Proteomik-Workflows mit Hochdurchsatz-Proteinverdauung

Die Proteomik ist ein wesentlicher Bereich für das Verständnis biologischer Prozesse und Systeme, wobei der Proteinverdau einen entscheidenden Schritt in den Arbeitsabläufen darstellt. Traditionell wird der Proteinverdau in Lösung mit proteolytischen Enzymen wie Trypsin durchgeführt, das Peptidbindungen an Lysin- und Argininresten spezifisch hydrolysiert. Dieser Prozess erzeugt Peptide, die sich gut für die Ionisierung und Fragmentierung in Massenspektrometrie-Anwendungen eignen. Herkömmliche Verdauungsmethoden benötigen jedoch 12-24 Stunden bis zur Fertigstellung, was zu erheblichen Engpässen in proteomischen Arbeitsabläufen führt.
Ultraschall bietet eine leistungsstarke Alternative, die die Aufschlusszeiten von Stunden auf wenige Minuten drastisch verkürzt. In Kombination mit fortschrittlichen Multiproben-Sonikatoren wie dem Hielscher CupHorn, dem VialTweeter und dem 96-Well-Platten-Sonikator UIP400MTP ermöglicht die Ultraschalltechnik eine beschleunigte Proteomik mit hohem Durchsatz. Diese Technologien rationalisieren Arbeitsabläufe, reduzieren die Probenvorbereitungszeit und erhöhen die Effizienz, ohne die Reproduzierbarkeit oder Datenqualität zu beeinträchtigen.

Die Rolle der Ultraschallenergie bei der Proteinverdauung

Bei der Ultraschallbehandlung werden fokussierte Ultraschallwellen eingesetzt, um Kavitation zu erzeugen - lokalisierte Mikrobläschen, die kollabieren und starke Scherkräfte erzeugen. Dieses Phänomen verbessert den Stoffaustausch, fördert die Vermischung von Enzymen mit Substraten und entfaltet Proteinstrukturen, wodurch Spaltstellen für proteolytische Enzyme wie Trypsin freigelegt werden.
Das Ergebnis? Eine deutliche Verkürzung der Aufschlusszeit ohne Beeinträchtigung der Effizienz oder Reproduzierbarkeit.

Ultraschall-unterstützte proteolytische Verdauung: Methodik und Ergebnisse

Protokoll für den beschleunigten Aufschluss

Beim ultraschallunterstützten Aufschluss werden proteolytische Enzyme und Ultraschallenergie kombiniert, um die Arbeitsabläufe zu beschleunigen. Bei Verwendung des Hielscher UP200St-CupHorns (200 W, 26 kHz) läuft der Verdauungsprozess beispielsweise wie folgt ab:

1. Reduktion: Proteinproben (0,5 mg/mL, 20 µL) werden mit DTT (2 µL, 110 mM) in Ammoniumbicarbonatpuffer (12,5 mM) behandelt. Die Sonikation erfolgt bei 50 % Amplitude für 5 Minuten.
2. Alkylierung: Nach Zugabe von IAA (2 µL, 400 mM) wird die Beschallung unter den gleichen Bedingungen wiederholt.
3. Verdauung: Die Proben werden verdünnt und mit immobilisierten Trypsin-Nanopartikeln inkubiert. Eine abschließende Beschallung (5 Minuten) schließt den Verdau ab. Die Peptide werden getrennt, getrocknet und für die MS-Analyse gelagert.

Diese Ultraschallmethode verkürzt die gesamte Vorbereitungszeit von 12 Stunden auf weniger als 30 Minuten. Trotz des beschleunigten Prozesses bleiben die Peptidausbeute und -qualität gleich wie bei den herkömmlichen Übernacht-Methoden.

Effizienz des Proteinaufschlusses mit Ultraschall

In vergleichenden Studien mit E. coli-Proteomen:

• Identifizierung von Proteinen: In ultraschallverdauten Proben wurden 777 Proteine in 5 Minuten identifiziert, verglichen mit 817 in 12 Stunden. Die Identifizierung gemeinsamer Proteine lag bei über 70 %.
• Reproduzierbarkeit: Wiederholungsanalysen ergaben Korrelationswerte von über 98 % innerhalb jeder Methode, was die Zuverlässigkeit belegt.
• Selektivität: Bestimmte Proteine wurden bei jeder Methode bevorzugt verdaut, wobei der Ultraschallverdau 65 Proteine und der Nachtverdau 54 Proteine begünstigte. Solche nuancierten Unterschiede unterstreichen das einzigartige Potenzial der Ultraschallverdauung für spezifische Anwendungen.

Ergebnisse der markierungsfreien Proteinquantifizierung von sieben in einen E. coli gespikten Proteinen
Probe. Die folgenden Proteine wurden in zwei verschiedenen Mengen zugegeben, wie in der Spalte angegeben
als "Theo Ratio" bezeichnet. Das Theo-Verhältnis ist das theoretische Verhältnis zwischen den beiden Ebenen, die in diesem
Experiment. Rinderserumalbumin (ALBU), β-Lactoglobulin (LACB), α-S1-Casein (CASA1),
α-S2-Kasein (CASA2), Cytochrom c (CYC), Ovalbumin (OVAL) und Kohlensäureanhydrase 2
(CAH2). Die Verhältnisse wurden anhand der LFQ-Proteinintensitäten berechnet, die mit MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studie und Grafik: © Martins et al., 2019)

Mit Nanopartikeln immobilisiertes Trypsin

Die Integration von immobilisierten Trypsin-Nanopartikeln (z. B. T-FMNPs) mit Ultraschall verbessert die Arbeitsabläufe in der Proteomik weiter. Diese Nanopartikel bieten eine große Oberfläche für Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, was die Effizienz erhöht. Bei der Anwendung auf komplexe Proteome, wie z. B. E. coli, erzielt die kombinierte Methode folgende Ergebnisse:

• Geschwindigkeit: Vollständige Verdauung innerhalb von 5 Minuten.
• Genauigkeit: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalierbarkeit: Die Anpassung an Multi-Well-Plattformen wie das UIP400MTP ermöglicht eine Verarbeitung mit hohem Durchsatz.

Klicken Sie hier für das detaillierte Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitung!
(vgl. Martins et al., 2019)

Proteolytischer Verdau bei hoher Geschwindigkeit und hohem Durchsatz mit Hielscher-Sonicatoren

Die besten Sonicator-Modelle für die Proteomik

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Sonicators für die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben an, die Arbeitsabläufe mit hohem Durchsatz ermöglichen. Ob Sie mit Vials, Reagenzgläsern, Multi-Well-Platten (z.B. 6-, 24-, 96-Well-Platten) oder Petrischalen arbeiten – bieten wir Ihnen die idealen Sonicators für Ihre Experimente.

UIP400MTP Ultraschallgerät für Microwell-Platten

Für den ultimativen Durchsatz bietet das UIP400MTP die Möglichkeit, 96-Well-Platten mit Ultraschall zu bearbeiten. Das UIP400MTP ist mit jeder Standard-Mikroplatte kompatibel und erfordert keine teuren proprietären Einwegprodukte. Sie haben die Freiheit, die beste Multi-Well-Platte für Ihre Forschung zu wählen. Durch die gleichmäßige Energiezufuhr über die gesamte Platte ermöglicht es die schnelle Reduktion, Alkylierung und den Verdau von bis zu 200 komplexen Proteomen in nur einer Stunde. Dieses Maß an Automatisierung und Effizienz ist für die Hochdurchsatz-Proteomik und klinische Anwendungen entscheidend. Erfahren Sie mehr über den Multiwell-Platten-Sonicator!

VialTweeter

Der VialTweeter ist für Laboratorien konzipiert, die bis zu 10 Fläschchen oder Reagenzgläser gleichzeitig beschallen müssen. Sein nicht-invasiver Ansatz eliminiert das Risiko einer Kreuzkontamination und gewährleistet gleichzeitig einen reproduzierbaren Proteinaufschluss. Dieses Gerät ist ideal für Forscher, die mit begrenzten Probenmengen oder verschiedenen Probentypen arbeiten.
Erfahren Sie mehr über den VialTweeter Mehrröhren-Schallwandler!

Hielscher UP200St-BecherHorn

Der CupHorn-Sonicator ist ein leistungsstarkes Gerät für die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben in versiegelten Behältern. Er gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie und eine präzise Temperaturkontrolle. Die Fähigkeit, bis zu fünf Proben gleichzeitig zu verarbeiten, sowie seine Kompatibilität mit reduzierten, alkylierten und verdauten Arbeitsabläufen machen den CupHorn zu einem zuverlässigen Werkzeug für die MS-basierte Proteomik.
Erfahren Sie mehr über den CupHorn SonoReactor!

Schritt-für-Schritt-Protokoll für ultraschallunterstützte proteolytische Verdauung unter Verwendung von durch Nanopartikel immobilisiertem Trypsin

Dieses Protokoll von Martins et al. (2019) ist für einen schnellen Proteinaufschluss unter Verwendung von Ultraschallenergie und mit Nanopartikeln immobilisiertem Trypsin (T-FMNPs) optimiert. Die skizzierten Schritte gewährleisten eine effiziente Reduktion, Alkylierung und Proteolyse, die für Massenspektrometrie (MS)-Anwendungen geeignet sind.
Protokoll-Schritte

1. Reduktion von Disulfidbindungen
   • Geben Sie 2 µL DTT-Lösung (110 mM) zu den 20 µL Proteinprobe (0,5 mg/mL) in AmBic-Puffer.
   • Platzieren Sie das Probenröhrchen in den Sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Beschallen Sie die Probe 2,5 Minuten lang bei 50 % Amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Legen Sie eine kurze Pause ein, um eine Abkühlung zu ermöglichen, und beschallen Sie dann weitere 2,5 Minuten unter den gleichen Bedingungen.
2. Alkylierung von reduzierten Cysteinresten
   • Geben Sie 2 µL IAA-Lösung (400 mM) zu der reduzierten Proteinprobe.
   • 2,5 Minuten lang bei 50 % Amplitude schallen, um die Alkylierung zu erleichtern.
   • Eine Abkühlpause einlegen und dann weitere 2,5 Minuten beschallen.

   Hinweis: Setzen Sie die alkylierte Probe möglichst wenig Licht aus, um den Abbau von IAA zu verhindern.

3. Verdünnung der Probe
   • Verdünnen Sie die alkylierte Proteinprobe mit 25 mM AmBic-Puffer, der 4% Acetonitril (v/v) enthält, auf ein Endvolumen von 100 µL.
   • Durch vorsichtiges Pipettieren gründlich mischen.
4. Proteolytische Verdauung mit Nanopartikel-immobilisiertem Trypsin
   • Geben Sie 20 µL T-FMNP-Lösung (3 mg/mL) zu der verdünnten Proteinprobe.
   • Beschallen Sie die Mischung im Sonoreaktor 2,5 Minuten lang mit 50 % Amplitude.
   • Eine Abkühlungspause einlegen und dann weitere 2,5 Minuten unter denselben Bedingungen beschallen.
5. Abtrennung von Trypsin-Nanopartikeln
   • Verwenden Sie einen Magneten, um die T-FMNPs von dem Überstand mit den verdauten Peptiden zu trennen.
   • Überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Peptidvorbereitung für die MS-Analyse
   • Trocknen Sie den peptidhaltigen Überstand in einer Vakuumzentrifuge.
   • Lagern Sie die getrockneten Peptide bis zur weiteren Analyse durch Massenspektrometrie bei -20 °C.