Ultraschallbehandlung in Mikrotiterplatten für die Shotgun-Proteomik – Anwendungshinweis

Die Shotgun-Proteomik erfordert eine effiziente, reproduzierbare Probenvorbereitung, um komplexes biologisches Material in Peptide umzuwandeln, die für die LC-MS/MS-Analyse geeignet sind. Das Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP unterstützt diesen Prozess durch eine standardisierte, parallele Beschallung kleinvolumiger Proben und hilft Laboren dabei, Aufschluss, Extraktion und Resolubilisierung in mikrotiterplattenbasierten Arbeitsabläufen zu verbessern. Dieser Anwendungshinweis beschreibt, wie das UIP400MTP in die proteomische Probenvorbereitung integriert werden kann. Als im Labor erprobtes Beispiel dient ein veröffentlichter Arbeitsablauf für extrazelluläre Vesikel aus Studien zu PLA2G12A/Th17.

Ultraschallbehandlung in Mikrotiterplatten für eine reproduzierbarere Shotgun-Proteomik

Für die Proteomikforschung ist eine reproduzierbare Probenvorbereitung entscheidend für hochwertige LC-MS/MS-Daten. Das Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP ermöglicht eine standardisierte, parallele Beschallung in plattenbasierten Arbeitsabläufen sowie in Arbeitsabläufen mit kleinen Probenvolumina und hohem Probendurchsatz.

Es ist besonders nützlich für Labore, die mit Folgendem arbeiten:

• Großen Probensätzen, die eine einheitliche Verarbeitung über viele Wells hinweg erfordern
• Material mit geringer Ausgangsmenge, bei dem Probenverluste und Variabilität minimiert werden müssen
• Lipidreichen Proben wie extrazellulären Vesikeln
• Komplexen biologischen Präparationen, die einen effizienten Aufschluss, eine effiziente Extraktion oder Resolubilisierung erfordern
• Vergleichender Shotgun-Proteomik, bei der die Reproduzierbarkeit über verschiedene Bedingungen und Replikate hinweg unerlässlich ist

Durch die Integration einer Ultraschallbehandlung in Mikrotiterplatten vor dem Verdau können Forschende die Proben besser auf folgende Schritte vorbereiten:

• Proteinextraktion und Resolubilisierung
• Trypsin/Lys-C-Verdau
• Nano-LC/MS/MS-Datenerfassung
• Nachgelagerte quantitative Proteomikanalyse

Von der Ultraschallbehandlung in Mikrotiterplatten können profitieren:

• Proteomik-Core-Facilities
• EV-Forschungslabore
• Immunologische und zellbiologische Labore
• Translationale Forschungsgruppen
• Teams in den Biowissenschaften, die von der Vorbereitung einzelner Proben zu Arbeitsabläufen mit höherem Probendurchsatz übergehen

Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz für die Proteomanalyse extrazellulärer Vesikel

Was ist Shotgun-Proteomik?

Die Shotgun-Proteomik hat sich zu einer zentralen analytischen Strategie zur Charakterisierung komplexer biologischer Proben entwickelt, von Ganzzelllysaten und Gewebeextrakten bis hin zu gereinigten Organellen, extrazellulären Vesikeln und klinischen Proben mit geringer Ausgangsmenge. Ihre wesentliche Stärke liegt in der Kopplung von Proteinverdau, hochauflösender Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie und rechnergestützter Ableitung von Proteinen aus Peptiden. Die Qualität des endgültigen Proteomdatensatzes wird jedoch bereits lange vor dem Eintritt der Probe in das Massenspektrometer bestimmt. Ein effizienter Probenaufschluss, die Solubilisierung von Proteinen, die Entfernung störender Substanzen, ein reproduzierbarer enzymatischer Verdau und eine robuste Peptidrückgewinnung sind entscheidend für die Tiefe der Proteomabdeckung und die quantitative Zuverlässigkeit.
Für Forschende in der Proteomik und biowissenschaftliche Labore, die mit begrenzten oder wertvollen Proben arbeiten, ist die Probenvorbereitung häufig der Engpass.

Extrazelluläre Vesikel als Herausforderung in der Proteomik

Extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen beispielsweise eine besonders anspruchsvolle Probenklasse dar. Es handelt sich um membranumhüllte, lipidreiche Partikel im Nanomaßstab mit relativ geringer Proteinausbeute und einem hohen Potenzial für die Verschleppung von Lipiden, Salzen, Detergenzien, Serumproteinen und anderen Matrixkomponenten. Diese Eigenschaften können die Effizienz des Verdaus, die chromatographische Leistung, die Elektrospray-Stabilität und die Peptididentifizierung beeinträchtigen. Ein Arbeitsablauf zur Probenvorbereitung für die EV-Proteomik muss daher wirksam genug sein, um Vesikelstrukturen aufzuschließen und die enthaltenen Proteine zu solubilisieren, und zugleich mit dem nachfolgenden enzymatischen Verdau und der LC-MS/MS-Analyse kompatibel bleiben.
In diesem Zusammenhang bietet eine mit Mikrotiterplatten kompatible Ultraschallbehandlung einen praktischen Ansatz für eine reproduzierbare, parallele Probenverarbeitung. Die Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräte UIP400MTP (400 W) und UIP550MTP (550 W) von Hielscher sind für die Beschallung von Proben in Multiwell-Platten und kleinvolumigen Gefäßen ausgelegt und ermöglichen Arbeitsabläufe mit höherem Probendurchsatz als herkömmliche Ultraschallgeräte mit einer einzelnen Sonotrode. Für Proteomiklabore ist dieses Format attraktiv, weil es die Variabilität manueller Arbeitsschritte reduzieren und die parallele Behandlung mehrerer Proben verbessern kann und sich leichter in plattenbasierte Abläufe zur Probenvorbereitung integrieren lässt.

Beispielhafter Arbeitsablauf

Ein aktueller Arbeitsablauf zur Proteomik extrazellulärer Vesikel aus der PLA2G12A-gesteuerten Th17-Zellbiologie liefert ein nützliches, im Labor erprobtes Beispiel dafür, wie das Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP in die Probenvorbereitung für die Shotgun-Proteomik integriert werden kann. In dieser Studienreihe wurden EV-Proben mittels Methanolbehandlung, Beschallung mit dem UIP400MTP, Zentrifugation, Trocknung, Trypsin/Lys-C-Verdau und Flüssigchromatographie bei Nano-Flussraten gekoppelt mit hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie für die Proteomanalyse verarbeitet. Die biologischen Untersuchungen wurden 2026 von Mochizuki-Ono und Kollegen veröffentlicht. Die Proteomikanalyse trug dabei zur Charakterisierung der Veränderungen bei, die PLA2G12A an den in EVs enthaltenen Proteinen im Zusammenhang mit pathogenen T-Zell-Antworten bewirkt.

Multiwell-Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Warum Ultraschallbehandlung in Mikrotiterplatten?
Das UIP400MTP ermöglicht die standardisierte, parallele Beschallung kleinvolumiger Proben. Dies ist nützlich, wenn Reproduzierbarkeit, eine geringe Probenausgangsmenge und ein hoher Durchsatz bei der Verarbeitung mehrerer Proben wichtig sind.


Checkliste zur Qualitätskontrolle

• Bestätigen Sie, dass die EV-Ausgangsmenge bei allen Proben dem gleichen Proteinäquivalent entspricht.
• Verwenden Sie randomisierte oder ausgewogene Probenanordnungen für die Verarbeitung.
• Halten Sie Methanolvolumen, Beschallungszeit, Trocknungszeit und Verdauvolumen einheitlich.
• Überwachen Sie die Peptidausbeute und die Gesamtzahl der Proteinidentifizierungen.
• Prüfen Sie die Rate verpasster Spaltungen und die Verteilung der Peptidlängen.
• Prüfen Sie die Form der chromatographischen Peaks und die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten.
• Fügen Sie Leerproben hinzu, um Verschleppungen zu überwachen.
• Verwenden Sie bei größeren Studien gepoolte QC-Proben.
• Bewerten Sie den Variationskoeffizienten der Replikate.
• Verwenden Sie PCA oder verwandte Methoden, um Chargeneffekte oder Ausreißerproben zu identifizieren.

Empfehlungen zur Protokollierung

Geben Sie bei der Veröffentlichung oder Dokumentation dieses Arbeitsablaufs die EV-Ausgangsmenge, das Plattenformat, das Methanolvolumen, die Amplitude und Beschallungszeit des UIP400MTP, die Zentrifugationsbedingungen, die Trocknungsmethode, den Verdaupuffer, die Enzymkonzentration, die Verdauzeit, die Ansäuerungsbedingungen, die LC-MS/MS-Plattform, den Erfassungsmodus, die Softwareversion, die Datenbank, den FDR-Schwellenwert, die Normalisierungsmethode und den statistischen Arbeitsablauf an.
Alle Mikrotiterplatten-Ultraschallgeräte von Hielscher zeichnen wichtige Prozessparameter wie Amplitude, Beschallungsdauer und Temperatur automatisch mit Datums- und Zeitstempel als CSV-Datei auf der integrierten SD-Karte auf. Die Datenprotokollierung für Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle war noch nie so einfach!

Die Studie im Detail: EV-Shotgun-Proteomik in der PLA2G12A-Studie

Die PLA2G12A-Studie liefert ein konkretes Beispiel für den Einsatz des UIP400MTP in einem Shotgun-Proteomik-Arbeitsablauf. Die biologische Fragestellung war, wie die sezernierte Phospholipase PLA2G12A extrazelluläre Vesikel aus Th17-Zellen verändert und dadurch die Differenzierung pathogener T-Zellen beeinflusst. Die Autoren zeigten, dass PLA2G12A auf EV-Membranen einwirkt und dabei Lysophospholipide, darunter 1-Oleoyl-Lysophosphatidylethanolamin, erzeugt und dass die nachgeschaltete Lysophosphatidsäure-Signalübertragung über LPA2 zur Th17-Differenzierung beiträgt. Über die Lipidsignalübertragung hinaus untersuchten die Studien auch den Inhalt der EVs, einschließlich des RNA- und Proteingehalts, wodurch die Shotgun-Proteomik zu einem wichtigen Bestandteil der Charakterisierungsstrategie wurde.
Im Arbeitsablauf zur EV-Präparation wurden Th17-Zellen in einem Medium kultiviert, das exosomendepletiertes fetales Rinderserum enthielt. Die Kulturüberstände wurden zunächst zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, durch einen 0,22 µm-Filter filtriert, durch Ultrafiltration/Ultrazentrifugation konzentriert, gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels BCA-Proteinassay quantifiziert. Diese vorgelagerte EV-Präparation stellte sicher, dass eine definierte, einem Proteinäquivalent entsprechende Menge an EV-Material in den Proteomik-Arbeitsablauf eingebracht werden konnte.
Für die Shotgun-Proteomikanalyse verwendeten die Autoren EV-Proben entsprechend 5 µg Proteinäquivalenten. Diese Proben wurden in PCR-Gefäßen getrocknet, und 25 µL Methanol wurden hinzugegeben. Anschließend wurden die Proben 3 Minuten lang mit dem Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP beschallt. Nach der Beschallung wurden die Proben bei 4°C für 20 Minuten bei 19.000 × g zentrifugiert. Nach dem Entfernen von 20 µL Überstand wurden die Proben bis zur Trockne zentrifugiert. Die Proteine wurden anschließend durch Beschallung in 4 µL Trypsin/Lys-C-Lösung mit 100 ng/µL in 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat gelöst. Der Verdau wurde für 2 Stunden bei 37°C unter Schütteln bei 300 rpm durchgeführt. Der Verdauansatz wurde mit 1 µL einer 1,25%igen Trifluoressigsäurelösung angesäuert und mittels Flüssigchromatographie bei Nano-Flussraten gekoppelt mit hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie analysiert.
Dieser Arbeitsablauf verdeutlicht mehrere nützliche Prinzipien für die EV-Proteomik mit geringer Ausgangsmenge. Erstens wurde die Ausgangsmenge anhand des Proteinäquivalents normalisiert, was beim Vergleich von EVs aus unterschiedlichen Genotypen oder Behandlungen wichtig ist. Zweitens wurde vor der Beschallung Methanol eingesetzt, um Aufschluss und Extraktion zu unterstützen und zugleich Detergenssysteme zu vermeiden, die die LC-MS/MS-Analyse erschweren können. Drittens war der Beschallungsschritt kurz und standardisiert, was mit einer parallelen Probenverarbeitung vereinbar ist. Viertens wurde der Trypsin/Lys-C-Verdau in einem sehr kleinen Volumen durchgeführt, wodurch die Verdünnung reduziert und die Peptidrückgewinnung bei geringer Ausgangsmenge unterstützt wurde. Schließlich minimierte der direkte Übergang vom Verdau zur Ansäuerung und LC-MS/MS-Analyse unnötige Handhabungsschritte.
Die nachgelagerte LC-MS/MS-Methode verwendete eine Umkehrphasentrennung bei Nano-Flussraten gekoppelt mit einem Q-Exactive HF Orbitrap-Massenspektrometer. Die Proben wurden auf einer C18-Vorsäule angereichert und anschließend auf einer analytischen Säule mit einem Innendurchmesser von 50 µm bei 200 nL/min und 40°C getrennt. Der Gradient verlief über 60 Minuten von einem niedrigen Anteil an organischem Lösungsmittel bis zu 35% Lösungsmittel B, gefolgt von einem Waschschritt mit hohem Anteil an organischem Lösungsmittel und einer Reäquilibrierung. Die MS-Datenerfassung erfolgte im positiven Ionenmodus mittels datenunabhängiger Erfassung mit kollisionsinduzierter Dissoziation bei höherer Energie. Die DIA-Rohdateien wurden mit DIA-NN 1.8 unter Verwendung einer in silico vorhergesagten Spektralbibliothek analysiert.