Szonikációval segített fehérje extrakció tumorszövetből – protokoll
Ez a protokoll egy szonikációval támogatott fehérjeextrakciós módszert ír le tumorszövethez, amely a CPTAC standard karbamidos lízis munkafolyamatát továbbfejleszti a szövetek felbontása során egy kontrollált szondaszonikációs lépéssel. Ez a módosítás, amely a már bevált, mélyreható CPTAC proteom- és foszfoproteom-előkészítési stratégiára épül, javítja a sejtek és a szubcelluláris struktúrák felbontását, csökkenti a minta viszkozitását, és fokozza azon fehérjék felszabadulását, amelyeket jellemzően nehezebb csak karbamidlízissel kinyerni, különösen a membránhoz kötött és a DNS-kötő vagy sejtmaghoz kapcsolódó fehérjéket. Az alapul szolgáló vizsgálatban a szonikációval segített munkafolyamat növelte mind a fehérjék, mind a foszfopeptidek kimutatását, miközben megőrizte a kompatibilitást a CPTAC-stílusú emésztéssel, TMT-jelöléssel, frakcionálással, foszfopeptid-dúsítással és LC-MS/MS-elemzési csővezetékkel.
Szonikációval segített fehérjeextrakció tumorszövetből mély proteomikai és foszfoproteomikai elemzéshez
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
ultrahangos szonda UP200St fehérjeextrakció a proteomikában
A jegyzőkönyv alkalmazási területe
Ezt az eljárást használja:
- frissen fagyasztott, kriopulverezett tumorszövetek
- sejtpelletek vagy más biológiai minták, ahol a karbamid alapú extrakció már bevált
- globális proteomikai és foszfoproteomikai munkafolyamatok triptikus emésztéssel és opcionális TMT-jelöléssel
Li és munkatársai (2025) tanulmánya szerint a munkafolyamat más mintatípusokra, például sejtvonalakra, vérre és vizeletre is alkalmazható, azonban a mintatípusonként optimalizálásra lehet szükség.
Optimalizált mintaelőkészítési munkafolyamat a bevezetett szonikációs lépéssel. Az optimalizált munkafolyamat és kísérleti terv a CPTAC mintaelőkészítési protokollon alapul a globális proteomikai és foszfoproteomikai elemzéshez.
Tanulmány és séma: ©Li et al., 2025
Működési elv
Az eredeti tanulmány a CPTAC standard karbamidos lízis munkafolyamatát szonikációval egészítette ki, és a membránokhoz és sejtmagokhoz kapcsolódó fehérjék jobb kimutatását találta. A szerzők szerint a szonikációs paramétereket a minta mérete/koncentrációja tekintetében finomhangolni kell. – a szonotróda méretének, a bevitt energiának és az impulzus időzítésének megválasztásával.
A Hielscher UP200Ht és UP200St esetében ez például a következőket jelenti:
- az amplitúdót és az impulzus módot használja fő vezérlő változóként
- a mintákat végig hidegen kell tartani (pl. jégen)
- konzervatív beállításokkal kezdjen
- optimalizálás a minta tisztasága, a hőmérséklet, a fehérjehozam és a peptidek minőségének javítása érdekében
Mindkét Hielscher 200 wattos szonikátor modell UP200Ht és UP200St kis és közepes mintamennyiségekhez készült, állítható amplitúdó- és impulzusbeállításokkal; mindkét ultrahangos homogenizátor digitális érintőképernyős vezérléssel rendelkezik a paraméterek pontos beállításához, automatikus adatrögzítéssel, csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel, távvezérléssel, minta megvilágítással.
Reagensek a szonikációval segített fehérjeextrakcióhoz
Karbamid lízispuffer
Használat előtt azonnal készítse el frissen:
- 8 M karbamid
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8,0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/ml aprotinin
- 10 µg/mL leupeptin
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Foszfatáz inhibitor koktél 2, 1:100 (v/v)
- Foszfatáz inhibitor koktél 3, 1:100 (v/v)
A karbamidot teljesen fel kell oldani az adalékanyagok hozzáadása előtt; az inhibitorokat közvetlenül a használat előtt kell hozzáadni; a puffert jégen kell tartani; és az adalékanyagok hozzáadása után inkább keverés, mint erőteljes örvénylés javasolt.
További reagensek:
- BCA fehérje analízis reagensek
- 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
- DTT
- Jodoacetamid
- LysC
- tripszin
- Hangyasav
- TMT-reagensek, ha multiplexelt kvantitatív proteomikát használnak
- IMAC-reagensek, ha foszfopeptid-dúsítást végeznek
UP200Ht ultrahangos készülék S26d2 mikrocsúccsal a minta előkészítéséhez
Szonikációval segített fehérjeextrakcióhoz szükséges berendezések
Kötelező
Ajánlott szonda kiválasztása
A 200-1000 µl körüli mintákhoz használjon kis átmérőjű szonotródát, amely alkalmas kis térfogatok közvetlen, nagy intenzitású feldolgozására. A Hielscher többféle átmérőjű szonotródát kínál, és a kisebb csúcsátmérő nagyobb intenzitást biztosít a csúcson.
Gyakorlati megjegyzés: Használja a legkisebb szondát, amely hatékony keverést biztosít túlzott habzás vagy az edény falával való érintkezés nélkül.
Ha egyszerre több mintával dolgozik, érdemes megfontolni a következőket a Multi-Tube Sonicator VialTweeter vagy a Microplate Sonicator UIP400MTP!
Lépésről-lépésre útmutató: A szonikációval segített fehérjeextrakció eljárása
A. Előhűtés és előkészítés
- Hűtsük le a centrifugát 4 °C-ra.
- Készítsen friss karbamidos lízispuffert, és tartsa jégen.
- Állítsa fel az UP200Ht vagy UP200St készüléket egy állványra egy hangszigetelő burkolaton belül.
- Készítsen elő egy jégfürdőt, amely elég nagy ahhoz, hogy a mintacsöveket függőlegesen és stabilan tartsa.
A friss puffer előkészítése és a hidegkezelés kritikus fontosságú.
B. Kezdeti karbamid extrakció
- A kriopulverezett szöveteket tartsa jégen.
- Adjunk hozzá 200 µl hűtött karbamidos lízispuffert 50 mg nedves szövetenként.
- Vortex 5-10 s nagy sebességgel.
- Inkubáljuk 15 percig 4°C-on.
- Ismételje meg még egyszer a vortex-plusz inkubációs lépést.
- Centrifugáljuk 20 000 g-nél 10 percig 4°C-on.
- A lizátumot/szupernatánst vigye át egy tiszta, alacsony kötésű csőbe.
C. Szonikáció az UP200Ht vagy UP200St használatával
A szonikálás indítási feltételei
- Amplitúdó: 20-30%-nál kezdődik
- Impulzus hossza: 5 s ON
- Hűtés: 2 perc jégen az impulzusok között
- Ciklusok száma: ciklusok száma: 4 ciklus
- Teljes aktív szonikációs idő: 20 s
- A folyamat teljes időtartama a hűtéssel együtt: kb. 8-10 perc.
Szonikációs lépések
- Vigye át a lizátumot egy szonikációra alkalmas csőbe. Használjon keskeny, vékony falú csövet, amely lehetővé teszi a jó hőcserét és a szonda biztonságos elmerülését.
- Helyezze a csövet jégfürdőbe. A papír szerint a szonikáció alatti hűtés kritikus a hőkárosodás megelőzése érdekében.
- Merítse a szonda hegyét a mintába. Tartsa a hegyet a stabil kavitációhoz elegendő mélységben, de ne érjen a cső falához vagy aljához.
- Futtasson le egy 5 másodperces impulzust a kiindulási amplitúdóval.
- Azonnal tegye vissza a mintát teljesen a jégre 2 percre.
- Ismételje ezt 4 ciklus végéig.
- A ciklus után vizsgálja meg a lizátumot.
- Csak akkor folytassa, ha szükséges, további 5 másodperces impulzusokkal, amelyeket mindig teljes lehűlés követ.
- Állítsa le, amint a lizátum egyenletesebbé és kevésbé szálas/viszkózussá válik.
A végeredmény egy áttetszőbb lizátum, amely inkább cseppeket képez, mint folyamatos viszkózus áramlást. - Centrifugáljuk körülbelül 16 000 g-nél 15 percig 4°C-on.
- A tisztított felülúszót tegye át egy új csőbe, és mérje meg a fehérjekoncentrációt.
A globális proteomika és a foszfoproteomika összehasonlítása szonikált és nem szonikált minták között.
a. Azonosított fehérjék száma (globális proteomika) az összes PDX tumorszövetben szonikációval vagy anélkül. b. Azonosított foszfopeptidek száma (IMAC dúsítás) az összes PDX tumorszövetben szonikációval vagy anélkül. Csak a 25. percentilisnél nagyobb vagy azzal egyenlő abundanciaarányú fehérjéket és foszfopeptideket számoltuk. Az abundanciaarányt az azonos típusú minták között számoltuk ki.
Tanulmány és grafikonok: ©Li et al., 2025
Downstream emésztés és elemzés
A szonikálás és a tisztítás után az eredeti CPTAC-stílusú munkafolyamatban leírtak szerint járjon el:
- Hígítsuk a lizátumot 1:3 (v/v) arányban 50 mM Tris-HCl pH 8,0-val, hogy a karbamidot a következő szintre csökkentsük <2 M.
- Adjunk hozzá LysC-t 1 mAU-t 50 µg fehérjéhez, és inkubáljuk 2 órán át 25°C-on.
- Adjunk hozzá tripszint 1:49 enzim:szubsztrát (m/m) arányban, és emésszük egy éjszakán át 25°C-on.
- Áramtalanítsuk hangyasavval 1%-os végleges szintre.
- Folytassa a sótalanítást, TMT-jelölést, frakcionálást, foszfopeptid-dúsítást és szükség szerint LC-MS/MS-t.
Foszfopeptidek differenciális expressziója TMT-jelölt MS-ből.
a. A bazális altípus, kiemelve néhány humán foszfopeptidet (fehérje-szekvencia kezdet és vég), amelyek a szonikázott mintákban a nem szonikázott mintákhoz képest felszabályozottak. b. A luminális altípus, kiemelve néhány humán foszfopeptidet (fehérje_szekvencia kezdet és vég), amelyek a szonikázott mintákban a nem szonikázott mintákhoz képest felszabályozottak. c. A szonikázott tumorok bazális altípusában felregulált foszfopeptidek fehérjéi alapján feldúsított KEGG-útvonalak. d. A szonikázott tumorok luminális altípusában felregulált foszfopeptidek fehérjéi alapján feldúsított KEGG-útvonalak.
Tanulmány és grafikonok: ©Li et al., 2025
Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség
A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.
Több lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP a mintákból történő nagy áteresztőképességű fehérjeextrakcióhoz
Irodalom / Hivatkozások
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Gyakran Ismételt Kérdések
Mi a különbség a növényi szövetekből és az emlősök szövetéből történő fehérjeextrakció között?
A növényi szövetekből történő fehérjeextrakció általában nehezebb, mint az emlősökből, mivel a növényi sejtek merev, cellulózban gazdag sejtfalúak, bőséges poliszacharidok, fenolos vegyületek, pigmentek és aktív endogén enzimek zavarhatják a fehérje szolubilizációját, szennyezhetik a kivonatokat, vagy elősegíthetik a fehérjék lebomlását. Ezzel szemben az emlősök szövetéből hiányzik a sejtfal, és általában könnyebb kémiailag megbontani, bár gyakran több lipidet, extracelluláris mátrixot és proteázt tartalmaz, amelyek még mindig megnehezíthetik az extrakciót. Ennek eredményeképpen a növényi protokollok általában erősebb mechanikai bontást, alacsony hőmérsékletű őrlést és olyan adalékanyagokat igényelnek, mint a PVPP, redukálószerek vagy fenol alapú tisztítószerek, míg az emlősszövetek gyakrabban kezelhetők sikeresen detergens alapú pufferekkel, például RIPA vagy karbamid alapú lízisrendszerekkel. Mind a növényi, mind az emlősszövet hatékonyan lízisálható szonikációval!
Hogyan javítható a fehérjeextrakció a szövetekből RIPA pufferrel?
A szövetekből RIPA pufferrel történő fehérjeextrakció javítható a minta felbontásának és védelmének optimalizálásával. A legfontosabb intézkedések a következők: a szövet és a puffer hidegen tartása, frissen készített proteáz- és foszfatáz-inhibitorok használata, a szövet alapos aprítása vagy porlasztása a lízis előtt, megfelelő puffer-szövet arány fenntartása, valamint mechanikus bontási lépés, például homogenizálás vagy rövid szondás szonikálás a sűrű szövetek felbontása és a viszkozitás csökkentése érdekében. Az extrakció hatékonysága akkor is javul, ha a lizátumokat jégen inkubáljuk szakaszos keverés mellett, majd nagy sebességű, hűtött centrifugálással eltávolítjuk az oldhatatlan törmeléket. Rostos, lipidekben gazdag vagy erősen strukturált szövetek esetében az extrakció egyszeri megismétlése vagy a detergens expozíciós idejének növelése javíthatja a kinyerést, de a túlzott szonikálás vagy a hosszan tartó szobahőmérsékletű kezelés kerülendő, mivel ezek denaturálhatják a fehérjéket vagy fokozhatják a proteolízist.
Milyen biztonsági követelményeket kell betartani az ultrahangos fehérjeextrakció során?
A szondaszonikációt hangvédő dobozban vagy megfelelő hallásvédelemmel végezze. A forrásprotokoll kifejezetten figyelmeztet a szonikáció során keletkező káros hallható zajra.
Viseljen szemvédőt, laboratóriumi köpenyt és kesztyűt.
Tartsa a szondát távol a bőrtől, és soha ne szonikázzon nyitott edényben fröccsenés elleni védelem nélkül.
A PMSF-et és más inhibitorokat a helyi kémiai biztonsági szabályoknak megfelelően kezelje.
Tartsa a mintákat jégen, hogy csökkentse a hő okozta fehérjekárosodást; a dokumentum ismételten kritikusnak nevezi a hőmérséklet-szabályozást.
A VialTweeter Sonicator felgyorsítja és javítja a fehérjeextrakciót a proteomikában
Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.