Mikroplatten-Ultraschallbehandlung in der Shotgun-Proteomik – Anwendungshinweis

Die Shotgun-Proteomik ist auf eine effiziente und reproduzierbare Probenvorbereitung angewiesen, um komplexes biologisches Material in LC-MS/MS-taugliche Peptide umzuwandeln. Der Mikroplatten-Ultraschallapparat UIP400MTP unterstützt diesen Prozess, indem er eine standardisierte, parallele Ultraschallbehandlung von Proben mit geringem Volumen ermöglicht und Laboren dabei hilft, die Zerkleinerung, Extraktion und Resolubilisierung in mikroplattenbasierten Arbeitsabläufen zu verbessern. Dieser Anwendungshinweis beschreibt, wie der UIP400MTP in die proteomische Probenvorbereitung integriert werden kann, wobei ein veröffentlichter Arbeitsablauf für extrazelluläre Vesikel aus PLA2G12A/Th17-Studien als im Labor getestetes Beispiel dient.

Mikroplatten-Ultraschallbehandlung für eine besser reproduzierbare Shotgun-Proteomik

Für Proteomik-Forscher ist eine reproduzierbare Probenvorbereitung entscheidend für qualitativ hochwertige LC-MS/MS-Daten. Der Mikroplatten-Ultraschallapparat UIP400MTP ermöglicht eine standardisierte, parallele Ultraschallbehandlung in plattenbasierten Arbeitsabläufen sowie in Workflows mit kleinen Volumina und hohem Durchsatz.

Es ist besonders nützlich für Labore, die in folgenden Bereichen tätig sind:

• Große Probensätze, die eine einheitliche Verarbeitung über viele Wells hinweg erfordern
• Material mit begrenzter Eingabemenge, bei dem Probenverlust und Schwankungen minimiert werden müssen
• Lipidreiche Proben, wie beispielsweise extrazelluläre Vesikel
• Komplexe biologische Präparate, die eine effiziente Aufschluss-, Extraktions- oder Resolubilisierungsbehandlung erfordern
• Vergleichende Shotgun-Proteomik, bei der die Reproduzierbarkeit über verschiedene Bedingungen und Wiederholungen hinweg von entscheidender Bedeutung ist

Durch die Integration der Mikrotiterplatten-Ultraschallbehandlung vor dem Aufschluss können Forscher die Probenvorbereitung für folgende Zwecke verbessern:

• Proteinextraktion und Resolubilisierung
• Trypsin-/Lys-C-Verdauung
• Nano-LC/MS/MS-Datenerfassung
• Quantitative nachgelagerte Proteomik-Analyse

 

Skalieren Sie Ihre Proteomik-Probenvorbereitung ganz ohne Bedenken!
Erfahren Sie, wie die Mikrotiterplatten-Ultraschallbehandlung dazu beiträgt, manuelle Abweichungen zu reduzieren, die Probenaufschlussqualität zu verbessern und komplexe biologische Proben für eine zuverlässige LC-MS/MS-Analyse vorzubereiten.

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Die Ultraschallbehandlung von Mikrotiterplatten kann folgende Vorteile bieten:

• Proteomik-Zentren
• Forschungslabore für Elektrofahrzeuge
• Laboratorien für Immunologie und Zellbiologie
• Forschungsgruppen im Bereich der translationalen Forschung
• Teams aus dem Bereich der Biowissenschaften, die von der Aufbereitung einzelner Proben auf Workflows mit höherem Durchsatz umsteigen

Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz für die Proteomanalyse extrazellulärer Vesikel

Was ist Shotgun-Proteomik?

Die Shotgun-Proteomik hat sich zu einer zentralen Analysestrategie für die Charakterisierung komplexer biologischer Proben entwickelt, von Ganzzelllysaten und Gewebeextrakten bis hin zu gereinigten Organellen, extrazellulären Vesikeln und klinischen Proben mit geringem Probenvolumen. Seine größte Stärke liegt in der Kombination aus Proteinverdauung, hochauflösender Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie und computergestützter Peptid-zu-Protein-Inferenz. Die Qualität des endgültigen Proteom-Datensatzes wird jedoch bereits lange vor dem Eintritt der Probe in das Massenspektrometer bestimmt. Eine effiziente Probenaufschlämmung, die Solubilisierung der Proteine, die Entfernung von Störsubstanzen, eine reproduzierbare enzymatische Verdauung und eine robuste Peptidgewinnung sind entscheidend für die Abdeckungstiefe und die quantitative Zuverlässigkeit.
Für Proteomik-Forscher und Laboratorien im Bereich der Biowissenschaften, die mit begrenzten oder wertvollen Proben arbeiten, stellt die Probenvorbereitung oft den Engpass dar.

Die Herausforderung durch extrazelluläre Vesikel in der Proteomik

Extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen beispielsweise eine besonders anspruchsvolle Probenklasse dar. Es handelt sich dabei um membranumschlossene, lipidreiche Partikel im Nanobereich mit relativ geringer Proteinausbeute und einem hohen Potenzial für die Übertragung von Lipiden, Salzen, Detergenzien, Serumproteinen und anderen Matrixkomponenten. Diese Eigenschaften können die Effizienz der Verdauung, die chromatographische Leistung, die Elektrospray-Stabilität und die Peptididentifizierung beeinträchtigen. Ein Aufbereitungsworkflow für die EV-Proteomik muss daher leistungsfähig genug sein, um die Vesikelstrukturen aufzubrechen und die Proteine zu solubilisieren, während er gleichzeitig mit der nachgelagerten enzymatischen Verdauung und der LC-MS/MS-Analyse kompatibel bleibt.
In diesem Zusammenhang bietet die mikroplattenkompatible Ultraschallbehandlung einen praktischen Ansatz für eine reproduzierbare, parallelisierte Probenverarbeitung. Die Hielscher-Mikroplatten-Ultraschallgeräte der Modelle UIP400MTP (400 W) und UIP550MTP (550 W) sind für die Ultraschallbehandlung von Proben in Multiwell-Platten und Kleinvolumengefäßen ausgelegt und ermöglichen Arbeitsabläufe mit höherem Durchsatz als herkömmliche Ultraschallgeräte mit einer einzigen Sonde. Für Proteomik-Labore ist dieses Format attraktiv, da es die durch manuelle Eingriffe bedingte Variabilität verringern, die parallele Bearbeitung mehrerer Proben verbessern und sich nahtloser in plattenbasierte Probenvorbereitungsabläufe integrieren lässt.

Beispielhafter Arbeitsablauf

Ein aktueller Proteomik-Workflow mit extrazellulären Vesikeln in der PLA2G12A-gesteuerten Th17-Zellbiologie liefert ein nützliches, im Labor erprobtes Beispiel dafür, wie der Mikroplatten-Ultraschallapparat UIP400MTP in die Probenvorbereitung für die Shotgun-Proteomik integriert werden kann. In dieser Studienreihe wurden EV-Proben für die Proteomanalyse mittels Methanolbehandlung, UIP400MTP-Ultraschallbehandlung, Zentrifugation, Trocknung, Trypsin/Lys-C-Verdauung und Nano-Flow-LC-hochauflösender Tandem-MS aufbereitet. Die gleiche biologische Arbeit wurde zunächst als bioRxiv-Preprint veröffentlicht und anschließend in „Cell Reports“ veröffentlicht, wo die Proteomik-Analyse dazu beitrug, zu charakterisieren, wie PLA2G12A die EV-Frachtproteine im Zusammenhang mit pathogenen T-Zell-Reaktionen verändert.

Multiwell-Platten-Sonicator UIP400MTP

Warum die Ultraschallbehandlung von Mikrotiterplatten?
Der UIP400MTP ermöglicht die standardisierte, parallele Ultraschallbehandlung von Proben mit geringem Volumen. Dies ist besonders dann von Vorteil, wenn Reproduzierbarkeit, geringe Probenmenge und ein hoher Durchsatz bei mehreren Proben wichtig sind.

Checkliste zur Qualitätskontrolle

• Stellen Sie sicher, dass bei allen Proben die gleiche Menge an EV-Proteinäquivalenten zugeführt wird.
• Verwenden Sie randomisierte oder ausgewogene Layouts für die Stichprobenverarbeitung.
• Halten Sie das Methanolvolumen, die Ultraschallbehandlungszeit, die Trocknungszeit und das Aufschlussvolumen konstant.
• Überwachen Sie die Peptidausbeute und die Identifizierung der Gesamtproteine.
• Überprüfen Sie die Rate der verpassten Spaltungen und die Peptidlängenverteilung.
• Überprüfen Sie die Form der chromatographischen Peaks und die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten.
• Fügen Sie Leerzeilen ein, um den Übertrag zu überwachen.
• Verwenden Sie gepoolte Qualitätskontrollproben für größere Studien.
• Den Variationskoeffizienten der Wiederholungen auswerten.
• Verwenden Sie PCA oder ähnliche Verfahren, um Chargeneffekte oder Ausreißer zu identifizieren.

Empfehlungen zur Protokollierung

Bei der Veröffentlichung oder Dokumentation dieses Arbeitsablaufs sind die EV-Eingabemenge, das Plattenformat, das Methanolvolumen, die Amplitude und die Ultraschallbehandlungsdauer des UIP400MTP, die Zentrifugationsbedingungen, die Trocknungsmethode, der Aufschlusspuffer, die Enzymkonzentration, die Aufschlusszeit, die Ansäuerungsbedingungen, LC-MS/MS-Plattform, den Erfassungsmodus, die Softwareversion, die Datenbank, den FDR-Schwellenwert, die Normalisierungsmethode sowie den statistischen Arbeitsablauf an.
Alle Hielscher-Mikroplatten-Ultraschallgeräte zeichnen wichtige Prozessparameter wie Amplitude, Ultraschalldauer und Temperatur automatisch mit Datums- und Zeitstempel als CSV-Datei auf der integrierten SD-Karte auf. Die Datenerfassung für Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle war noch nie so einfach!

Die Studie im Detail: EV-Shotgun-Proteomik in der PLA2G12A-Studie

Die PLA2G12A-Studie liefert ein konkretes Beispiel für den Einsatz von UIP400MTP in einem Shotgun-Proteomik-Workflow. Die biologische Fragestellung lautete, wie die sekretierte Phospholipase PLA2G12A von Th17-Zellen stammende extrazelluläre Vesikel modifiziert und dadurch die Differenzierung pathogener T-Zellen beeinflusst. Die Autoren zeigten, dass PLA2G12A auf die EV-Membranen einwirkt und dabei Lysophospholipide, darunter 1-Oleoyl-Lysophosphatidylethanolamin, bildet, und dass die nachgeschaltete Lysophosphatidsäure-Signalübertragung über LPA2 zur Th17-Differenzierung beiträgt. Über die Lipidsignalisierung hinaus untersuchten die Studien auch die Fracht der extrazellulären Vesikel, einschließlich des RNA- und Proteingehalts, wodurch die Shotgun-Proteomik zu einem wichtigen Bestandteil der Charakterisierungsstrategie wurde.
Im Rahmen des EV-Aufbereitungsablaufs wurden Th17-Zellen in einem Medium kultiviert, das von Exosomen befreites fötales Rinderserum enthielt. Die Kulturüberstände wurden zunächst zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, durch einen 0,22-µm-Filter filtriert, durch Ultrafiltration/Ultrazentrifugation konzentriert, gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels BCA-Proteinassay quantifiziert. Diese vorgelagerte EV-Aufbereitung stellte sicher, dass eine definierte, proteinäquivalente Menge an EV-Material in den Proteomik-Workflow überführt werden konnte.
Für die Shotgun-Proteomanalyse verwendeten die Autoren EV-Proben, die 5 µg Proteinäquivalenten entsprachen. Diese Proben wurden in PCR-Röhrchen getrocknet und mit 25 µL Methanol versetzt. Anschließend wurden die Proben 3 Minuten lang mit dem Mikroplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP beschallt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Proben bei 4 °C 20 Minuten lang bei 19.000 × g zentrifugiert. Nach Entnahme von 20 µL Überstand wurden die Proben bis zur Trockne zentrifugiert. Anschließend wurden die Proteine durch Ultraschallbehandlung in 4 µL einer Trypsin/Lys-C-Lösung mit einer Konzentration von 100 ng/µL in 50 mM Ammoniumbicarbonat gelöst. Die Verdauung erfolgte 2 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei 300 U/min. Das Verdauungsprodukt wurde mit 1 µL 1,25-prozentiger Trifluoressigsäure angesäuert und einer Nano-Flow-LC-hochauflösenden Tandem-Massenspektrometrie unterzogen.
Dieser Arbeitsablauf verdeutlicht mehrere nützliche Grundsätze für die EV-Proteomik mit geringen Ausgangsmengen. Erstens wurde die Ausgangsmenge anhand des Proteinäquivalents normiert, was beim Vergleich von EVs verschiedener Genotypen oder Behandlungen wichtig ist. Zweitens wurde vor der Ultraschallbehandlung Methanol verwendet, was den Aufschluss und die Extraktion unterstützt und gleichzeitig Detergenssysteme vermeidet, die die LC-MS/MS erschweren könnten. Drittens war der Ultraschallschritt kurz und standardisiert, was mit der parallelen Probenverarbeitung vereinbar ist. Viertens wurde der Trypsin/Lys-C-Abbau in einem sehr kleinen Volumen durchgeführt, wodurch die Verdünnung reduziert und die Peptidausbeute bei geringen Ausgangsmengen gefördert wurde. Schließlich minimierte der direkte Übergang vom Abbau zur Ansäuerung und zur LC-MS/MS unnötige Handhabungsschritte.
Bei der nachgeschalteten LC-MS/MS-Methode kam eine Nanofluss-Umkehrphasentrennung in Verbindung mit einem Q-Exactive HF Orbitrap-Massenspektrometer zum Einsatz. Die Proben wurden auf einer C18-Vorsäule aufgefangen und anschließend auf einer Analysesäule mit 50 µm Innendurchmesser bei 200 nL/min und 40 °C getrennt. Der Gradient verlief über 60 Minuten von einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel bis zu 35 % Lösungsmittel B, gefolgt von einer Spülung mit hohem organischem Anteil und einer Re-Equilibrierung. Die MS-Erfassung erfolgte im Positiv-Ionen-Modus unter Verwendung der datenunabhängigen Erfassung mit hochenergetischer Kollisionsdissoziation. Die DIA-Rohdateien wurden mit DIA-NN 1.8 unter Verwendung einer in silico vorhergesagten Spektralbibliothek analysiert.