Ultraschallunterstützte Proteinextraktion aus Tumorgewebe – Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur ultraschallunterstützten Proteinextraktion aus Tumorgewebe, die den standardmäßigen CPTAC-Arbeitsablauf zur Harnstofflyse durch einen kontrollierten Beschallungsschritt mit einer Sonotrode während des Gewebeaufschlusses erweitert. Aufbauend auf der etablierten CPTAC-Präparationsstrategie für eine umfassende Proteom- und Phosphoproteomanalyse verbessert diese Modifikation den Aufschluss von Zellen und subzellulären Strukturen, verringert die Probenviskosität und fördert die Freisetzung von Proteinen, die allein durch Harnstofflyse typischerweise schwerer zu gewinnen sind, insbesondere membrangebundene sowie DNA-bindende oder zellkernassoziierte Proteine. In der zugrunde liegenden Studie erhöhte der ultraschallunterstützte Arbeitsablauf die Zahl der nachgewiesenen Proteine und Phosphopeptide und blieb dabei mit den nachgeschalteten Schritten des CPTAC-basierten Arbeitsablaufs kompatibel: Verdau, TMT-Markierung, Fraktionierung, Phosphopeptidanreicherung und LC-MS/MS-Analyse.

Ultraschallunterstützte Proteinextraktion aus Tumorgewebe für eine umfassende proteomische und phosphoproteomische Analyse

Das folgende Protokoll ist für die Extraktion von Proteinen aus kryopulverisiertem Tumorgewebe in einem Lysepuffer mit 8 M Harnstoff optimiert: Ein zusätzlicher Beschallungsschritt mit einer Sonotrode verbessert vor dem Verdau und der anschließenden LC-MS/MS-Analyse die Gewinnung schwer extrahierbarer Proteinklassen, insbesondere membranassoziierter und DNA-/zellkernassoziierter Proteine. In der zugrunde liegenden Studie von Li et al. (2025) erhöhte die zusätzliche Ultraschallbehandlung die Zahl der nachgewiesenen membran- und zellkernassoziierten Proteine und unterstützte im Rahmen ihres Arbeitsablaufs eine umfassende Abdeckung von mehr als 12.000 Proteinen und mehr als 25.000 Phosphopeptiden.

Anwendungsbereich des Protokolls

Verwenden Sie dieses Verfahren für:

• frisch eingefrorenes, kryopulverisiertes Tumorgewebe
• Zellpellets oder andere biologische Proben, für die eine harnstoffbasierte Extraktion bereits etabliert ist
• Arbeitsabläufe für die globale Proteomik und Phosphoproteomik mit tryptischem Verdau und optionaler TMT-Markierung

Die Studie von Li et al. (2025) gibt an, dass der Arbeitsablauf auch auf andere Probentypen wie Zelllinien, Blut und Urin anwendbar ist; je nach Probentyp kann jedoch eine Optimierung erforderlich sein.

Optimierter Arbeitsablauf zur Probenvorbereitung mit integriertem Beschallungsschritt. Der optimierte Arbeitsablauf und das Versuchsdesign basieren auf dem CPTAC-Protokoll zur Probenvorbereitung für die globale proteomische und phosphoproteomische Analyse.
Studie und Schema: ©Li et al., 2025

Funktionsprinzip

In der ursprünglichen Studie wurde der standardmäßige CPTAC-Arbeitsablauf zur Harnstofflyse um eine Ultraschallbehandlung ergänzt und ein verbesserter Nachweis membran- und zellkernassoziierter Proteine festgestellt. Die Autoren weisen darauf hin, dass die Beschallungsparameter hinsichtlich Probengröße und -konzentration fein abgestimmt werden müssen – durch die Wahl der Sonotrodengröße, des Energieeintrags und der zeitlichen Pulssteuerung.

Für die Geräte UP200Ht und UP200St von Hielscher bedeutet dies beispielsweise:

• Amplitude und Pulsmodus als wichtigste Stellgrößen verwenden
• Proben durchgehend kalt halten (d. h. auf Eis)
• mit zurückhaltenden Einstellungen beginnen
• anhand der Klarheit der Probe, der Temperatur, der Proteinausbeute und der Qualität der anschließend gewonnenen Peptide optimieren

 
Die beiden Ultraschallgerätemodelle UP200Ht und UP200St von Hielscher mit jeweils 200 Watt sind für kleine und mittlere Probenvolumina ausgelegt und verfügen über einstellbare Amplituden- und Pulsparameter; beide Ultraschallhomogenisatoren bieten eine digitale Touchscreen-Steuerung zur präzisen Parametereinstellung, automatische Datenaufzeichnung, einen ansteckbaren Temperatursensor, Fernsteuerung und Probenbeleuchtung.
 

Reagenzien für die ultraschallunterstützte Proteinextraktion

Harnstoff-Lysepuffer

Unmittelbar vor Gebrauch frisch ansetzen:

• 8 M Harnstoff
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL Aprotinin
• 10 µg/mL Leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Der Harnstoff muss vor der Zugabe von Zusätzen vollständig gelöst sein; Inhibitoren sollten unmittelbar vor Gebrauch zugesetzt werden; der Puffer sollte auf Eis gehalten werden; nach der Zugabe von Zusätzen wird Schwenken anstelle kräftigen Mischens auf dem Vortexmischer empfohlen.
 

Weitere Reagenzien:

• Reagenzien für den BCA-Proteinassay
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Ameisensäure
• TMT-Reagenzien bei Verwendung multiplexierter quantitativer Proteomik
• IMAC-Reagenzien bei Durchführung einer Phosphopeptidanreicherung

Ausrüstung für die ultraschallunterstützte Proteinextraktion

Erforderlich

Empfohlene Sonotrodenauswahl

Verwenden Sie für Proben von etwa 200–1000 µL eine Sonotrode mit kleinem Durchmesser, die für die direkte Behandlung kleiner Volumina mit hoher Intensität geeignet ist. Hielscher bietet verschiedene Sonotrodendurchmesser an; kleinere Spitzendurchmesser erzeugen eine höhere Intensität an der Spitze.

Praxishinweis: Verwenden Sie die kleinste Sonotrode, die eine effiziente Durchmischung ohne übermäßige Schaumbildung oder Kontakt mit der Gefäßwand ermöglicht.

Wenn Sie mehrere Proben gleichzeitig bearbeiten, kommen dafür das Ultraschallgerät VialTweeter für mehrere Probenröhrchen oder das Mikrotiterplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP infrage!

Schritt-für-Schritt-Anleitung: Ablauf der ultraschallunterstützten Proteinextraktion

A. Vorkühlen und Vorbereiten

1. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4°C.
2. Setzen Sie frischen Harnstoff-Lysepuffer an und halten Sie ihn auf Eis.
3. Montieren Sie das UP200Ht oder UP200St auf einem Stativ innerhalb einer Schallschutzbox.
4. Bereiten Sie ein ausreichend großes Eisbad vor, in dem die Probenröhrchen aufrecht und stabil stehen können.

Das frische Ansetzen des Puffers und die Handhabung unter Kühlung sind entscheidend.

B. Initiale Harnstoffextraktion

1. Halten Sie das kryopulverisierte Gewebe auf Eis.
2. Geben Sie pro 50 mg Feuchtgewebe 200 µL gekühlten Harnstoff-Lysepuffer hinzu.
3. Mischen Sie 5–10 s bei hoher Geschwindigkeit auf dem Vortexmischer.
4. Inkubieren Sie 15 min bei 4°C.
5. Wiederholen Sie den Schritt aus Vortexmischen und Inkubation noch einmal.
6. Zentrifugieren Sie bei 20.000g für 10 min bei 4°C.
7. Überführen Sie das Lysat/den Überstand in ein sauberes Probenröhrchen mit geringer Proteinbindung.

C. Beschallung mit dem UP200Ht oder UP200St

Ausgangsbedingungen für die Beschallung

• Amplitude: mit 20–30% beginnen
• Pulsdauer: 5 s EIN
• Kühlung: 2 min auf Eis zwischen den Pulsen
• Anzahl der Zyklen: 4 Zyklen
• Gesamte aktive Beschallungszeit: 20 s
• Gesamte Prozessdauer einschließlich Kühlung: etwa 8–10 min

Beschallungsschritte

1. Überführen Sie das Lysat in ein für die Beschallung geeignetes Probenröhrchen. Verwenden Sie ein schmales, dünnwandiges Röhrchen, das einen guten Wärmeaustausch und ein sicheres Eintauchen der Sonotrode ermöglicht.
2. Stellen Sie das Röhrchen in ein Eisbad. Die Publikation bezeichnet die Kühlung während der Beschallung als entscheidend, um Hitzeschäden zu vermeiden.
3. Tauchen Sie die Sonotrodenspitze in die Probe ein. Halten Sie die Spitze ausreichend tief eingetaucht, um eine stabile Kavitation zu gewährleisten, lassen Sie sie jedoch weder die Röhrchenwand noch den Boden berühren.
4. Führen Sie einen Puls von 5 s bei der Ausgangsamplitude durch.
5. Bringen Sie die Probe unmittelbar danach für 2 min wieder vollständig auf Eis.
6. Wiederholen Sie dies, bis 4 Zyklen abgeschlossen sind.
7. Prüfen Sie das Lysat nach dem Zyklus.
8. Setzen Sie die Beschallung nur bei Bedarf fort, jeweils mit einem zusätzlichen Puls von 5 s, auf den stets eine vollständige Kühlung folgt.
9. Beenden Sie die Beschallung, sobald das Lysat gleichmäßiger wird und weniger Fäden zieht bzw. weniger viskos ist.
   Der Endpunkt ist ein lichtdurchlässigeres Lysat, das Tropfen bildet, statt einen kontinuierlichen viskosen Flüssigkeitsstrom zu erzeugen.
10. Zentrifugieren Sie bei etwa 16.000g für 15 min bei 4°C.
11. Überführen Sie den geklärten Überstand in ein frisches Probenröhrchen und messen Sie die Proteinkonzentration.

Vergleich der globalen Proteomik und Phosphoproteomik zwischen beschallten und nicht beschallten Proben.
a. Anzahl der identifizierten Proteine (globale Proteomik) in allen PDX-Tumorgeweben mit oder ohne Beschallung. b. Anzahl der identifizierten Phosphopeptide (IMAC-Anreicherung) in allen PDX-Tumorgeweben mit oder ohne Beschallung. Gezählt wurden nur Proteine und Phosphopeptide mit einem Abundanzverhältnis größer oder gleich dem 25. Perzentil. Das Abundanzverhältnis wurde zwischen Proben desselben Typs berechnet.
Studie und Diagramme: ©Li et al., 2025

Nachgeschalteter Verdau und Analyse

Gehen Sie nach der Beschallung und Klärung wie im ursprünglichen CPTAC-basierten Arbeitsablauf beschrieben vor:

1. Verdünnen Sie das Lysat 1:3 (v/v) mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, um die Harnstoffkonzentration auf weniger als 2 M zu senken.
2. Geben Sie LysC in einer Menge von 1 mAU pro 50 µg Protein hinzu und inkubieren Sie 2 h bei 25°C.
3. Geben Sie Trypsin in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1:49 (w/w) hinzu und führen Sie den Verdau über Nacht bei 25°C durch.
4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Ameisensäure auf eine Endkonzentration von 1%.
5. Fahren Sie nach Bedarf mit Entsalzung, TMT-Markierung, Fraktionierung, Phosphopeptidanreicherung und LC-MS/MS fort.

Differentielle Expression von Phosphopeptiden aus MS mit TMT-Markierung.
a. Der basale Subtyp mit Hervorhebung einiger humaner Phosphopeptide (protein-sequence Anfang und Ende), die in beschallten Proben gegenüber nicht beschallten Proben hochreguliert sind. b. Der luminale Subtyp mit Hervorhebung einiger humaner Phosphopeptide (protein_sequence Anfang und Ende), die in beschallten Proben gegenüber nicht beschallten Proben hochreguliert sind. c. Angereicherte KEGG-Signalwege auf Grundlage der Proteine der hochregulierten Phosphopeptide in beschallten Tumoren des basalen Subtyps. d. Angereicherte KEGG-Signalwege auf Grundlage der Proteine der hochregulierten Phosphopeptide in beschallten Tumoren des luminalen Subtyps.
Studie und Diagramme: ©Li et al., 2025

Entwicklung, Fertigung und Beratung – Qualität Made in Germany

Die Ultraschallgeräte von Hielscher sind für höchste Qualitäts- und Designstandards bekannt. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in industrielle Anlagen. Raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen werden von den Ultraschallgeräten von Hielscher problemlos bewältigt.

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Literatur / Referenzen

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.