Hochleistungs-Ultraschall-Anwendungen beim Affenpockenvirus

Hochleistungs-Ultraschall ist ein wichtiges Verfahren zur Isolierung des Affenpockenvirus (MPXV) aus analytischen Proben, zur Fragmentierung der Virus-DNA sowie zur Herstellung von Impfstoffen gegen das Affenpockenvirus. Bei der Probenvorbereitung vor der Diagnostik und Analyse (PCR, ELISA etc.) wird die Ultraschallbehandlung zur Lyse von Zellen eingesetzt, um das Affenpockenvirus aus dem Zellinneren freizusetzen und um die DNA zu fragmentieren. In der Impfstoffherstellung reichen die Anwendungen von der Viruspartikel-/DNA-Herstellung über die Verkapselung in Wirkstoffträgern bis hin zur Formulierung der Inokula.
Nachstehend finden Sie ausführliche Informationen über die ultraschall-gestützte Aufbereitung von Affenpockenvirus-Proben und die ultraschall-gestützte Herstellung von MPXV-Impfstoffen.

 

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Hochleistungs-Ultraschall ist bei der Herstellung vieler Impfstoffe eine wichtige Verarbeitungsmethode.

Dieses System aus 2x 1kW Ultraschallgeräten für den kontinuierlichen Durchfluss ist in einer Impfstoffproduktionsanlage installiert.

Ultraschall-Lyse und DNA-Fragmentierung vor der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Eine Infektion mit dem Affenpockenvirus wird durch Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT) nachgewiesen. Bei diesen Testverfahren werden in Echtzeit bzw. mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einzigartige Sequenzen viraler DNA detektiert. Die Probe (z. B. aus Nasopharyngealabstrichen oder Hautbiopsien) enthält das Virus in Zellen.
Für die Analyse muss das Virus aus den Zellen freigesetzt und die virale DNA fragmentiert werden, um sie für das PCR-Verfahren lesbar zu machen.

Ultraschall-Lyse:

Ultraschallgerät UP200Ht mit Mikrospitze S26d2 für die ultraschall-gestützte Lyse von biologischen ProbenDer Aufschluss / die Lyse von Zellen mittels Ultraschall ist eine zuverlässige und effiziente Methode zur Isolierung von Viren aus Zellproben und damit ein bevorzugtes Verfahren gegenüber der chemischen Lyse, bei der Substanzen wie Lysozym, Proteinase K und verschiedenen Detergenzien als Alternative eingesetzt werden.
Die Verwendung solcher chemischer Reagenzien erfordert jedoch eine zeitaufwändige Probenvorbereitung in mehreren Schritten vor der PCR-Analyse, um eine Hemmung der PCR-Reaktion zu verhindern. Da PCR-Inhibitoren die Effizienz der Amplifikation beeinträchtigen, können kleine Schwankungen in der Menge der Inhibitoren, die nicht entfernt werden, zu großen Schwankungen in der Amplifikation des PCR-Produkts führen (Diaco, 1995).
Der Vorteil der Ultraschall-Lyse besteht darin, dass ein vollständiger Aufschluss der Zellstrukturen und die Freisetzung der DNA ohne die Notwendigkeit von Lysereagenzien und zeitaufwändiger Probenvorbereitung möglich sind. (vgl. Fykse et al., 2003)

DNA-Fragmentierung mit Ultraschall:

Die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall ist einfach und zuverlässig, da die Einstellung der Ultraschallparameter erlaubt, die Länge der DNA-Fragmente (Basenpaare, bp) zu kontrollieren. Mit Hilfe von Ultraschall kann die DNA effektiv auf die gewünschte Länge fragmentiert werden. Die präzise Steuerung der Ultraschallparameter sowie ausgeklügelte Kühloptionen verhindern eine unerwünschte Denaturierung der DNA.
Lesen Sie mehr über die DNA-Fragmentierung mit Ultraschall!

 

Das Video zeigt das Ultraschallsystem UIP400MTP, das die zuverlässige Probenvorbereitung jeder Standard-Multiwell-Platte / Microtiter-Platte mit hochintensivem Ultraschall ermöglicht. Typische Anwendungen des UIP400MTP sind die Lyse, das Scheren von DNA, RNA und Chromatin sowie die Proteinextraktion.

Ultraschallgerät UIP400MTP zur Beschallung von Multiwell-Platten

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Ultraschall-Anwendungen bei der Herstellung von Affenpockenvirus-Impfstoffen

Die Ultraschallbehandlung wird zur Herstellung von Impfstoffen wie z. B. Affenpockenimpfstoffen verwendet. Bei Impfstoffen gegen das Affenpockenvirus handelt es sich derzeit um Lebendvirusimpfstoffe. Neu entwickelte Impfstoffe könnten auch andere Plattformen verwenden, wie z. B. DNA-basierte Impfstoffe. Der derzeitige Impfstoff enthält ein modifiziertes Vaccinia-Ankara-Virus, ein abgeschwächtes, nicht replizierendes Orthopoxvirus. Außerdem enthält er Tris (Tris-Aminomethan) und Natriumchlorid. Der Impfstoff kann auch geringe Mengen an DNA und Proteinen aus Hühnerembryo-Fibroblastenzellen enthalten, diewelche zur Züchtung des Impfstoffvirus verwendet werden, sowie Benzonase und antibiotische Verbindungen wie Gentamicin und Ciprofloxacin.

Die Ultraschall-Homogenisierung wird bei der Herstellung von Impfstoffen mit abgeschwächten Lebendviren, DNA-Impfstoffen, multivalenten DNA-Cocktails, mRNA-Impfstoffen, rekombinanten Proteinimpfstoffen, Impfstoffen mit virusähnlichen Partikeln usw. eingesetzt.

Die Anwendungen von Ultraschall in der Impfstoffherstellung reichen von

  • Dispersion von Viruspartikeln und Erregern
  • Emulgierung
  • Inaktivierung von Viren
  • Wirkstoffträgerformulierung (NLC, SLN)
  • Einkapselung
  • Lösen von Wirkstoffen
  • Herstellung von Adjuvantien
  • Entgasung / Entlüftung

 

Hier finden Sie ausführlichere Informationen über Ultraschallanwendungen für eine verbesserte Impfstoffherstellung!

Protokoll für die Ultraschallisolierung des Affenpockenvirus

Das Forscherteam von Stittelaar (2005) verwendete die Ultraschall-Lyse, um das Affenpockenvirus aus der Zellkultur der Wirtszellen, welche zur Züchtung der Viren genutzt wurden, sowie um aus Probenmaterial von infizierten Primaten freizusetzen.

Affenpocken-Impfstoff-Herstellung:

Affenpockenviren wurden in spezifisch-pathogenfreien Hühnerembryo-Fibroblastenzellen gezüchtet. Nach ein- bis zweitägiger Inkubation wurde die Virus-Zell-Suspension durch einmaliges Auftauen geerntet und anschließend durch Zentrifugation konzentriert. Das Pellet wurde resuspendiert und mit Ultraschall homogenisiert.

Isolierung des Affenpockenvirus aus geimpften Makaken:

Die Proben wurden dreimal aufgetaut und in einem Ultraschall-CupHorn beschallt. Zwei Verdünnungen (1:10 und 1:100) in Transportmedium, das mit 1 % fötalem Rinderserum ergänzt wurde, wurden zur Inokulation von Vero-Zellmonolayern in Sechs-Well-Platten verwendet. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Inokula entfernt und durch mit 1 % fötalem Rinderserum angereichertes Kulturmedium ersetzt. Die Monolayer wurden 5 Tage lang bei 37°C kultiviert und mit einer Kristallviolettlösung angefärbt.
(vgl. Stittelaar et al., 2005)

In diesem Video zeigen wir Ihnen ein 2-Kilowatt-Ultraschallsystem für den Inline-Betrieb in einem mit Stickstoff-spülbaren Schrank. Hielscher liefert Ultraschallgeräte für fast alle Branchen, wie z.B. für die chemische Industrie, Pharmazie, Kosmetik, petrochemische Prozesse sowie für lösungsmittelbasierte Extraktionsverfahren. Dieser spülbare Edelstahlschrank ist für den Betrieb in explosionsgefährdeten Bereichen ausgelegt. Zu diesem Zweck kann der abgedichtete Schrank vom Kunden mit Stickstoff oder Frischluft gespült werden, um zu verhindern, dass brennbare Gase oder Dämpfe in den Schrank gelangen.

2x 1000-Watt-Ultraschallgeräte in einem mit Stickstoff-spülbaren Schrank zur Installation in explosionsgefährdeten Bereichen

Ultraschallgeräte für die Virusanalyse und Impfstoffherstellung

Das breite Produktportfolio von Hielscher Ultrasonics bietet das ideale Ultraschallsystem für Forschungs- und Analyselabore sowie für die industrielle Impfstoffherstellung.
Hielscher Ultrasonics ist spezialisiert auf die Entwicklung, Herstellung und den Vertrieb von Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren und Sono-Bioreaktoren für den Einsatz in Forschungs- und Analyselabors sowie für die industrielle Impfstoffproduktion (z.B. Impfstoffe. , APIs)
Präzise Kontrolle über die Ultraschall-Prozessparameter von Hielscher Ultrasonics' intelligente SoftwareDie Beschallung kann in offenen Behältern, geschlossenen, kontinuierlich gerührten Reaktoren und kontinuierlichen Durchflussreaktoren durchgeführt werden. Alle Komponenten des Ultraschallsystems, welche mit dem flüssigen Medium in Berührung kommen, sind aus rostfreiem Stahl, Titan oder Glas gefertigt. Autoklavierbare Teile und Sanitärarmaturen gewährleisten die Produktion unter Pharmazie-Standards.
Automatische Datenaufprotokollierung: Intelligente Software erfasst die Parameter des Beschallungsprozesses automatisch auf der integrierten SD-Speicherkarte. Die präzise Steuerung aller Prozessparameter stellt die Reproduzierbarkeit, Standardisierung der Produktionund die Einhaltung der Sicherheitsstandards für pharmazeutische Produkte sicher.
Hielscher Ultrasonics‘ Ultraschallprozessoren sind äußerst zuverlässig und lassen sich präzise steuern. Alle Industrie-Ultraschallgeräte können so eingestellt werden, dass sie den gesamten Bereich von niedrigen bis sehr hohen Amplituden abdecken. Die Robustheit der Hielscher-Ultraschallsysteme ermöglicht einen 24/7-Betrieb unter hoher Last und in anspruchsvollen Umgebungen.

In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme:

Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
Multiwell-/Mikrotiterplatten k.A. UIP400MTP
1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 bis 20l 0,2 bis 4l/min UIP2000hdT
10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000hdT
k.A. 10 bis 100l/min UIP16000
k.A. größere Cluster aus UIP16000

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Ultraschallhomogenisatoren sind zuverlässig für die DNA-Fregmentierung

DNA-Scheren mit Ultraschall
Modifizierte Version von Jkwchui gemäß CC-BY-SA.03



Literatur / Literaturhinweise

  • Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
  • Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidovudine in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
  • J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
  • Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
  • Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.

Wissenswertes

Affenpocken-Virus

Affenpocken (MPV, MPXV oder hMPXV) sind eine Spezies von Doppelstrang-DNA-Viren, welche eine virale zoonotische Krankheit verursachen. Diese Krankheit ist als Affenpockeninfektion bekannt und kann bei Menschen sowie bei Tieren auftreten. Es gehört zur Gattung der Orthopoxviren in der Familie der Poxviridae. Das Affenpockenvirus gehört zusammen mit dem Variola-Virus (VARV), dem Kuhpockenvirus (CPX) und dem Vacciniavirus (VACV) zu den menschlichen Orthopoxviren. Orthopoxviren zeichnen sich durch große blockförmige Viruspartikel aus, welche ein doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 200.000 bp enthalten.

ELISA-Assay

ELISA steht für Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay und ist ein Immunoassay mit markierten Komponenten, der als der Goldstandard unter den Immunoassays gilt. ELISA ist ein immunologischer Test, der für seine hohe diagnostische Senistivität geschätzt wird und zum Nachweis und Quantifizierung von Molekülen wie Antikörpern, Antigenen, Proteinen, Glykoproteinen und Hormonen verwendet wird. Das Prinzip von ELISA basiert auf einer Antigen-Antikörper-Interaktion. Bei dieser Antigen-Antikörper-Interaktion binden sich die spezifischen Antikörper an ihr Zielantigen. Nur wenn diese Interaktion stattfindet, kann das Substrat an das Enzym binden und eine anschließende Substratumwandlung beobachtet werden, was zu einem positiven Ergebnis führt.


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Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.