Proteomik-Protokoll: Kontaktlose Ultraschallbehandlung verbessert die Aufbereitung von Peptidproben für die Massenspektrometrie
Die Bottom-up-Proteomik ist zu einem Eckpfeiler der modernen Biomarkerentdeckung, Strukturbiologie und klinischen Diagnostik geworden. Durch den Verdau von Proteinen zu Peptiden vor der massenspektrometrischen Analyse (MS) können Forschende eine höhere Sequenzabdeckung und eine zuverlässigere Quantifizierung erreichen. Die Vorbereitung hochkomplexer biologischer Proben für die MS bleibt jedoch technisch anspruchsvoll. Aktuelle methodische Fortschritte zeigen, wie eine kontrollierte Ultraschallbehandlung – insbesondere mit dem kontaktlosen Mehrgefäß-Ultraschallgerät VialTweeter und dem Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP – diesen Arbeitsablauf erheblich vereinfachen, die Reproduzierbarkeit verbessern und häufige Engpässe bei der Gerätenutzung verhindern kann.
Hier finden Sie ein detailliertes Protokoll zur Probenvorbereitung, um Peptide geeigneter Größe für die MS-Analyse zu erhalten.
Wer sollte die kontaktlose Ultraschallbehandlung zur Aufbereitung von Peptidproben einsetzen?
- Labore für Bottom-up-Proteomik und explorative Forschung: Forschende, die hochkomplexe Proben für LC-MS- oder MALDI-Arbeitsabläufe vorbereiten und eine gleichbleibende Peptidrückgewinnung mit hoher Ausbeute aus unterschiedlichen biologischen Matrizes benötigen.
- Anwender von S-Trap™ und Suspension Trapping: Teams, die auf eine Aufreinigung mittels Mikrosäulen setzen und eine kontrollierte DNA-Scherung benötigen, um Säulenverstopfungen zu verhindern und eine reibungslose Probenbeladung und einen reibungslosen Verdau sicherzustellen.
- Klinische und translationale Forschungsgruppen: Labore, die Gewebe, Zellen, Plasma, Serum oder Liquor verarbeiten, wobei die Reproduzierbarkeit zwischen Chargen und die Probenintegrität von entscheidender Bedeutung sind.
- Teams für quantitative und gezielte MS: Labore, die strenge Vergleichsstudien durchführen, bei denen Ultraschallgeräte mit Sonotrode Risiken einer Kreuzkontamination mit sich bringen, die die Quantifizierung gering abundanter Peptide beeinträchtigen könnten.
- Zentrale Serviceeinrichtungen und Hochdurchsatzlabore: Gruppen, die mehrere biologische Replikate gleichzeitig verarbeiten und von der Ultraschallbehandlung mehrerer geschlossener Gefäße im Block mit dem VialTweeter profitieren, die eine Reinigung der Sonotrode überflüssig macht, den manuellen Arbeitsaufwand reduziert und aseptische Bedingungen aufrechterhält.
- Forschende zu PTMs und Proteinstrukturen: Forschende, die eine schonende, temperaturkontrollierte Verarbeitung benötigen, um labile Modifikationen zu erhalten und die Sequenzabdeckung während der Zelllyse und Homogenisierung zu maximieren.
Mehrproben-Ultraschallgerät „VialTweeter“ zur kontaktlosen Vorbereitung von Proben in mehreren verschlossenen Gefäßen für die Proteomik
Protokollübersicht: Von Gewebe und Zellen zu MS-tauglichen Peptiden
Der von Wojtkiewicz et al. beschriebene, weit verbreitete Arbeitsablauf der Bottom-up-Proteomik bietet eine robuste, skalierbare Methode zur Aufbereitung von Peptidproben aus unterschiedlichen biologischen Matrizes. Ausgehend von 50–100 mg schockgefrorenem Gewebe oder 1–20 Millionen Zellen integriert das Protokoll die Suspension-Trapping-Technologie (S-Trap™), um Detergenzien, Salze und Verunreinigungen vor dem enzymatischen Verdau effizient zu entfernen.
Nach Lyse, Proteinquantifizierung, Reduktion und Alkylierung wird die Probe angesäuert und auf eine S-Trap™-Zentrifugationssäule aufgebracht, auf der der Verdau mit Trypsin/lysC stattfindet. Die resultierenden Peptide werden eluiert, getrocknet und einer LC-MS-Analyse unterzogen. Bei Anwendung auf 50 mg menschliches Herzgewebe liefert dieser Arbeitsablauf zuverlässig ausreichend Peptide für 30–40 Injektionen, wobei pro Durchlauf über 4.000 unterschiedliche Proteine identifiziert werden. Während die chemischen Schritte und die säulenbasierte Aufreinigung klar definiert sind, hängt der Erfolg der Prozesskette stark vom anfänglichen physikalischen Aufschluss und den Schritten zur Behandlung der DNA ab.
Das Protokoll empfiehlt den Einsatz des Mehrgefäß-Ultraschallgeräts VialTweeter zur Zelllyse und DNA-Scherung durch Beschallung – beide Schritte sind für die Peptidanalyse entscheidend.
Der VialTweeter beschallt verschlossene Eppendorf-Gefäße mit 1,0, 1,5 und 2,0mL sowie verschiedene NUNC-Gefäße
Zell- und Gewebelyse mittels Ultraschall zur Proteinextraktion
Im Arbeitsablauf der Bottom-up-Proteomik ist die Ultraschallbehandlung ein zentraler Schritt bei der Lyse von Zellproben, um Proteine für die anschließende massenspektrometrische Analyse zu extrahieren. Nach der Zugabe von SDS-Zelllysepuffer zum Zellpellet werden die Proben mit dem Mehrgefäß-Ultraschallgerät VialTweeter beschallt. Das Protokoll verwendet 1,5 mL-Mikrozentrifugengefäße und schreibt den Betrieb des Ultraschallgeräts bei 30% Leistung mit 10 Sekunden Einschaltzeit und 10 Sekunden Ausschaltzeit über 3 Zyklen vor. Nach einer Wartezeit von 1 Minute wird der Zyklus zwei weitere Male wiederholt. Die Proben werden kontinuierlich mit Eis gekühlt.
Dieser Prozess unterstützt nicht nur den Zellaufschluss, sondern ist insbesondere notwendig, um die während der Lyse freigesetzte genomische DNA zu scheren. Eine wirksame DNA-Scherung ist entscheidend, um die Probenviskosität zu reduzieren und eine Verstopfung der S-Trap™-Säulen zu verhindern. Dadurch werden eine optimale Proteinrückgewinnung und ein zuverlässiger anschließender Peptidverdau gewährleistet.
Die entscheidende Rolle der DNA-Scherung mittels Ultraschall
Eines der häufigsten Probleme in S-Trap™-basierten Arbeitsabläufen ist die Verstopfung der Säule, die fast ausschließlich durch hochmolekulare genomische DNA verursacht wird, die während der Zell- oder Gewebehomogenisierung freigesetzt wird. Intakte DNA erhöht die Probenviskosität drastisch, hält Peptide zurück und blockiert das mikroporöse S-Trap™-Sorbensbett.
Die Ultraschallbehandlung löst dieses Problem, indem sie DNA mechanisch in kleine, lösliche Fragmente zerlegt. Durch die Anwendung kontrollierter akustischer Energie schert der VialTweeter Nukleinsäuren effizient, ohne übermäßige Wärme zu erzeugen oder Fremdverunreinigungen einzutragen. Diese Viskositätsreduktion gewährleistet eine reibungslose Probenbeladung, gleichbleibende Durchflussraten und eine ungestörte Verdaukinetik.
Optimierte Beschallungsparameter für den VialTweeter
Das Protokoll legt ein hochgradig reproduzierbares Beschallungsschema fest, das auf die Integrität biologischer Proben und die Kompatibilität mit der anschließenden MS-Analyse abgestimmt ist. Für Proben in 1,5mL-Mikrozentrifugengefäßen ermöglichen die folgenden Parameter bei Verwendung des kontaktlosen Block-Ultraschallgeräts Hielscher VialTweeter die Lyse und eine optimale DNA-Scherung unter Erhalt der Proteinstruktur:
- Amplitude: 30% Leistung
- Zyklusschema: 10 Sekunden EIN / 10 Sekunden AUS
- Dauer: 3 Zyklen (10sec EIN/10sec AUS) → 1 Minute Pause auf Eis → 2 weitere Male wiederholen
- Temperaturmanagement: Die Proben werden während der Verarbeitung auf Eis gestellt, um thermische Denaturierung und vorzeitige enzymatische Aktivität zu verhindern
Diese gepulste Ultraschallbehandlung verhindert lokale Überhitzung, minimiert die Peptidoxidation und gewährleistet eine gleichmäßige akustische Einwirkung auf alle Gefäße. Der Aufbau mit geschlossenen Gefäßen macht außerdem die Reinigung einer Sonotrode zwischen den Proben überflüssig und reduziert dadurch den manuellen Arbeitsaufwand und die Bedienerabhängigkeit erheblich.
Wesentliche Vorteile für moderne Proteomik-Arbeitsabläufe
Die Integration des VialTweeter in Ihre Prozesskette für die Bottom-up-Proteomik bietet mehrere praktische und wissenschaftliche Vorteile:
- Gleichmäßige DNA-Fragmentierung: Ein gleichmäßiger Eintrag akustischer Energie in alle Gefäße gewährleistet eine reproduzierbare Viskositätsreduktion und verhindert Unterschiede zwischen Chargen bei der S-Trap™-Beladung.
- Erhalt labiler Modifikationen: Die Verarbeitung bei niedriger Temperatur in einem Eisbad schützt posttranslationale Modifikationen (PTMs) und verhindert wärmeinduzierte Proteinaggregation während der Zelllyse.
- Vereinfachte nachgelagerte Verarbeitung: Mit dem VialTweeter behandelte Lysate können ohne zusätzliche Aufreinigungsschritte direkt durch Zentrifugation geklärt und quantifiziert werden, wodurch der Weg zum S-Trap™-Verdau beschleunigt wird.
- Skalierbarkeit und Flexibilität: Dieselben Beschallungseinstellungen gelten sowohl für hochkomplexe Gewebeproben als auch für Zellsuspensionen und unterstützen Arbeitsabläufe in der explorativen Proteomik, der gezielten Quantifizierung und der Glykoproteomik. Die Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräte von Hielscher ermöglichen eine einfache Skalierung auf große Probenzahlen in Multiwell-Platten.
Das kontaktlose Mehrgefäß-Ultraschallgerät VialTweeter kann in gekühlten Schränken betrieben werden
Ultraschallgeräte für die Probenvorbereitung in der Proteomik
Die Aufbereitung hochwertiger Peptidproben für die Massenspektrometrie erfordert mehr als eine effiziente Lyse – sie verlangt eine präzise Kontrolle der DNA-Scherung, der Temperatur und der Kontaminationsvermeidung. Durch die Integration des Hielscher VialTweeter in Ihren Arbeitsablauf für die Bottom-up-Proteomik können Sie S-Trap™-Verstopfungen verhindern, eine reproduzierbare Proteinrückgewinnung gewährleisten und die für empfindliche MS-Analysen erforderliche Reinheit aufrechterhalten. Ganz gleich, ob Sie menschliches Gewebe, kultivierte Zellen oder komplexe Lysate verarbeiten – die Ultraschallbehandlung im Block bietet die Zuverlässigkeit, Skalierbarkeit und Prozesskontrolle, die moderne Proteomiklabore benötigen.
Nutzen Sie zur Skalierung auf höhere Probenzahlen die fokussierten, kontaktlosen Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräte UIP400MTP und UIP550MTP von Hielscher! Verarbeiten Sie jede gängige Multiwell-Platte für die Hochdurchsatz-Proteomik!
Verarbeitung in geschlossenen Gefäßen im Vergleich zu herkömmlichen Ultraschallgeräten mit Sonotrode
Traditionell haben Forschende für die DNA-Scherung Ultraschallgeräte mit direktem Sonotrodenkontakt eingesetzt. Diese Sonotrodensysteme sind zwar effektiv, bringen jedoch mehrere wesentliche Einschränkungen für Proteomik-Arbeitsabläufe mit sich:
- Risiko einer Kreuzkontamination: Die Wiederverwendung einer Sonotrode für mehrere Proben führt zu einer Verschleppung über Aerosole und trägt Verunreinigungen aus anderen Proben ein, die quantitative MS-Ergebnisse verfälschen.
- Probenverlust: Das direkte Eintauchen kann zu Spritzern, Verdunstung und zum Anhaften wertvoller Peptide an der Sonotrodenoberfläche führen.
- Reinigung: Die gründliche Dekontamination der Sonotrode zwischen den Durchläufen ist zeitaufwendig und häufig unvollständig, was Untersuchungen gering abundanter Proteine beeinträchtigt.
Das Block-Ultraschallgerät VialTweeter verarbeitet Proben vollständig innerhalb verschlossener Mikrozentrifugengefäße. Dieses geschlossene System schließt den Kontakt zwischen Sonotrode und Probe aus, verhindert die Aerosolbildung und hält während der gesamten Homogenisierung und Lyse strikt aseptische Bedingungen aufrecht. Für Labore, die hochkomplexe Gewebelysate oder mehrere Zelllinien verarbeiten, bedeutet dies sauberere MS-Daten, eine höhere Peptidrückgewinnung und zuverlässigere biologische Replikate.
Skalierung auf die Hochdurchsatz-Probenvorbereitung in Multiwell-Platten
Mit den Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräten UIP400MTP und UIP550MTP lässt sich die Verarbeitung in Gefäßen einfach auf die Hochdurchsatz-Probenverarbeitung in jeder gängigen Multiwell-Platte skalieren.
Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP für die Hochdurchsatz-Proteinextraktion aus Proben
Häufig gestellte Fragen zur Ultraschallbehandlung bei der Aufbereitung von Peptidproben
Warum ist vor der Peptidverarbeitung mit S-Trap™ eine Ultraschallbehandlung erforderlich?
Die Ultraschallbehandlung ist notwendig, um hochmolekulare genomische DNA zu scheren, die während der Zell- oder Gewebelyse freigesetzt wird. Intakte DNA erhöht die Probenviskosität drastisch, was zur Verstopfung der S-Trap™-Mikrosäule und zum Einfangen von Peptiden führen kann. Dies verringert die Rückgewinnung und die MS-Kompatibilität erheblich.
Wie verbessert das Block-Ultraschallgerät VialTweeter die Probenvorbereitung im Vergleich zu herkömmlichen Ultraschallgeräten mit Sonotrode?
Im Gegensatz zu Ultraschallgeräten mit direktem Sonotrodenkontakt, die zwischen den Durchläufen sorgfältig gereinigt werden müssen und das Risiko einer Verschleppung über Aerosole bergen, verarbeitet der VialTweeter Proben vollständig innerhalb verschlossener Probengefäße und Mikrozentrifugengefäße. Diese Konstruktion mit geschlossenen Gefäßen verhindert Kreuzkontaminationen und Probenverluste und hält während der gesamten Homogenisierung und Zelllyse strikt aseptische Bedingungen aufrecht.
Welche Beschallungsparameter sind für die Probenvorbereitung in der Proteomik optimal?
Für biologische Proben wie Zellen und Gewebe verwendet das empfohlene Protokoll ein VialTweeter-Ultraschallgerät bei 30% Leistung mit einem Zyklus aus 10 Sekunden Einschaltzeit / 10 Sekunden Ausschaltzeit, der 3 Mal wiederholt wird. Die Proben sollten während der Verarbeitung auf Eis gehalten werden, und der Zyklus sollte zwei weitere Male wiederholt werden, wenn ≥5 Millionen Zellen verarbeitet werden. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Was sollte ich tun, wenn meine S-Trap™-Säule während der Probenbeladung verstopft?
Eine Säulenverstopfung wird typischerweise durch eine hohe, durch DNA verursachte Viskosität oder eine unzureichende Klärung verursacht. Um dies zu beheben, zentrifugieren Sie Ihr Lysat vor dem Pipettieren gründlich und stellen Sie sicher, dass die DNA durch Ultraschallbehandlung ausreichend geschert wird.
Welche Vorteile bietet die kontaktlose Ultraschallbehandlung für Arbeitsabläufe in der quantitativen Proteomik?
In quantitativen Studien können selbst Spuren von Kreuzkontaminationen zwischen Proben die Messung gering abundanter Peptide verfälschen. Die Verarbeitung mehrerer geschlossener Gefäße mit dem VialTweeter macht das Eintauchen einer Sonotrode überflüssig, gewährleistet die Reproduzierbarkeit zwischen Chargen und erhält die Probenintegrität für genaue Vergleichsanalysen.
Welche Proteinausbeute und MS-Analysetiefe kann ich von diesem Protokoll erwarten?
Ausgehend von 50 mg menschlichem Herzgewebe oder 5 Millionen Zellen liefert der S-Trap™-Arbeitsablauf typischerweise ausreichend Peptide für 30–50 LC-MS-Injektionen, wobei zuverlässig über 4.000 unterschiedliche Proteine pro Durchlauf identifiziert werden. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatur / Referenzen
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics bietet leistungsstarke kontaktlose Ultraschallgeräte für die Probenvorbereitung und klinische Analyse. Das Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP, der VialTweeter, der CupHorn und das Durchfluss-Ultraschallgerät GDmini2 verarbeiten die Proben, ohne sie zu berühren.