Ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonás tumorszövetből – protokoll

Ez a protokoll tumorszövetek ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonási módszerét ismerteti, amely a szokásos CPTAC karbamidos lízis-munkafolyamatot a szövetfeltárás során végzett, szabályozott szondás ultrahangos kezelési lépéssel fejleszti tovább. A bevált, mélyreható CPTAC proteom- és foszfoproteom-előkészítési stratégiára épülő módosítás javítja a sejtek és a szubcelluláris struktúrák feltárását, csökkenti a minta viszkozitását, és fokozza azon fehérjék felszabadulását, amelyek pusztán karbamidos lízissel általában nehezebben nyerhetők ki, különösen a membránhoz kötött, valamint a DNA megkötésére képes vagy sejtmaghoz kapcsolódó fehérjékét. Az alapul szolgáló vizsgálatban az ultrahangos kezeléssel segített munkafolyamat növelte mind a fehérjék, mind a foszfopeptidek kimutatását, miközben megőrizte a kompatibilitást az ezt követő, CPTAC szerinti emésztést, TMT használatával végzett jelölést, frakcionálást, foszfopeptid-dúsítást és LC-MS/MS módszerrel végzett elemzést magában foglaló folyamattal.

Ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonás tumorszövetből mélyreható proteomikai és foszfoproteomikai elemzéshez

Az alábbi protokollt kriogén módon porított tumorszövetből, 8 M karbamidot tartalmazó lízispufferben végzett fehérjekivonásra optimalizálták: egy hozzáadott szondás ultrahangos kezelési lépés javítja a nehezen kinyerhető fehérjecsoportok, különösen a membránhoz, valamint a DNA molekulához/sejtmaghoz kapcsolódó fehérjék kinyerését az emésztés és az azt követő, LC-MS/MS módszerrel végzett elemzés előtt. Li et al. (2025) alapul szolgáló vizsgálatában az ultrahangos kezelés beiktatása növelte a membránhoz és a sejtmaghoz kapcsolódó fehérjék kimutatását, és az alkalmazott munkafolyamatban >12 000 fehérje és >25 000 foszfopeptid mélyreható lefedettségét tette lehetővé.

A protokoll alkalmazási területe

Ezt az eljárást a következőkhöz használja:

• frissen fagyasztott, kriogén módon porított tumorszövet
• sejtpelletek vagy más biológiai minták, amelyeknél a karbamidalapú kivonás már bevált
• tripszines emésztést és opcionális TMT-jelölést alkalmazó globális proteomikai és foszfoproteomikai munkafolyamatok

Li és munkatársai (2025) tanulmánya szerint a munkafolyamat más mintatípusokra, például sejtvonalakra, vérre és vizeletre is alkalmazható, azonban a mintatípustól függően optimalizálásra lehet szükség.

Optimalizált minta-előkészítési munkafolyamat beiktatott ultrahangos kezelési lépéssel. Az optimalizált munkafolyamat és a kísérleti terv a globális proteomikai és foszfoproteomikai elemzéshez kidolgozott CPTAC minta-előkészítési protokollon alapul.
Tanulmány és séma: ©Li et al., 2025

Működési elv

Az eredeti vizsgálatban ultrahangos kezeléssel egészítették ki a szokásos CPTAC karbamidos lízis-munkafolyamatot, és a membránokhoz, valamint a sejtmagokhoz kapcsolódó fehérjék jobb kimutatását tapasztalták. A szerzők szerint az ultrahangos kezelés paramétereit a minta méretéhez/koncentrációjához kell finomhangolni – a szonotróda méretének, az energiabevitelnek és az impulzusok időzítésének megválasztásával.

A Hielscher UP200Ht és UP200St esetében ez például a következőket jelenti:

• az amplitúdót és az impulzusüzemmódot használja fő szabályozási változóként
• a mintákat végig tartsa hidegen (azaz jégen)
• kezdjen visszafogott beállításokkal
• optimalizáljon a minta tisztasága, hőmérséklete, a fehérjehozam és a későbbi lépésekben kapott peptidek minősége alapján

 
Mindkét 200 wattos Hielscher ultrahangos készülékmodellt, az UP200Ht és az UP200St készüléket kis és közepes mintatérfogatokhoz tervezték, állítható amplitúdóval és impulzusbeállításokkal; mindkét ultrahangos homogenizátor digitális érintőképernyős vezérlést biztosít a paraméterek pontos beállításához, továbbá automatikus adatrögzítést, csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelőt, távvezérlést és mintamegvilágítást kínál.
 

Reagensek az ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonáshoz

Karbamidos lízispuffer

Közvetlenül felhasználás előtt, frissen készítse el:

• 8 M karbamid
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

A karbamidot az adalékanyagok hozzáadása előtt teljesen fel kell oldani; a gátlószereket közvetlenül felhasználás előtt kell hozzáadni; a puffert jégen kell tartani; az adalékanyagok hozzáadása után pedig erőteljes vortexelés helyett körkörös mozgatás javasolt.
 

További reagensek:

• BCA fehérjemeghatározás reagensei
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jódacetamid
• LysC
• Tripszin
• Hangyasav
• TMT-reagensek, multiplex kvantitatív proteomika alkalmazása esetén
• IMAC-reagensek, foszfopeptid-dúsítás végzése esetén

Berendezések az ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonáshoz

Szükséges

Javasolt szondaválasztás

Körülbelül 200–1000 µL térfogatú mintákhoz használjon kis átmérőjű szonotródát, amely alkalmas kis térfogatok közvetlen, nagy intenzitású kezelésére. A Hielscher többféle átmérőjű szonotródát kínál, és a kisebb hegyátmérők nagyobb intenzitást biztosítanak a hegynél.

Gyakorlati megjegyzés: Használja azt a legkisebb szondát, amely hatékony keverést biztosít túlzott habzás és az edény falával való érintkezés nélkül.

Ha egyszerre több mintával dolgozik, érdemes lehet megfontolnia a több mintacső kezelésére alkalmas VialTweeter ultrahangos készüléket vagy a mikrolemezek kezelésére alkalmas UIP400MTP ultrahangos készüléket!

Lépésről lépésre: az ultrahangos kezeléssel segített fehérjekivonás menete

A. Előhűtés és előkészítés

1. Hűtse le a centrifugát 4°C-ra.
2. Készítsen friss karbamidos lízispuffert, és tartsa jégen.
3. Szerelje az UP200Ht vagy UP200St készüléket állványra, egy hangszigetelő burkolaton belül.
4. Készítsen akkora jégfürdőt, amelyben a mintacsövek függőlegesen és stabilan elhelyezhetők.

A puffer friss elkészítése és a hidegen történő mintakezelés kritikus fontosságú.

B. Kezdeti karbamidos kivonás

1. Tartsa a kriogén módon porított szövetet jégen.
2. Adjon 200 µL hűtött karbamidos lízispuffert minden 50 mg nedves szövethez.
3. Vortexelje nagy fordulatszámon 5–10 s ideig.
4. Inkubálja 15 min ideig 4°C-on.
5. Ismételje meg még egyszer a vortexelésből és inkubálásból álló lépést.
6. Centrifugálja 20 000g mellett 10 min ideig 4°C-on.
7. Vigye át a lizátumot/felülúszót egy tiszta, alacsony kötőképességű csőbe.

C. Ultrahangos kezelés UP200Ht vagy UP200St használatával

Az ultrahangos kezelés kiindulási feltételei

• Amplitúdó: kezdjen 20–30%-on
• Impulzushossz: 5 s BE
• Hűtés: 2 min jégen az impulzusok között
• Ciklusok száma: 4 ciklus
• Teljes aktív ultrahangos kezelési idő: 20 s
• Teljes folyamatidő a hűtéssel együtt: körülbelül 8–10 min

Az ultrahangos kezelés lépései

1. Vigye át a lizátumot egy ultrahangos kezelésre alkalmas csőbe. Használjon keskeny, vékony falú csövet, amely jó hőcserét és a szonda biztonságos bemerítését teszi lehetővé.
2. Helyezze a csövet jégfürdőbe. A tanulmány az ultrahangos kezelés alatti hűtést kritikus fontosságúnak nevezi a hőkárosodás megelőzéséhez.
3. Merítse a szonda hegyét a mintába. A stabil kavitációhoz tartsa a hegyet megfelelő mélységben a folyadék felszíne alatt, de ne engedje, hogy hozzáérjen a cső falához vagy aljához.
4. Alkalmazzon egy 5 s hosszú impulzust a kiindulási amplitúdón.
5. Azonnal helyezze vissza a teljes mintát jégre 2 min időtartamra.
6. Ismételje, amíg 4 ciklus be nem fejeződik.
7. Vizsgálja meg a lizátumot a ciklus után.
8. Csak szükség esetén folytassa, egyszerre egy további 5 s hosszú impulzust alkalmazva, amelyet mindig teljes lehűtés kövessen.
9. Állítsa le a kezelést, amint a lizátum egyenletesebbé és kevésbé szálhúzóvá/viszkózussá válik.
   A végpont egy áttetszőbb lizátum, amely folyamatos, viszkózus folyás helyett cseppeket képez.
10. Centrifugálja körülbelül 16 000g mellett 15 min ideig 4°C-on.
11. Vigye át a tisztított felülúszót egy új csőbe, és mérje meg a fehérjekoncentrációt.

A globális proteomika és foszfoproteomika összehasonlítása ultrahangos kezelésben részesült és nem részesült minták között.
a. Az azonosított fehérjék száma (globális proteomika) az összes PDX tumorszövetben, ultrahangos kezeléssel vagy anélkül. b. Az azonosított foszfopeptidek száma (IMAC-dúsítás) az összes PDX tumorszövetben, ultrahangos kezeléssel vagy anélkül. Csak azokat a fehérjéket és foszfopeptideket számolták, amelyek abundanciaaránya legalább a 25. percentilisnek felelt meg. Az abundanciaarányt azonos típusú minták között számították ki.
Tanulmány és grafikonok: ©Li et al., 2025

Az ezt követő emésztés és elemzés

Az ultrahangos kezelés és a tisztítás után az eredeti, CPTAC szerinti munkafolyamatban leírtak szerint járjon el:

1. Hígítsa a lizátumot 1:3 (v/v) arányban 50 mM Tris-HCl pH 8,0 pufferrel, hogy a karbamid koncentrációját <2 M-ra csökkentse.
2. Adjon hozzá LysC-t minden 50 µg fehérjére 1 mAU mennyiségben, és inkubálja 2 h ideig 25°C-on.
3. Adjon hozzá tripszint 1:49 enzim:szubsztrát (w/w) arányban, és eméssze egy éjszakán át 25°C-on.
4. Állítsa le a reakciót hangyasavval, 1%-os végkoncentrációt elérve.
5. Szükség szerint folytassa sómentesítéssel, TMT használatával végzett jelöléssel, frakcionálással, foszfopeptid-dúsítással és LC-MS/MS módszerrel végzett elemzéssel.

A foszfopeptidek differenciális expressziója TMT-jelölt MS alapján.
a. A bazális altípus, kiemelve néhány olyan humán foszfopeptidet (protein-sequence kezdete és vége), amelynek expressziója fokozódott az ultrahangos kezelésben részesült mintákban a nem kezelt mintákhoz képest. b. A luminális altípus, kiemelve néhány olyan humán foszfopeptidet (protein_sequence kezdete és vége), amelynek expressziója fokozódott az ultrahangos kezelésben részesült mintákban a nem kezelt mintákhoz képest. c. Dúsult KEGG-útvonalak az ultrahangos kezelésben részesült, bazális altípusú tumorokban fokozott expressziójú foszfopeptidekhez tartozó fehérjék alapján. d. Dúsult KEGG-útvonalak az ultrahangos kezelésben részesült, luminális altípusú tumorokban fokozott expressziójú foszfopeptidekhez tartozó fehérjék alapján.
Tanulmány és grafikonok: ©Li et al., 2025

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékei a legmagasabb minőségi és tervezési követelményeikről ismertek. Robusztusságuk és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékei könnyedén megbirkóznak a mostoha körülményekkel és az igényes környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a korszerű technológiát és felhasználóbarát működést kínáló, nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre. A Hielscher ultrahangos készülékei természetesen CE-megfelelőséggel rendelkeznek, és teljesítik az UL, CSA és RoHs követelményeit.

Szakirodalom / hivatkozások

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.