Proteomik-Workflows mit Hochdurchsatz-Proteinverdau

Die Proteomik ist ein wesentliches Forschungsgebiet für das Verständnis biologischer Prozesse und Systeme. Der Proteinverdau bildet dabei einen entscheidenden Schritt in den Arbeitsabläufen. Traditionell erfolgt der Proteinverdau in Lösung mithilfe proteolytischer Enzyme wie Trypsin, das spezifisch Peptidbindungen an Lysin- und Argininresten hydrolysiert. Dieser Prozess erzeugt Peptide, die sich gut für die Ionisierung und Fragmentierung in massenspektrometrischen (MS) Anwendungen eignen. Herkömmliche Verdauverfahren benötigen jedoch 12–24 Stunden bis zum Abschluss und verursachen dadurch erhebliche Engpässe in Proteomik-Workflows.
Die Ultraschallbehandlung bietet eine leistungsstarke Alternative und verkürzt die Verdauzeiten drastisch von Stunden auf nur wenige Minuten. In Kombination mit modernen Ultraschallgeräten zur Behandlung mehrerer Proben wie dem Hielscher CupHorn, dem VialTweeter und dem Ultraschallgerät UIP400MTP für 96-Well-Platten ermöglicht sie eine beschleunigte Hochdurchsatz-Proteomik. Diese Technologien vereinfachen die Arbeitsabläufe, verkürzen die Probenvorbereitungszeit und steigern die Effizienz, ohne die Reproduzierbarkeit oder Datenqualität zu beeinträchtigen.

Die Rolle der Ultraschallenergie beim Proteinverdau

Bei der Ultraschallbehandlung werden fokussierte Ultraschallwellen eingesetzt, um Kavitation zu erzeugen – lokal entstehende Mikrobläschen, die kollabieren und dabei starke Scherkräfte erzeugen. Dieses Phänomen verbessert den Stofftransport, fördert die Durchmischung von Enzymen und Substraten und entfaltet Proteinstrukturen, sodass Spaltstellen für proteolytische Enzyme wie Trypsin zugänglich werden.
Das Ergebnis? Eine deutliche Verkürzung der Verdauzeit, ohne die Effizienz oder Reproduzierbarkeit zu beeinträchtigen.

Ultraschallverstärkter proteolytischer Verdau: Methodik und Ergebnisse

Protokoll für beschleunigten Verdau

Der ultraschallunterstützte Verdau kombiniert proteolytische Enzyme mit Ultraschallenergie, um Arbeitsabläufe zu beschleunigen. Beim Einsatz des Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) läuft der Verdau beispielsweise wie folgt ab:

1. Reduktion: Proteinproben (0,5 mg/mL, 20 µL) werden in Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer (12,5 mM) mit DTT (2 µL, 110 mM) behandelt. Die Beschallung erfolgt bei 50% Amplitude für 5 Minuten.
2. Alkylierung: Nach Zugabe von IAA (2 µL, 400 mM) wird die Beschallung unter denselben Bedingungen wiederholt.
3. Verdau: Die Proben werden verdünnt und mit Nanopartikeln mit immobilisiertem Trypsin inkubiert. Eine abschließende Beschallung (5 Minuten) vervollständigt den Verdau. Die Peptide werden abgetrennt, getrocknet und für die MS-Analyse gelagert.

Dieses Ultraschallverfahren verkürzt die gesamte Vorbereitungszeit von 12 Stunden auf unter 30 Minuten. Trotz des beschleunigten Prozesses bleiben Peptidausbeute und -qualität mit denen herkömmlicher Übernacht-Methoden vergleichbar.

Effizienz des ultraschallgestützten Proteinverdaus

In Vergleichsstudien mit E. coli-Proteomen:

• Proteinidentifizierung: In ultraschallverdauten Proben wurden innerhalb von 5 Minuten 777 Proteine identifiziert, verglichen mit 817 in 12 Stunden. Der Anteil der mit beiden Verfahren identifizierten Proteine lag über 70%.
• Reproduzierbarkeit: Wiederholungsanalysen zeigten innerhalb jeder Methode Korrelationswerte über 98%, was die Zuverlässigkeit belegt.
• Selektivität: Bei jeder Methode wurden bestimmte Proteine bevorzugt verdaut: Beim Ultraschallverdau waren es 65 Proteine und beim Verdau über Nacht 54 Proteine. Solche feinen Unterschiede unterstreichen das besondere Potenzial der Ultraschallbehandlung für spezifische Anwendungen.

Ergebnisse der markierungsfreien Proteinquantifizierung von sieben Proteinen, die einer E. coli-
Probe zugesetzt wurden. Die folgenden Proteine wurden in zwei unterschiedlichen Mengen zugesetzt, wie in der Spalte
mit der Bezeichnung „Theo Ratio“ angegeben. Theo Ratio ist das theoretische Verhältnis zwischen den beiden Mengen, die in diesem
Experiment eingesetzt wurden. Rinderserumalbumin (ALBU), β-Lactoglobulin (LACB), α-S1-Casein (CASA1),
α-S2-Casein (CASA2), Cytochrom c (CYC), Ovalbumin (OVAL) und Carboanhydrase 2
(CAH2). Die Verhältnisse wurden anhand der LFQ-Proteinintensitäten berechnet, die aus der MaxQuant-
Analyse gewonnen wurden. Der Student-t-Test wurde angewendet, um die mit jeder Methode erhaltenen Werte zu vergleichen (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Studie und Grafik: © Martins et al., 2019)

An Nanopartikeln immobilisiertes Trypsin

Die Kombination von Nanopartikeln mit immobilisiertem Trypsin (z. B. T-FMNPs) und Ultraschallbehandlung verbessert Proteomik-Workflows zusätzlich. Diese Nanopartikel bieten eine große Oberfläche für Enzym-Substrat-Wechselwirkungen und erhöhen dadurch die Effizienz. Bei der Anwendung auf komplexe Proteome, etwa von E. coli, erreicht die kombinierte Methode Folgendes:

• Geschwindigkeit: Vollständiger Verdau innerhalb von 5 Minuten.
• Genauigkeit: Mit herkömmlichen Methoden vergleichbare Proteinquantifizierung (p > 0,01, n=3).
• Skalierbarkeit: Die Anpassung an Multiwellplattformen wie den UIP400MTP ermöglicht die Verarbeitung mit hohem Probendurchsatz.

Klicken Sie hier für das detaillierte Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitung!
(vgl. Martins et al., 2019)

Schneller proteolytischer Verdau mit hohem Probendurchsatz mit Hielscher Ultraschallgeräten

Die besten Ultraschallgeräte für die Proteomik

Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschallgeräte zur gleichzeitigen Vorbereitung mehrerer Proben an und erleichtert damit Hochdurchsatz-Workflows. Ob Sie mit Vials, Reagenzgläsern, Multiwellplatten (z. B. 6-, 24-, 96-Well-Platten) oder Petrischalen arbeiten – wir bieten Ihnen die idealen Ultraschallgeräte für Ihre Experimente.

UIP400MTP Ultraschallgerät für Multiwellplatten

Für höchsten Probendurchsatz bietet der UIP400MTP die Möglichkeit, 96-Well-Platten mit Ultraschall zu behandeln. Der UIP400MTP ist mit jeder Standard-Mikroplatte kompatibel, benötigt keine teuren proprietären Einwegartikel und gibt Ihnen die Freiheit, die beste Multiwellplatte für Ihre Forschung auszuwählen. Durch die gleichmäßige Energieverteilung über die gesamte Platte ermöglicht er die schnelle Reduktion, Alkylierung und den Verdau von bis zu 200 komplexen Proteomen in nur 1 Stunde. Dieser Grad an Automatisierung und Effizienz ist für die Hochdurchsatz-Proteomik und klinische Anwendungen entscheidend. Erfahren Sie mehr über das Ultraschallgerät für Multiwellplatten!

VialTweeter

Der VialTweeter ist auf Labore zugeschnitten, die bis zu 10 Vials oder Reagenzgläser gleichzeitig beschallen müssen. Sein nichtinvasiver Ansatz beseitigt das Risiko von Kreuzkontaminationen und gewährleistet zugleich einen reproduzierbaren Proteinverdau. Dieses Gerät ist ideal für Forschende, die mit begrenzten Probenvolumina oder unterschiedlichen Probentypen arbeiten.
Erfahren Sie mehr über das VialTweeter Ultraschallgerät zur Behandlung mehrerer Probenröhrchen!

Hielscher UP200St-CupHorn

Das CupHorn-Ultraschallgerät ist ein leistungsstarkes Gerät zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Proben in verschlossenen Behältern. Es gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie und eine präzise Temperaturregelung. Die Möglichkeit, bis zu fünf Proben gleichzeitig zu verarbeiten, macht den CupHorn zusammen mit seiner Eignung für Arbeitsabläufe mit Reduktion, Alkylierung und Verdau zu einem zuverlässigen Werkzeug für die MS-basierte Proteomik.
Erfahren Sie mehr über den CupHorn SonoReactor!

Schritt-für-Schritt-Protokoll für den ultraschallunterstützten proteolytischen Verdau mit an Nanopartikeln immobilisiertem Trypsin

Dieses Protokoll von Martins et al. (2019) ist für den schnellen Proteinverdau mithilfe von Ultraschallenergie und an Nanopartikeln immobilisiertem Trypsin (T-FMNPs) optimiert. Die beschriebenen Schritte gewährleisten eine effiziente Reduktion, Alkylierung und Proteolyse für massenspektrometrische (MS) Anwendungen.
Protokollschritte

1. Reduktion von Disulfidbindungen
   • Geben Sie 2 µL DTT-Lösung (110 mM) zur 20 µL Proteinprobe (0,5 mg/mL) in AmBic-Puffer.
   • Stellen Sie das Probenröhrchen in den Sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Beschallen Sie die Probe für 2,5 Minuten bei 50% Amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Legen Sie eine kurze Pause zum Abkühlen ein und beschallen Sie anschließend unter denselben Bedingungen für weitere 2,5 Minuten.
2. Alkylierung reduzierter Cysteinreste
   • Geben Sie 2 µL IAA-Lösung (400 mM) zur reduzierten Proteinprobe.
   • Beschallen Sie für 2,5 Minuten bei 50% Amplitude, um die Alkylierung zu fördern.
   • Legen Sie eine Pause zum Abkühlen ein und beschallen Sie anschließend für weitere 2,5 Minuten.

   Hinweis: Setzen Sie die alkylierte Probe möglichst wenig Licht aus, um den Abbau von IAA zu verhindern.

3. Probenverdünnung
   • Verdünnen Sie die alkylierte Proteinprobe mit 25 mM AmBic-Puffer, der 4% Acetonitril (v/v) enthält, auf ein Endvolumen von 100 µL.
   • Mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Pipettieren.
4. Proteolytischer Verdau mit an Nanopartikeln immobilisiertem Trypsin
   • Geben Sie 20 µL T-FMNP-Lösung (3 mg/mL) zur verdünnten Proteinprobe.
   • Beschallen Sie die Mischung im Sonoreaktor für 2,5 Minuten bei 50% Amplitude.
   • Legen Sie eine Pause zum Abkühlen ein und beschallen Sie anschließend unter denselben Bedingungen für weitere 2,5 Minuten.
5. Abtrennung der Nanopartikel mit Trypsin
   • Trennen Sie die T-FMNPs mit einem Magneten vom Überstand ab, der die beim Verdau entstandenen Peptide enthält.
   • Überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Peptidvorbereitung für die MS-Analyse
   • Trocknen Sie den peptidhaltigen Überstand in einer Vakuumzentrifuge.
   • Lagern Sie die getrockneten Peptide bis zur weiteren massenspektrometrischen Analyse bei -20°C.