Proteomik-Protokoll: Berührungslose Ultraschallbehandlung verbessert die Aufbereitung von Peptidproben für die Massenspektrometrie
Die Bottom-up-Proteomik hat sich zu einem Eckpfeiler der modernen Biomarker-Entdeckung, der Strukturbiologie und der klinischen Diagnostik entwickelt. Durch die Aufspaltung von Proteinen in Peptide vor der Massenspektrometrie-Analyse (MS) können Forscher eine umfassendere Sequenzabdeckung und eine zuverlässigere Quantifizierung erzielen. Die Aufbereitung hochkomplexer biologischer Proben für die MS stellt jedoch nach wie vor eine technische Herausforderung dar. Jüngste methodische Fortschritte zeigen, wie eine kontrollierte Ultraschallbehandlung – insbesondere mit dem berührungslosen VialTweeter Multi-Tube-Ultraschallgerät und dem UIP400MTP-Mikroplatten-Ultraschallgerät – kann diesen Arbeitsablauf erheblich rationalisieren, die Reproduzierbarkeit verbessern und häufige Engpässe bei den Geräten verhindern.
Hier finden Sie ein detailliertes Protokoll zur Probenvorbereitung, um Peptide in einer für die MS-Analyse geeigneten Größe zu gewinnen.
Für wen eignet sich die berührungslose Ultraschallbehandlung zur Aufbereitung von Peptidproben?
- Bottom-up-Proteomik & Discovery Labs: Forscher, die hochkomplexe Proben für LC-MS- oder MALDI-Workflows aufbereiten und dabei eine konsistente, ertragsreiche Peptidausbeute über verschiedene biologische Matrizen hinweg benötigen.
- S-Trap™ & Sperrung von Benutzern: Teams, die auf die Reinigung mittels Mikrosäulen setzen und eine kontrollierte DNA-Zerkleinerung benötigen, um ein Verstopfen der Säulen zu verhindern und eine reibungslose Probenbeladung sowie Verdauung zu gewährleisten.
- klinisch & Gruppen für translationale Forschung: Laboratorien, die Gewebe, Zellen, Plasma, Serum oder Liquor verarbeiten, wobei die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge und die Unversehrtheit der Proben von entscheidender Bedeutung sind.
- Quantitativ & Zielgruppen für MS Teams: Laboratorien, die strenge Vergleichsstudien durchführen, bei denen wiederverwendbare Ultraschallgeräte das Risiko einer Kreuzkontamination bergen, die die Quantifizierung seltener Peptide beeinträchtigen könnte.
- Zentrale Einrichtungen & Hochdurchsatz-Vorgänge: Gruppen, die mehrere biologische Replikate gleichzeitig verarbeiten und von der Ultraschallbehandlung in geschlossenen Röhrchen oder in Röhrchenblöcken mit dem VialTweeter profitieren, da dadurch die Reinigung der Sonden entfällt, der Zeitaufwand für die manuelle Arbeit reduziert wird und aseptische Bedingungen gewahrt bleiben.
- Elternabend & Forscher auf dem Gebiet der Strukturproteine: Forscher, die eine schonende, temperaturgesteuerte Verarbeitung benötigen, um labile Modifikationen zu erhalten und die Sequenzabdeckung während der Zelllyse und Homogenisierung zu maximieren.
Multi-Sample Sonicator „VialTweeter“ zur kontaktlosen Probenvorbereitung mehrerer versiegelter Vials für die Proteomik
Protokollübersicht: Vom Gewebe und den Zellen bis hin zu MS-tauglichen Peptiden
Der von Wojtkiewicz et al. beschriebene und weit verbreitete Bottom-up-Proteomik-Workflow bietet eine robuste, skalierbare Methode zur Aufbereitung von Peptidproben aus verschiedenen biologischen Matrizen. Ausgehend von 50–100 mg schockgefrorenem Gewebe oder 1–20 Millionen Zellen nutzt das Protokoll die Suspension-Trapping-Technologie (S-Trap™), um Detergenzien, Salze und Verunreinigungen vor dem enzymatischen Aufschluss effizient zu entfernen.
Nach der Lyse, der Proteinquantifizierung, der Reduktion und der Alkylierung wird die Probe angesäuert und auf eine S-Trap™-Spin-Säule aufgetragen, wo der Trypsin/LysC-Verdau stattfindet. Die entstandenen Peptide werden eluiert, getrocknet und einer LC-MS-Analyse unterzogen. Bei Anwendung auf 50 mg menschliches Herzgewebe liefert dieser Arbeitsablauf durchweg ausreichend Peptide für 30–40 Injektionen, wodurch pro Durchlauf über 4.000 einzigartige Proteine identifiziert werden. Während die chemischen Schritte und die säulenbasierte Aufreinigung genau definiert sind, hängt der Erfolg der Pipeline stark von den anfänglichen Schritten der physikalischen Zerkleinerung und dem Umgang mit der DNA ab.
Das Protokoll empfiehlt die Verwendung des VialTweeter Multi-Tube Sonicators zur Ultraschallbehandlung zum Aufbrechen der Zellen und zum Aufschneiden der DNA. – Beide Schritte sind für die Peptidanalyse von entscheidender Bedeutung.
Der VialTweeter versetzt verschlossene 1,0-, 1,5- und 2,0-ml-Eppendorf-Röhrchen sowie verschiedene NUNC-Fläschchen einer Ultraschallbehandlung
Ultraschall-Zell- und Gewebelyse zur Proteinextraktion
Im Bottom-up-Proteomik-Workflow ist die Ultraschallbehandlung ein entscheidender Schritt bei der Lyse von Zellproben, um Proteine für die anschließende Massenspektrometrie-Analyse zu extrahieren. Nach Zugabe von SDS-Zelllysepuffer zum Zellpellet werden die Proben mit dem VialTweeter Multi-Tube-Ultraschallgerät einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Das Protokoll sieht die Verwendung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor und legt fest, dass der Ultraschallapparat 10 Sekunden lang bei 30 % Leistung läuft, gefolgt von 10 Sekunden Pause, wobei dieser Zyklus dreimal wiederholt wird. Nach einer Wartezeit von 1 Minute wird der Zyklus noch zweimal wiederholt. Die Proben werden dabei kontinuierlich mit Eis gekühlt.
Dieser Prozess trägt nicht nur zur Aufbrechung der Zellen bei, sondern ist insbesondere erforderlich, um die bei der Lyse freigesetzte genomische DNA zu zerschneiden. Ein effektives Zerschneiden der DNA ist entscheidend, um die Viskosität der Probe zu verringern und ein Verstopfen der S-Trap™-Säulen zu verhindern, wodurch eine optimale Proteinausbeute und eine zuverlässige nachgelagerte Peptidverdauung gewährleistet werden.
Die entscheidende Rolle der DNA-Zerkleinerung mittels Ultraschall
Eines der häufigsten Probleme bei S-Trap™-basierten Arbeitsabläufen ist die Verstopfung der Säule, die fast ausschließlich durch hochmolekulare genomische DNA verursacht wird, die bei der Homogenisierung von Zellen oder Gewebe freigesetzt wird. Intakte DNA erhöht die Viskosität der Probe erheblich, bindet Peptide und verstopft das mikroporöse S-Trap™-Sorptionsbett.
Die Ultraschallbehandlung löst dieses Problem, indem sie die DNA mechanisch in kleine, lösliche Fragmente zerlegt. Durch die Einwirkung kontrollierter akustischer Energie zerkleinert der VialTweeter Nukleinsäuren effizient, ohne übermäßige Wärme zu erzeugen oder Fremdstoffe einzubringen. Diese Verringerung der Viskosität gewährleistet eine reibungslose Probenzuführung, gleichmäßige Durchflussraten und eine unterbrechungsfreie Verdauungskinetik.
Optimierte VialTweeter-Ultraschallparameter
Das Protokoll legt ein hochgradig reproduzierbares Ultraschallverfahren fest, das auf die Erhaltung der Integrität biologischer Proben und die Kompatibilität mit nachfolgenden MS-Verfahren optimiert ist. Für Proben in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die mit dem berührungslosen Block-Ultraschallgerät „Hielscher VialTweeter“ behandelt werden, sorgen die folgenden Parameter für eine Lyse und eine optimale DNA-Zerschneidung unter Wahrung der Proteinstruktur:
- Amplitude: 30 % der Leistung
- Zyklusmuster: 10 Sekunden EIN / 10 Sekunden AUS
- Dauer: 3 Zyklen (10 Sek. EIN/10 Sek. AUS) → 1 Minute Pause auf Eis → noch 2 Mal wiederholen
- Temperaturmanagement: Die Proben werden während der Verarbeitung auf Eis gelegt, um eine thermische Denaturierung und eine vorzeitige Enzymaktivität zu verhindern.
Dieses Verfahren der gepulsten Ultraschallbehandlung verhindert eine lokale Überhitzung, minimiert die Oxidation der Peptide und gewährleistet eine gleichmäßige akustische Einwirkung auf alle Fläschchen. Durch den geschlossenen Röhrenaufbau entfällt zudem die Notwendigkeit, die Sonde zwischen den Proben zu reinigen, was den Zeitaufwand und die Bedienerabhängigkeit drastisch reduziert.
Wesentliche Vorteile für moderne Proteomik-Workflows
Die Integration des VialTweeter in Ihre Bottom-up-Proteomik-Pipeline bietet zahlreiche operative und wissenschaftliche Vorteile:
- Konsistente DNA-Fragmentierung: Eine gleichmäßige Zufuhr von Schallenergie in alle Fläschchen gewährleistet eine reproduzierbare Viskositätsreduktion und verhindert Schwankungen zwischen den Chargen bei der Beladung des S-Trap™.
- Erhaltung labiler Modifikationen: Die Verarbeitung bei niedrigen Temperaturen in einem Eisbad schützt posttranslationale Modifikationen (PTMs) und verhindert eine hitzebedingte Proteinaggregation während der Zelllyse.
- Optimierte nachgelagerte Verarbeitung: Mit VialTweeter aufbereitete Lysate können direkt durch Zentrifugation geklärt und ohne zusätzliche Aufreinigungsschritte quantifiziert werden, was den Weg zum S-Trap™-Verdau beschleunigt.
- Skalierbarkeit & Flexibilität: Die gleichen Ultraschall-Einstellungen gelten sowohl für hochkomplexe Gewebeproben als auch für Zellsuspensionen und unterstützen damit Arbeitsabläufe in den Bereichen Discovery-Proteomik, gezielte Quantifizierung und Glykoproteomik. Die Hielscher-Mikroplatten-Ultraschallgeräte ermöglichen eine einfache Skalierung auf große Probenmengen in Multi-Well-Platten.
Der berührungslose Multi-Tube-Sonicator „VialTweeter“ kann in Kühlschränken betrieben werden
Ultraschallgeräte für die proteomische Probenvorbereitung
Die Aufbereitung hochwertiger Peptidproben für die Massenspektrometrie erfordert mehr als nur eine effiziente Lyse – Dies erfordert eine präzise Steuerung der DNA-Zerkleinerung, der Temperatur und der Kontaminationsprävention. Durch die Einbindung des Hielscher VialTweeter in Ihren Bottom-up-Proteomik-Workflow können Sie eine Verstopfung des S-Trap™ verhindern, eine reproduzierbare Proteinausbeute gewährleisten und die für empfindliche MS-Analysen erforderliche Reinheit aufrechterhalten. Ganz gleich, ob Sie menschliches Gewebe, kultivierte Zellen oder komplexe Lysate verarbeiten – die Ultraschall-Blockverarbeitung bietet die Zuverlässigkeit, Skalierbarkeit und Prozesskontrolle, die moderne Proteomik-Labore erfordern.
Um auf größere Probenmengen umzustellen, nutzen Sie die Vorteile der fokussierten, berührungslosen Mikroplatten-Ultraschallgeräte von Hielscher, die Modelle UIP400MTP und UIP550MTP! Verarbeiten Sie jede gängige Multiwell-Platte für die Hochdurchsatz-Proteomik!
Verarbeitung in geschlossenen Röhren im Vergleich zu herkömmlichen Sonden-Ultraschallgeräten
Bislang haben Forscher zur DNA-Zerkleinerung auf Ultraschallgeräte mit Direktkontakt-Sonde zurückgegriffen. Diese Sondensysteme sind zwar effektiv, bringen jedoch einige entscheidende Einschränkungen für Proteomik-Arbeitsabläufe mit sich:
- Risiko einer Kreuzkontamination: Die Wiederverwendung einer Sonde für mehrere Proben führt zu Aerosolübertragungen und verursacht Kreuzkontaminationen, die die quantitativen MS-Ergebnisse verfälschen.
- Probenverlust: Das direkte Einbringen kann zu Spritzern, Verdunstung und dem Anhaften wertvoller Peptide an der Sondenoberfläche führen.
- Reinigung: Eine gründliche Dekontamination der Sonden zwischen den Durchläufen ist zeitaufwendig und oft unvollständig, was Untersuchungen an Proteinen mit geringer Häufigkeit beeinträchtigt.
Der VialTweeter-Block-Ultraschallapparat verarbeitet Proben vollständig in versiegelten Mikrozentrifugenröhrchen. Dieses geschlossene System verhindert den Kontakt zwischen Sonde und Probe, beugt der Bildung von Aerosolen vor und gewährleistet während des gesamten Homogenisierungs- und Lyseprozesses streng aseptische Bedingungen. Für Labore, die hochkomplexe Gewebelysate oder mehrere Zelllinien verarbeiten, bedeutet dies sauberere MS-Daten, eine höhere Peptidausbeute und zuverlässigere biologische Replikate.
Skalierung auf die Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz in Multiwell-Platten
Mit den Mikroplatten-Ultraschallgeräten der Modelle UIP400MTP und UIP550MTP, lässt sich die Röhrchenverarbeitung problemlos auf die Probenverarbeitung mit hohem Durchsatz in jeder handelsüblichen Mehrfach-Well-Platte skalieren.
Multiwell-Platten-Sonicator UIP400MTP für die Proteinextraktion aus Proben im Hochdurchsatzverfahren
Häufig gestellte Fragen zur Ultraschallbehandlung bei der Aufbereitung von Peptidproben
Warum ist vor der Aufbereitung von S-Trap™-Peptiden eine Ultraschallbehandlung erforderlich?
Eine Ultraschallbehandlung ist erforderlich, um hochmolekulare genomische DNA, die bei der Zell- oder Gewebelyse freigesetzt wird, zu zerschneiden. Intakte DNA erhöht die Viskosität der Probe drastisch, was zur Verstopfung der S-Trap™-Mikrosäule und zum Einfangen von Peptiden führen kann, wodurch die Ausbeute und die MS-Kompatibilität erheblich beeinträchtigt werden.
Inwiefern verbessert der VialTweeter-Block-Ultraschallapparat die Probenvorbereitung im Vergleich zu herkömmlichen Sonden-Ultraschallgeräten?
Im Gegensatz zu Ultraschallgeräten mit Direktkontakt-Sonde, die zwischen den Durchläufen sorgfältig gereinigt werden müssen und bei denen die Gefahr einer Aerosolübertragung besteht, verarbeitet der VialTweeter die Proben vollständig in versiegelten Fläschchen und Mikrozentrifugenröhrchen. Diese geschlossene Röhrchenkonstruktion verhindert Kreuzkontaminationen, beugt Probenverlusten vor und gewährleistet während der gesamten Homogenisierung und Zelllyse streng aseptische Bedingungen.
Was sind die optimalen Ultraschallparameter für die Probenvorbereitung in der Proteomik?
Für biologische Proben wie Zellen und Gewebe sieht das empfohlene Protokoll die Verwendung eines VialTweeter-Ultraschallgeräts bei 30 % Leistung mit einem Zyklus von 10 Sekunden Ein- und 10 Sekunden Ausschaltzeit vor, der dreimal wiederholt wird. Die Proben sollten während der Aufbereitung auf Eis gehalten werden, und der Zyklus sollte bei einer Aufbereitung von ≥5 Millionen Zellen noch zweimal wiederholt werden. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Was soll ich tun, wenn meine S-Trap™-Säule während der Probenbeladung verstopft?
Ein Verstopfen der Säule wird in der Regel durch eine hohe Viskosität der DNA oder eine unzureichende Klärung verursacht. Um dies zu beheben, zentrifugieren Sie Ihr Lysat vor dem Pipettieren gründlich und stellen Sie sicher, dass die DNA durch Ultraschallbehandlung ausreichend zerkleinert wird.
Inwiefern kommt die berührungslose Ultraschallbehandlung den Arbeitsabläufen in der quantitativen Proteomik zugute?
In quantitativen Untersuchungen können selbst geringste Kreuzkontaminationen zwischen Proben die Messungen von Peptiden mit geringer Konzentration verfälschen. Das geschlossene Mehrfachröhrchen-Verfahren des VialTweeter macht das Einführen einer Sonde überflüssig, gewährleistet die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge und bewahrt die Probenintegrität für genaue Vergleichsanalysen.
Welche Proteinausbeute und welche MS-Tiefe kann ich bei diesem Protokoll erwarten?
Ausgehend von 50 mg menschlichem Herzgewebe oder 5 Millionen Zellen liefert der S-Trap™-Workflow in der Regel ausreichend Peptide für 30–50 LC-MS-Injektionen und identifiziert dabei durchweg über 4.000 einzigartige Proteine pro Durchlauf. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatur / Literaturhinweise
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics liefert leistungsstarke berührungslose Ultraschallgeräte für die Probenvorbereitung und klinische Analyse. Der Multi-Well-Platten-Ultraschallapparat UIP400MTP, der VialTweeter, der CupHorn und der Durchfluss-Ultraschallapparat GDmini2 bearbeiten die Proben, ohne sie zu berühren.