platten! Erzielen Sie qualitativ hochwertige Proben und hohe Probenzahlen für zuverlässige Forschungsergebnisse! Und nicht zuletzt sparen Sie Zeit und Geld!

FFPE-Probenvorbereitung durch Hochdurchsatz-Sonikation vereinfacht

Die Formalinfixierung und Paraffineinbettung (FFPE) ist die gängigste Methode zur Konservierung und Archivierung fester Gewebeproben. Die Extraktion von Biomolekülen aus FFPE-Gewebeproben stellt aufgrund der Qualität der gelagerten Proben oft eine große Herausforderung dar. Diese Proben, die für die Molekularbiologie und die klinische Forschung von unschätzbarem Wert sind, stellen eine reichhaltige Quelle biologischer Informationen für retrospektive Studien und die Validierung diagnostischer Biomarker dar. Das Verfahren der Formalinfixierung und Paraffineinbettung bewahrt zwar die Architektur und Morphologie des Gewebes, erschwert jedoch die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und Proteine. Formalin induziert die Vernetzung von Nukleinsäuren und Proteinen, was zu molekularer Fragmentierung und chemischen Veränderungen führt. Erfahren Sie, wie das Hochdurchsatz-Ultraschallgerät UIP400MTP die Herausforderungen der FFPE-Probenvorbereitung meistert!

Ultraschallgerät für eine effiziente FFPE-Probenvorbereitung

  • Benutzerfreundlicher Workflow: Vereinfachte Prozesse, die benutzerfreundlich sind.
  • Entparaffinierung, Proteinextraktion, DNA- / RNA-Scheren
  • Schnelle Hochdurchsatzverarbeitung: Effiziente Handhabung von Multi-Well-Platten.
  • Effektive Entparaffinierung: Verbesserte Solubilisierung von Proteinen.
  • Ungiftige Lösungsmittel: Vermeidet die Verwendung schädlicher organischer Lösungsmittel wie Xylol.

 

The UIP400MTP multiwell plate ultrasonicator can process FFPE samples in high-throughput for protein extraction and DNA and RNA shearing

UIP400MTP Hochdurchsatz-Sonicator für die Verarbeitung von FFPE-Proben in Multiwell-Platten mit hohem Durchsatz

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FFPE-Probenaufbereitung mit Ultraschall - UIP400MTP Multwell-Plattenschallgerät von Hielscher
 

Fortschritte bei den Techniken zur Proteinextraktion aus FFPE-Gewebe

Hielscher Ultrasonics stellt sich den Herausforderungen der FFPE-Probenvorbereitung im Hochdurchsatzverfahren. Bei der Sonikation werden Ultraschallwellen eingesetzt, um mechanische Vibrationen und fokussierte Kavitation zu erzeugen, die die Zellstrukturen effektiv aufbrechen und die Solubilisierung von Biomolekülen verbessern. Diese Technik hat an Popularität gewonnen, da sie die Effizienz und Ausbeute der Nukleinsäure- und Proteinextraktion aus FFPE-Gewebe sowie das Scheren von DNA und RNA für die Vorbereitung von Bibliotheken erhöht. Es ist sehr wichtig hervorzuheben, dass durch die Ultraschallbehandlung mit dem UIP400MTP Multiwell-Plattenschalldämpfer die Integrität dieser Biomoleküle für nachfolgende Anwendungen erhalten bleibt.

 

Das Video zeigt das Ultraschallsystem UIP400MTP, das die zuverlässige Probenvorbereitung jeder Standard-Multiwell-Platte / Microtiter-Platte mit hochintensivem Ultraschall ermöglicht. Typische Anwendungen des UIP400MTP sind die Lyse, das Scheren von DNA, RNA und Chromatin sowie die Proteinextraktion.

Ultraschallgerät UIP400MTP zur Beschallung von Multiwell-Platten

Video-Miniaturansicht

 

Scherung von Nukleinsäuren durch Hochdurchsatz-Ultraschallbehandlung

96-Well-Platten und andere Multiwell-Platten lassen sich am besten mit dem Sonicator UIP400MTP bearbeiten. Dieses Ultraschallsystem ist ideal für die Lyse, DNA-Fragmentierung und Zellsolubilisierung von Proben im Hochdurchsatzverfahren.Das Multi-Well-Ultraschallgerät UIP400MTP für den Einsatz in Hochdurchsatzumgebungen bringt die Vorbereitung von FFPE-Proben auf ein neues Niveau. Diese Multiwell-Plattenbeschallungsmethode bietet eine effiziente und zuverlässige Lösung für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben. Sie erleichtert die schnelle und reproduzierbare Extraktion von DNA, RNA und Proteinen, die für verschiedene Analysetechniken wie Next Generation Sequencing (NGS), quantitative PCR und proteomische Analysen entscheidend sind. Die Optimierung der Beschallungsparameter wie Amplitude, Dauer und Temperatur verbessert die Qualität und Quantität der extrahierten Biomoleküle weiter.

Der UIP400MTP-Sonicator für Multiwell-Platten bietet erhebliche Vorteile für die Fragmentierung und Scherung von DNA und RNA aus FFPE-Gewebe. Eines der herausragenden Merkmale dieses Systems ist seine Fähigkeit, schmale Fragmentgrößen von DNA und RNA zu erzielen. Es bietet eine präzise Abstimmbarkeit der Beschallungsintensität, um kurze Fragmente von 150-200 Basenpaaren (bp) oder längere Fragmente von 15-20 Kilobasenpaaren (kbp) zu erhalten. Diese Vielseitigkeit macht das UIP400MTP unentbehrlich für Short-Read- und Long-Read-Sequenzierungsanwendungen und gewährleistet qualitativ hochwertige Ergebnisse für Next-Generation-Sequencing (NGS) und Whole-Genome-Sequencing (WGS). Die präzise Kontrolle der Fragmentgröße ist für Forscher in allen Bereichen der Genomik von entscheidender Bedeutung, da sie die Vorbereitung von Proben gemäß den Spezifikationen ermöglicht.

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Entdecken Sie den UIP400MTP Multiwell-Platten-Sonicator für die effiziente Gewinnung von Biomolekülen aus FFPE-Proben, wobei die Integrität der extrahierten Nukleinsäuren und Proteine erhalten bleibt und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet wird. Diese Technologie lässt sich nahtlos in andere präparative und analytische Arbeitsabläufe integrieren, wodurch molekulare Untersuchungen mit FFPE-Gewebearchiven rationalisiert und verbessert werden.

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Fixiermittel und ihre Wirkungen

Die Fixierung ist ein entscheidender Schritt bei der Probenvorbereitung, der die Zellstrukturen erhält, biochemische Reaktionen stoppt und den Abbau verhindert. Je nach den spezifischen experimentellen Anforderungen werden verschiedene Fixierungsmittel verwendet. Die beiden gebräuchlichsten Fixierungsmittel sind Formaldehyd und Paraformaldehyd, die Proteine und Nukleinsäuren vernetzen und so die Morphologie und Antigenität von Zellen und Geweben bewahren. Andere Fixierungsmittel wie Ethanol, Methanol und Glutaraldehyd werden für spezielle Anwendungen eingesetzt.

Die Fixiermittel Formaldehyd und Paraformaldehyd bilden Methylenbrücken zwischen den Aminogruppen, was zu einer Vernetzung der Proteine führt. Durch diesen Prozess werden zelluläre Komponenten effektiv immobilisiert, so dass ihre Integrität während der nachfolgenden Analyseschritte erhalten bleibt. Die Wirkung dieser Fixierungsmittel kann durch Faktoren wie Konzentration, pH-Wert und Temperatur beeinflusst werden, und die Optimierung dieser Parameter ist entscheidend für die optimale Erhaltung der Zellstrukturen.

 
Vorteile der FFPE-Aufbereitung mit Ultraschall
 

Die Ultraschallbehandlung ist eine leistungsstarke Technik zum Aufbrechen von fixierten Zellen und Geweben, die herkömmlichen Techniken überlegen ist. Sie bietet mehrere bemerkenswerte Vorteile gegenüber herkömmlichen Lyseverfahren:

  • Geschwindigkeit und Effizienz: Die Ultraschalllyse ermöglicht einen schnellen Aufschluss von Zellen und Geweben und verkürzt die Verarbeitungszeit im Vergleich zu mechanischen oder chemischen Lyseverfahren erheblich. Die von der Ultraschallsonde erzeugten Hochfrequenz-Schallwellen erzeugen mechanische Scherkräfte, die zum Aufbrechen der fixierten Zellstrukturen führen. Dieser schnelle und effiziente Aufschluss ermöglicht es den Forschern, große Probenmengen innerhalb eines kurzen Zeitraums zu verarbeiten.
  • Sanft und anpassbar: Die Ultraschall-Lyse bietet einen sanften Aufschlussmechanismus, der die Schädigung empfindlicher Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Enzyme minimiert. Im Gegensatz zu mechanischen Methoden, die übermäßige Hitze oder Scherkräfte erzeugen, nutzt die Ultraschalllyse kontrollierte Kavitation, um Zellen aufzubrechen und dabei die Integrität und Funktionalität der intrazellulären Komponenten zu erhalten.
  • Vielseitigkeit: Die Ultraschalllyse kann mit verschiedenen Fixiermitteln durchgeführt werden, so dass die Forscher mit einem breiten Spektrum an fixierten Proben arbeiten können. Ganz gleich, ob Formaldehyd, Paraformaldehyd oder alternative Fixierungsmittel verwendet werden, die Ultraschalllyse liefert stets einen effizienten Aufschluss, der eine optimale Gewinnung der Zellbestandteile gewährleistet.
  • Hohe Rendite und Qualität: Die Ultraschalllyse ermöglicht eine hohe Ausbeute an intakten Zellbestandteilen, da sie fixierte Zellen und Gewebe gleichmäßig aufbrechen kann. Dies ermöglicht nachgelagerte Anwendungen wie Proteinanalyse, Nukleinsäureextraktion und enzymatische Assays, die zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefern.
  • Automatisierung Kompatibilität: Die Ultraschalllyse lässt sich problemlos in automatisierte Systeme integrieren, was eine Probenverarbeitung mit hohem Durchsatz ermöglicht. Diese Kompatibilität ermöglicht es den Forschern, ihre Arbeitsabläufe zu rationalisieren und die Produktivität zu steigern, insbesondere bei groß angelegten Studien.
96-Well Plate Sonicator UIP400MTP für Zelllyse, DNA-Extraktion, DNA-Fragmentierung, Zellsolubilisierung und Proteinaufreinigung.

Ultraschallgerät für 96-Well-Platten UIP400MTP für die Beschallung von Mikrotiter- und Multiwell-Platten

Die Ultraschalllyse hat den Aufschluss von fixierten Zellen und Geweben revolutioniert und bietet zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Lyseverfahren. Ihre Geschwindigkeit, Effizienz, Selektivität, Vielseitigkeit, hohe Ausbeute und Automatisierungskompatibilität machen sie zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der molekularbiologischen und biotechnologischen Forschung. Hielscher Ultrasonics bietet sowohl berührungslos arbeitende Sonicators als auch Sonicators vom Typ Sonde an und hat damit den passenden Ultraschall-Homogenisator für Ihre Life-Science-Anwendung. Ob Sie Einzelproben, Mehrfachproben oder sehr hohe Probenzahlen gleichzeitig bearbeiten wollen, wir bieten Ihnen den für Ihre Forschungs- und Diagnoseanforderungen am besten geeigneten Ultraschall-Homogenisator.
Lesen Sie mehr über Hielscher berührungslos arbeitende Sonicators für die Probenvorbereitung im Multi- und Hochdurchsatzverfahren!

FFPE-Probenvorbereitung mit dem UIP400MTP Multiwell-Plate Sonicator

  • einmalige Investition
  • Ihr eigenes Verbrauchsmaterial verwenden
  • keine wiederkehrenden Kosten für proprietäres Zubehör und Verbrauchsmaterial
  • hoher Durchsatz
  • Präzisionskontrolle
  • Modernste Technik
  • Zuverlässigkeit & Robustheit
  • einstellbare, präzise Prozesskontrolle
  • Industrietauglich: kann kontinuierlich 24/7 betrieben werden
  • einfach und sicher zu bedienen
  • Geringer Wartungsaufwand

 
Lesen Sie mehr über die Anwendungen von Sonicators in der Biowissenschaft!

Sonicator für die Probenvorbereitung im Hochdurchsatzverfahren! Der Platten-Sonicator UIP400MTP erleichtert die Lyse, Proteinextraktion, DNA-Fragmentierung und Zellsolubilisierung von biologischen Proben in 96-Well-Platten.

Plattenschalldämpfer UIP400MTP für alle 96-Well-Platten, Mikrotiterplatten und Multi-Well-Platten.

Design, Herstellung und Beratung – Qualität Made in Germany

Hielscher Ultraschallgeräte sind bekannt für höchste Qualität und Designstandards. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die problemlose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen sind für Hielscher Ultraschallgeräte kein Problem.

Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt großen Wert darauf, Hochleistungs-Ultraschallgeräte zu entwickeln und zu produzieren, die sich durch modernste Technik und Benutzerfreundlichkeit auszeichnen. Selbstverständlich sind Hielscher Ultraschallgeräte CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.

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Bitte benutzen Sie das untenstehende Formular, um weitere Informationen über das UIP400MTP Multi-Well-Platten-Ultraschallgerät, seine Anwendungen in der FFPE-Probenvorbereitung und Preise anzufordern. Wir freuen uns darauf, Ihre Anwendung in der Genomik und Proteomik mit Ihnen zu besprechen!









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Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung in Multi-Well-Plate

UIP400MTP Ultraschallgerät: FFPE-Probenvorbereitung im Hochdurchsatzverfahren in Multi-Well-Plate



Häufig gestellte Fragen
Im Folgenden beantworten wir häufig gestellte Fragen, die für die Vorbereitung von FFPE-Gewebe und die Ultraschallbehandlung von FFPE-Proben relevant sind.

Wie wird FFPE-Gewebe aufbereitet?

Schritte zur Vorbereitung von FFPE-Gewebe: Die sorgfältige Handhabung und Verarbeitung von Frischgewebe ist entscheidend für die Gewinnung hochwertiger FFPE-Proben. Die Erhaltung der zellulären Architektur, der Nukleinsäuren und der Proteine ist für eine genaue nachgeschaltete Analyse unerlässlich. Jeder Schritt - von der Entnahme bis zur Einbettung - erfordert Präzision, um die Unversehrtheit der Probe für verschiedene Analysen zu erhalten, darunter histologische Untersuchungen, Immunhistochemie und molekulare Studien. Bei ordnungsgemäßer Durchführung dieses Fixierungs- und Einbettungsprozesses wird sichergestellt, dass das konservierte Gewebe den In-vivo-Zustand genau widerspiegelt, so dass zuverlässige Diagnose- und Forschungsergebnisse erzielt werden können.
Wir führen Sie durch die 6 wichtigsten Schritte des Einbettungsprozesses von FFPE-Gewebeproben.

  • Tissue-Kollektion
    Biopsien von lebenden Säugetieren und Gewebekulturen sind beides brauchbare Quellen für die Gewinnung von Frischgewebe für die Aufbereitung von FFPE-Proben.
    Es ist wichtig, eine aseptische Technik anzuwenden: Verwenden Sie sterile Instrumente und Handschuhe, um eine Kontamination zu vermeiden. Idealerweise sollte die Gewebeentnahme in einer sterilen Umgebung erfolgen, z. B. in einem Operationssaal oder einer Laminar-Flow-Haube.
    Da das Präparat sehr zerbrechlich ist, muss es sensibel behandelt werden: Minimieren Sie Verzögerungen bei der Verarbeitung und beginnen Sie sofort nach der Exzision mit der Weiterverarbeitung des Gewebes. Dies ist entscheidend, um Autolyse und Degradation zu verhindern. Halten Sie das Gewebe bei Raumtemperatur; vermeiden Sie das Einfrieren, da dies zu Eiskristallbildung und Gewebeschäden führen kann.
  • Fixierung des Gewebes
    Zunächst wird das Gewebe mit einer Fixierlösung behandelt: Verwenden Sie 10 % neutral gepuffertes Formalin (NBF), das 4 % Formaldehyd in Wasser entspricht und auf einen neutralen pH-Wert gepuffert ist.
    Tauchen Sie das Gewebe vollständig in Formalin ein. Achten Sie auf ein Volumenverhältnis von Fixiermittel zu Gewebe von mindestens 10:1. Die Fixierungszeit beträgt in der Regel 6 bis 24 Stunden, je nach Art und Größe des Gewebes. Es ist wichtig, dass das Fixiermittel gründlich in das Gewebe eindringen kann. Eine Überfixierung kann jedoch zu Vernetzungen führen, die die Antigengewinnung erschweren, während eine Unterfixierung zu einem schlechten Gewebeerhalt führen kann.
  • Tissue Trimming
    Zweitens: Schneiden Sie das Gewebe auf eine Dicke von etwa 3-5 mm zu, damit das Fixiermittel ausreichend eindringen kann. Achten Sie auf die richtige Ausrichtung des Gewebes, um die relevanten histologischen Strukturen zu erfassen. Dies erleichtert die Extraktion, wenn das Gewebe später zur Analyse verwendet wird.
  • Verarbeitung der fixierten Probe
    Nun muss das fixierte Gewebe dehydriert werden: Nach der Fixierung muss das Gewebe dehydriert werden, damit das Paraffin gründlich in das Gewebe eindringen kann. Führen Sie das Gewebe durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (70 %, 80 %, 90 % und 100 %), um Wasser zu entfernen.
    Reinigen mit Xylol: Paraffinwachs ist unlöslich in Wasser, aber löslich in Xylol. Daher muss das Wasser im Gewebe durch Xylol ersetzt werden. Da Xylol selbst wasserunlöslich, aber alkohollöslich ist, ist ein Zwischenschritt erforderlich, bei dem zunächst das Wasser durch Alkohol ersetzt wird: Tauchen Sie das Gewebe in Xylol oder einen Xylol-Ersatz, um das Ethanol zu entfernen und das Gewebe für die Paraffininfiltration vorzubereiten.
    Infiltration mit Paraffin: Einbetten des Gewebes in geschmolzenes Paraffin, um eine vollständige Infiltration zu gewährleisten. Dieser Schritt umfasst in der Regel mehrere Paraffinwechsel, um eine vollständige Imprägnierung sicherzustellen.
  • Einbetten des Gewebes
    In diesem Schritt wird das Gewebe zu einem Gewebeblock geformt: Legen Sie das Gewebe in eine Form mit der gewünschten Ausrichtung und gießen Sie geschmolzenes Paraffin darüber. Lassen Sie das Paraffin durch Abkühlen bei Raumtemperatur oder auf einer Kühlplatte erstarren.
  • Zerlegung und Montage
    Mikrotomie: Zum Schneiden des eingebetteten Gewebes werden mit einem Mikrotom dünne Schnitte (normalerweise 4-5 Mikrometer) aus dem Paraffinblock geschnitten. Anschließend wird die Probe montiert, wobei die Schnitte für die anschließende Färbung und mikroskopische Analyse auf Glasträger gelegt werden.
    Überprüfen Sie schließlich die Qualität der Histologie: Beurteilen Sie die ersten Schnitte unter dem Mikroskop, um eine ordnungsgemäße Fixierung und Verarbeitung sicherzustellen. Passen Sie die Protokolle bei Bedarf je nach Gewebetyp und beobachteter Qualität an.

 
FFPE-Gewebe kann zur Gewinnung von RNA, DNA und Proteinen sowie zur Entdeckung von Anzeichen von Krebs oder anderen Krankheiten verwendet werden. Sie können jahrelang gelagert werden und sind ein wesentlicher Bestandteil der Art und Weise, wie Forscher und Ärzte Gewebeproben für Diagnose und Forschung nutzen.

Was sind die häufigsten Probleme und Herausforderungen bei FFPE-Gewebe?

Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebeproben werden in Forschung und Diagnostik häufig verwendet, stellen jedoch eine Reihe von Herausforderungen und gemeinsamen Problemen dar:

  • Abbau von Biomolekülen: Eine verlängerte Fixierung kann zum Abbau von DNA, RNA und Proteinen führen, was die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren oder Proteine für nachgeschaltete Anwendungen erschwert. Eine korrekte Fixierung (Vermeidung von Unter- und Überfixierung) ist für die Gewebekonservierung unerlässlich.
  • Vernetzungen: Die Fixierung mit Formalin führt zu einer Vernetzung von Proteinen und Nukleinsäuren, die die molekulare Analyse behindern und die Genauigkeit von immunhistochemischen und anderen Tests beeinträchtigen kann.

  • Antigen-Maskierung: Der Fixierungsprozess kann antigene Stellen maskieren, wodurch die Wirksamkeit der Antikörperbindung in der Immunhistochemie und anderen immunologischen Tests verringert wird. Dies erfordert häufig eine Antigenrückgewinnung, ein Verfahren, durch das die Maskierung eines Epitops rückgängig gemacht und die Epitop-Antikörper-Bindung wiederhergestellt wird. Die vollständige Antigenität kann jedoch nicht immer wiederhergestellt werden.
  • Variable Fixierungsqualität: Unterschiedliche Fixierungszeiten und -bedingungen können zu einer uneinheitlichen Probenqualität führen und die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Verwenden Sie zuverlässige Fixierungsprotokolle und vermeiden Sie Unter- und Überfixierung.
  • DNA-Schäden und Fragmentierung: Die Fixierung von FFPE-Proben mit Formalin kann verschiedene Arten von DNA-Schäden verursachen, darunter Cytosin-Desaminierung (C-zu-T-Mutationen), oxidative Schäden (z. B. 8-Oxo-Guanin, das zu G-zu-T-Mutationen führt) sowie physikalische Störungen wie Kerben, Lücken und abasische Stellen, die die Aktivität der DNA-Polymerase behindern. Der Formalin-Fixierungsprozess kann zu einer Fragmentierung der DNA führen, was genetische und genomische Analysen wie PCR und Sequenzierung erschwert.
  • RNA-Qualität: Die aus FFPE-Gewebe extrahierte RNA ist häufig fragmentiert und chemisch modifiziert, was die Durchführung hochwertiger transkriptomischer Analysen erschwert.
  • Proteinveränderungen: Formalin kann chemische Modifikationen in Proteinen hervorrufen, die deren Struktur und Funktion beeinträchtigen, was wiederum proteomische Analysen stören kann.
  • Artefakte der Probenverarbeitung: Beim Einbetten und Schneiden können mechanische Belastungen und Hitze Artefakte verursachen und das Gewebe weiter schädigen.
  • Variabilität von Charge zu Charge: Variationen in den Fixierungs- und Einbettungsprotokollen zwischen verschiedenen Chargen können zu einer erheblichen Variabilität der Ergebnisse führen, was Vergleiche zwischen Studien erschwert.
  • Probleme mit der Lagerung: Die langfristige Lagerung von FFPE-Blöcken kann im Laufe der Zeit zu zusätzlichem Abbau und Verlust der Nukleinsäure-Integrität führen, was die Lebensfähigkeit von Archivproben für retrospektive Studien beeinträchtigt.

Die Verwendung optimierter Protokolle, die sorgfältige Handhabung der Proben und die Anwendung fortschrittlicher Techniken tragen dazu bei, die Qualität und Zuverlässigkeit der aus FFPE-Gewebe gewonnenen Daten zu verbessern.

Was ist der Unterschied zwischen FFPE und gefrorenem Gewebe?

FFPE-Gewebe (Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe) wird mit Formalin konserviert, um das Gewebe zu fixieren, und dann in Paraffinwachs eingebettet, was eine langfristige Lagerung bei Raumtemperatur ermöglicht und die Gewebemorphologie erhält. Im Gegensatz dazu wird gefrorenes Gewebe durch Einfrieren schnell konserviert, wodurch die Integrität von Nukleinsäuren und Proteinen besser erhalten bleibt, aber eine Lagerung bei sehr niedrigen Temperaturen erforderlich ist.

Welche Chemikalien werden für die FFPE-Einbettung verwendet?

Die für die FFPE-Einbettung verwendeten Chemikalien umfassen in der Regel Formalin für die Fixierung und Paraffinwachs für die Einbettung. Für die FFPE-Einbettung werden die Gewebe in der Regel entweder mit 10 % (v/v) neutral gepuffertem Formalin (FA) oder einer frisch zubereiteten 4 % (w/v) Formaldehydlösung (PFA) aus Paraformaldehydpulver fixiert. Formalin, eine Lösung von Formaldehyd in Wasser, ist auf einen neutralen pH-Wert gepuffert, um die Gewebemorphologie zu erhalten und eine übermäßige Vernetzung zu verhindern. Die Lösung auf Paraformaldehyd-Basis sorgt außerdem für eine wirksame Fixierung, indem sie Proteine vernetzt und so die Gewebestruktur für die anschließende Einbettung in Paraffinwachs stabilisiert. Diese Chemikalien sind unerlässlich, um die Integrität und Morphologie des Gewebes während des Fixierungs- und Einbettungsprozesses zu erhalten.

Wie wird das Paraffin aus FFPE-Proben entfernt?

Um Paraffin aus FFPE-Proben zu entfernen, werden die Gewebeschnitte in der Regel einer Reihe von Xylol-Waschungen unterzogen, gefolgt von einer Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von Alkoholen und schließlich Wasser. Da Xylol hochgiftig ist und Gesundheitsrisiken wie Atembeschwerden, Hautreizungen und potenzielle Langzeitwirkungen bei wiederholter Exposition birgt, entwickelt sich die Paraffinentfernung mit Ultraschall in vielen Labors zu einer vielversprechenden Alternative. Bei dieser Methode werden intensive Ultraschallwellen eingesetzt, um Paraffin effizient und sicher zu entfernen, ohne dass giftige Lösungsmittel wie Xylol verwendet werden müssen, wodurch das Risiko für das Laborpersonal verringert und eine sicherere Arbeitsumgebung geschaffen wird.

Wie lange sollte ich meine Gewebe fixieren, um eine gute Qualität der FFPE-Proben zu erhalten?

Allgemeine Empfehlungen für die Fixierungsdauer empfehlen in der Regel eine Fixierung der Gewebeproben in Formalin für 24 bis 48 Stunden. Diese Dauer reicht im Allgemeinen aus, um die Gewebemorphologie und die Zellstrukturen zu erhalten und gleichzeitig eine Überfixierung zu vermeiden, die zu übermäßiger Vernetzung und zum Abbau von Nukleinsäuren und Proteinen führen kann. Die optimale Fixierungszeit kann jedoch je nach Größe und Art des Gewebes variieren, wobei kleinere oder empfindlichere Proben kürzere Fixierungszeiten erfordern. Es ist von entscheidender Bedeutung, ein Gleichgewicht zwischen einer angemessenen Fixierung und der Verhinderung von Gewebeautolyse und -abbau zu finden und gleichzeitig eine längere Fixierung zu vermeiden, die nachgeschaltete Molekularanalysen erschweren könnte.

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