Ultraschallanwendungen beim Affenpockenvirus
Die Ultraschallbehandlung ist ein wichtiges Verarbeitungsverfahren zur Isolierung des Affenpockenvirus (MPXV) aus analytischen Proben, zur Fragmentierung viraler DNA sowie bei der Herstellung von Affenpockenimpfstoffen. Bei der Probenvorbereitung vor Diagnostik und Analyse (PCR, ELISA usw.) wird Ultraschall eingesetzt, um Zellen zu lysieren und dadurch das Affenpockenvirus aus dem Zellinneren freizusetzen und / oder DNA zu fragmentieren. In der Impfstoffproduktion reichen die Anwendungen von der Aufbereitung von Viruspartikeln / DNA über die Verkapselung in Wirkstoffträgern bis zur Formulierung der Inokula.
Nachfolgend finden Sie ausführliche Informationen zur Ultraschallbehandlung von Affenpockenvirusproben bei der Probenvorbereitung sowie zur ultraschallgestützten Herstellung von MPXV-Impfstoffen.
Das finden Sie auf dieser Seite:
- Ultraschalllyse zur Extraktion des Affenpockenvirus
- Ultraschallfragmentierung der DNA des Affenpockenvirus
- Ultraschallanwendungen bei der Herstellung von MPXV-Impfstoffen
Dieses System aus 2x 1kW-Ultraschallgeräten für den kontinuierlichen Durchflussbetrieb ist in einer Anlage zur Impfstoffproduktion installiert.
Ultraschalllyse und DNA-Fragmentierung vor der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Eine Infektion mit dem Affenpockenvirus wird durch Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT) nachgewiesen, bei denen eine Echtzeit- oder konventionelle Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis spezifischer Sequenzen der viralen DNA eingesetzt wird. Die Probe (z. B. aus einem Nasopharyngealabstrich oder aus Hautbiopsien) enthält das Virus in Zellen.
Für die Analyse muss das Virus aus den Zellen freigesetzt und die virale DNA für die PCR fragmentiert werden.
Ultraschalllyse:
Der ultraschallgestützte Zellaufschluss / die Ultraschalllyse ist eine zuverlässige und effiziente Methode zur Isolierung von Viren aus Zellproben und damit ein vorzuziehendes Verfahren gegenüber chemischen Mitteln wie Lysozym, Proteinase K und verschiedenen Detergenzien, die alternativ zur Zelllyse und Freisetzung von DNA eingesetzt werden.
Die Verwendung solcher chemischer Reagenzien erfordert jedoch vor der PCR-Analyse eine zeitaufwendige Probenvorbereitung in mehreren Schritten, um eine Hemmung der PCR-Reaktion zu verhindern. Da PCR-Inhibitoren die Effizienz der Amplifikation beeinträchtigen, können geringe Schwankungen der Menge nicht entfernter Inhibitoren zu großen Schwankungen bei der Amplifikation des PCR-Produkts führen (Diaco, 1995).
Der Vorteil der Ultraschallbehandlung zur Lyse besteht darin, dass ein vollständiger Aufschluss zellulärer Strukturen und die Freisetzung von DNA ohne Lysereagenzien und zeitaufwendige Probenvorbereitung wünschenswert sind. (vgl. Fykse et al., 2003)
DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall:
Die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall ist einfach und zuverlässig, da sie DNA-Fragmente mit einstellbarer Länge (Basenpaare, bp) erzeugt. Mit Ultraschall lässt sich DNA effektiv auf die gewünschte DNA-Länge fragmentieren. Eine präzise Kontrolle der Ultraschallparameter und ausgefeilte Kühlmöglichkeiten verhindern den Abbau der DNA.
Erfahren Sie mehr über die DNA-Fragmentierung mittels Ultraschall!
Ultraschallanwendungen bei Impfstoffen gegen das Affenpockenvirus
Die derzeit gegen das Affenpockenvirus eingesetzten Impfstoffe sind Lebendvirusimpfstoffe. Neu entwickelte Impfstoffe könnten andere Plattformen nutzen, etwa DNA-basierte … Enthält derzeit ein modifiziertes Vaccinia-Ankara-Virus, ein attenuiertes, nicht replizierendes Orthopoxvirus. Es enthält außerdem Tris (Tris-Aminomethan) und Natriumchlorid. Der Impfstoff kann auch geringe Mengen an DNA und Protein aus den Hühnerembryofibroblasten enthalten, die zur Vermehrung des Impfvirus verwendet werden, sowie Benzonase und antibiotische Verbindungen wie Gentamicin und Ciprofloxacin.
Die Ultraschallhomogenisierung wird bei der Herstellung von attenuierten Lebendvirusimpfstoffen, DNA-Impfstoffen, multivalenten DNA-Cocktails, mRNA-Impfstoffen, rekombinanten Proteinimpfstoffen, Impfstoffen auf Basis virusähnlicher Partikel usw. eingesetzt.
- Dispergieren von Viruspartikeln und Wirkstoffen
- Emulgieren
- Inaktivieren von Viren
- Formulieren von Wirkstoffträgern (NLC, SLN)
- Verkapseln
- Lösen von Wirkstoffen
- Herstellen von Adjuvanzien
- Entgasen / Entlüften
Protokoll zur ultraschallgestützten Isolierung des Affenpockenvirus
Das Forschungsteam von Stittelaar (2005) nutzte die Ultraschalllyse, um das Affenpockenvirus sowohl aus der zur Vermehrung verwendeten Wirtszellkultur als auch aus Zellen freizusetzen, die durch Rachenabstriche von infizierten Primaten gewonnen wurden.
Herstellung des Affenpockenimpfstoffs:
Affenpockenviren wurden auf spezifisch pathogenfreien Hühnerembryofibroblasten vermehrt. Nach einer Inkubation von 1 bis 2 Tagen wurde die Virus-Zell-Suspension durch einen Gefrier-Auftau-Zyklus geerntet und anschließend durch Zentrifugation konzentriert. Das Pellet wurde resuspendiert und mehreren Zyklen der Ultraschallhomogenisierung unterzogen.
Isolierung des Affenpockenvirus aus geimpften Makaken:
Die Proben wurden dreimal eingefroren und aufgetaut und in einem Ultraschall-CupHorn beschallt. Zwei Verdünnungen (1:10 und 1:100) in Transportmedium mit einem Zusatz von 1% fötalem Rinderserum wurden zur Inokulation von Vero-Zellmonolayern in Sechs-Well-Platten verwendet. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden die Inokula entfernt und durch Kulturmedium mit einem Zusatz von 1% fötalem Rinderserum ersetzt. Die Monolayer wurden 5 Tage lang bei 37°C kultiviert und mit einer Kristallviolettlösung angefärbt.
(vgl. Stittelaar et al., 2005)
Ultraschallgeräte für die Virusanalyse und Impfstoffproduktion
Das breite Produktportfolio von Hielscher Ultrasonics bietet das ideale Ultraschallgerät für Forschungs- und Analyselabore sowie für die industrielle Impfstoffherstellung.
Hielscher Ultrasonics ist auf die Entwicklung, Herstellung und den Vertrieb von Hochleistungsultraschallgeräten und Sono-Bioreaktoren für den Einsatz in Forschungs- und Analyselaboren sowie für die Integration in die industrielle Impfstoffproduktion spezialisiert (e.g. Impfstoffe, pharmazeutische Wirkstoffe).
Die Beschallung kann in offenen Gefäßen, geschlossenen kontinuierlich gerührten Reaktoren und kontinuierlichen Durchflussreaktoren erfolgen. Alle Teile der Ultraschallsysteme, die mit dem flüssigen Medium in Kontakt kommen, bestehen aus Edelstahl, Titan oder Glas. Autoklavierbare Teile und hygienische Anschlüsse gewährleisten die Produktion unter Bedingungen, die pharmazeutischen Anforderungen entsprechen.
Automatische Datenaufzeichnung: Eine intelligente Software zeichnet die Parameter des Beschallungsprozesses automatisch auf der integrierten SD-Speicherkarte auf. Die präzise Kontrolle aller Prozessparameter gewährleistet die Reproduzierbarkeit, Standardisierung der Produktion und erleichtert die Einhaltung von Standards für die Sicherheit pharmazeutischer Produkte.
Die Ultraschallprozessoren von Hielscher Ultrasonics sind äußerst zuverlässig und lassen sich präzise steuern. Alle industriellen Ultraschallgeräte können so eingestellt werden, dass sie den gesamten Bereich von niedrigen bis sehr hohen Amplituden abdecken. Die Robustheit der Hielscher-Ultraschallsysteme ermöglicht einen 24/7-Betrieb unter hoher Belastung und in anspruchsvollen Umgebungen.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte:
| Chargenvolumen | Volumenstrom | Empfohlene Geräte |
|---|---|---|
| Multi-Well- / Mikrotiterplatten | n/a | UIP400MTP |
| 1 bis 500mL | 10 bis 200mL/min | UP100H |
| 10 bis 2000mL | 20 bis 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 bis 20L | 0,2 bis 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 bis 100L | 2 bis 10L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 bis 100L/min | UIP16000 |
| n/a | höher | Verbund aus UIP16000 |
Kontaktieren Sie uns! / Fragen Sie uns!
DNA-Scherung mittels Ultraschall
Nach Jkwchui unter CC-BY-SA.03
Literatur / Referenzen
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Wissenswertes
Affenpockenvirus
Das Affenpockenvirus (MPV, MPXV oder hMPXV) ist eine Art von doppelsträngigem DNA-Virus, das eine virale Zoonose verursacht. Diese Erkrankung ist als Affenpockeninfektion bekannt und kann bei Menschen und Tieren auftreten. Das Virus gehört zur Gattung Orthopoxvirus in der Familie Poxviridae. Das Affenpockenvirus zählt zusammen mit dem Variola- (VARV), dem Kuhpocken- (CPX) und dem Vacciniavirus (VACV) zu den humanen Orthopoxviren. Orthopoxviren zeichnen sich durch große, ziegelsteinförmige Viruspartikel aus, die ein doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 200.000 bp enthalten.
ELISA-Test
ELISA steht für Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay und bezeichnet einen markierten Immunoassay, der als Goldstandard der Immunoassays gilt. ELISA ist ein immunologischer Test, der wegen seiner hohen diagnostischen Sensitivität geschätzt wird und zum Nachweis und zur Quantifizierung von Molekülen eingesetzt wird, darunter Antikörper, Antigene, Proteine, Glykoproteine und Hormone. Das Prinzip des ELISA beruht auf einer Antigen-Antikörper-Interaktion. Durch diese Antigen-Antikörper-Interaktion binden die spezifischen Antikörper an ihr Zielantigen. Nur wenn diese Interaktion stattfindet, kann das Substrat an das Enzym binden und eine anschließende Substratumsetzung beobachtet werden, was einem positiven Ergebnis entspricht.
Hielscher Ultrasonics stellt Hochleistungsultraschallhomogenisatoren vom Labormaßstab bis zum Industriemaßstab her.