Ultrahangos kezeléssel támogatott fehérjekivonás a foszfoproteomikában

A modern élettudományokban a foszfoproteomika a sejtes jelátviteli útvonalak feltárásának és a betegségek mechanizmusai rendszerszintű megértésének alapvető technológiájává vált. Mivel a foszforiláció kulcsfontosságú biológiai funkciókat szabályoz – az enzimaktivitástól a fehérje–fehérje kölcsönhatásokig –, pontos mérése elengedhetetlen mind az alapkutatás, mind a transzlációs orvoslás számára. A tömegspektrometria közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette több tízezer foszforilációs esemény azonosítását egyetlen kísérletben, ami hangsúlyozza a robusztus, skálázható és reprodukálható minta-előkészítési munkafolyamatok szükségességét.
E terület egyik legnagyobb hatású fejleménye az ultrahangos kezeléssel támogatott fehérjekivonás alkalmazása, amely jelentősen javítja a minták minőségét, a mintafeldolgozási kapacitást és a reprodukálhatóságot. Az olyan ultrahangos technológiák, mint a VialTweeter és az UIP400MTP, jelenleg új alapokra helyezik a nagy mintacsoportok laboratóriumi kezelését, különösen a nagy mintafeldolgozási kapacitású foszfoproteomikában.

A hatékony minta-előkészítés tudományos jelentősége a foszfoproteomikában

A fehérjefoszforiláció rendkívül dinamikus és reverzibilis poszttranszlációs módosítás, amely az emberi sejtek fehérjéinek többségét érinti. Szabályozza a fehérjék szerkezetét, lokalizációját és kölcsönhatási hálózatait, szabályozásának zavara pedig szerepet játszik olyan betegségekben, mint a rák és a neurodegeneráció.
A foszfoproteomikai elemzés azonban sajátos technikai kihívásokkal jár. A foszforilált peptidek gyakran kis mennyiségben vannak jelen, és gondos dúsítást, valamint rendkívül hatékony előzetes minta-előkészítést igényelnek. A fehérjekivonás vagy az emésztés során fellépő bármilyen hatékonyságvesztés jelvesztéshez, gyenge reprodukálhatósághoz és a foszforilációs helyek hiányos lefedettségéhez vezethet.
Itt válik kulcsfontosságúvá az ultrahangos kezelés.

Miért alakítja át az ultrahangos kezelés a fehérjekivonást?

Az ultrahangos kezelés nagy intenzitású ultrahanghullámokat használ a sejtek és szövetek mechanikai feltárására, lehetővé téve a fehérjék hatékony felszabadítását sejtekből, szövetekből, biológiai folyadékokból és extracelluláris vezikulákból. A hagyományos lízistechnikákhoz képest az ultrahangos kezelés számos egyértelmű előnyt kínál:

• Először is gyors és egyenletes sejtfeltárást biztosít, ami különösen fontos az átmeneti foszforilációs állapotok megőrzéséhez. A foszfoproteomikában már kisebb késedelmek vagy a hiányos lízis is megváltoztathatják a jelátviteli profilokat, ezért elengedhetetlen a gyors és reprodukálható kivonás.
• Másodszor, az ultrahangos kezelés javítja a fehérjehozamot és az oldatba vitelt, különösen a nehezen lizálható minták, például a tömör szövetek vagy a membránokban gazdag sejtek esetében. Ez közvetlenül javítja az ezt követő emésztést és a foszfopeptidek visszanyerését.
• Harmadszor, az ultrahangos feldolgozás eredendően skálázható. Az olyan készülékek, mint a VialTweeter, lehetővé teszik több lezárt mintacső egyidejű ultrahangos kezelését, biztosítva az összes minta azonos feldolgozási körülményeit. Ez kiküszöböli a kézi kezelésből eredő változékonyságot.
• Még nagyobb mintafeldolgozási kapacitás iránti igény esetén az UIP400MTP jelentős technológiai előrelépést jelent. Lehetővé teszi teljes mikrolemezek vagy mintacsőállványok közvetlen ultrahangos kezelését, beleértve az automata mintavevők fioláit is, így ideális több száz minta párhuzamos feldolgozására. Ez a képesség különösen értékes a rendszerbiológiában és a klinikai kutatásban, ahol megszokott a nagy mintacsoportok használata.

Nagy mintafeldolgozási kapacitású ultrahangos kezelés: fókuszban a VialTweeter és az UIP400MTP

A fejlett ultrahangos készülékek beépítése a foszfoproteomikai munkafolyamatokba nem pusztán kényelmi szempont – módszertani előrelépést jelent.
A VialTweeter több zárt fiola összehangolt ultrahangos kezelésére készült, minimalizálva a keresztkontaminációt, miközben biztosítja a reprodukálhatóságot. Különösen alkalmas közepes mintafeldolgozási kapacitású alkalmazásokhoz és szabványosított munkafolyamatokhoz.
 

Ezzel szemben az UIP400MTP nagy mintafeldolgozási kapacitású környezetekre van optimalizálva, és lehetővé teszi a következőket:

• Egyenletes ultrahangos kezelés teljes szabványos mikrolemezeken, például 96 vagy 384 mélyedéses lemezeken
• Mintacsőállványok és automata mintavevő fiolák közvetlen feldolgozása
• A kézi munkára fordított idő jelentős csökkentése
• Jobb reprodukálhatóság nagy adatkészletek esetén

Ez a skálázhatóság tökéletesen illeszkedik a modern foszfoproteomikai megközelítésekhez, amelyek munkafolyamataiban rutinszerűen több tucat vagy több száz mintát dolgoznak fel párhuzamosan.

Általános protokoll az ultrahangos kezeléssel támogatott foszfoproteomikai minta-előkészítéshez

Egy robusztus foszfoproteomikai munkafolyamat egyesíti a hatékony fehérjekivonást, az enzimatikus emésztést és a foszfopeptid-dúsítást. Az alábbi vázlat az ultrahangos kezelésen alapuló előkészítéshez igazított, bevált gyakorlatokat tükrözi:

1. A minták reakcióinak gyors leállítása és a minták begyűjtése
   A sejtekben vagy szövetekben zajló reakciókat gyorsan leállítják – általában gyorsfagyasztással – a foszforilációs állapotok megőrzése érdekében. Ez a lépés a foszforilációs események átmeneti jellege miatt kulcsfontosságú.
2. Ultrahangos sejtlízis és fehérjekivonás
   A mintákat felolvasztják, és ultrahangos kezelésnek vetik alá, jellemzően rövid ciklusokban. Az ultrahangos energia megbontja a sejtmembránokat, és hatékonyan felszabadítja a fehérjéket. Validált munkafolyamatokban az ultrahangos kezelést több ciklusban végzik a teljes lízis biztosítása érdekében.
   Példa: A minták jégen történő felolvasztása után a sejtlízist ultrahangos kezeléssel érték el, például a Vialtweeter készülékkel, 2 ciklusban, ciklusonként 1 min időtartammal.
3. Tisztítás és a fehérjemennyiség meghatározása
   A lízist követően a mintákat centrifugálják a törmelék eltávolítására. Az oldható fehérjéket tartalmazó felülúszót összegyűjtik, és meghatározzák a benne lévő fehérjék mennyiségét, hogy az egyes mintákból azonos mennyiségű fehérje kerüljön a további feldolgozásba.
4. Redukció és alkilezés
   A diszulfidkötéseket redukálják (például DTT alkalmazásával) és alkilezik (például IAA alkalmazásával) a fehérjék stabilizálása és az emésztés hatékonyságának javítása érdekében.
5. Proteolitikus emésztés
   A fehérjéket enzimatikusan emésztik, jellemzően tripszinnel, így tömegspektrometriás elemzésre alkalmas peptidek keletkeznek. Tudjon meg többet az ultrahanggal gyorsított fehérjeemésztésről!
6. Peptidtisztítás és sótalanítás
   A peptideket C18 alkalmazásán alapuló módszerekkel tisztítják, hogy eltávolítsák azokat a szennyező anyagokat, amelyek zavarhatják az LC-MS elemzést.
7. Foszfopeptid-dúsítás
   A foszforilált peptidek kis mennyisége miatt olyan dúsítási technikákat alkalmaznak, mint a Fe-NTA vagy a TiO₂ affinitásán alapuló módszerek, a foszfopeptidek szelektív izolálására.
8. LC-MS/MS elemzés és adatfeldolgozás
   A dúsított mintákat nagy felbontású tömegspektrometriával elemzik, gyakran adatfüggetlen adatgyűjtést (DIA) alkalmazva a mennyiségi meghatározás és a reprodukálhatóság javítása érdekében.

Külön kiemelendő, hogy a nagyszabású munkafolyamatok 96 mélyedéses lemezformátumokhoz igazíthatók, ami akár több száz minta párhuzamos feldolgozását teszi lehetővé – ez a megközelítés teljes mértékben kompatibilis az UIP400MTP készüléken alapuló ultrahangos kezeléssel.
 

Optimalizált protokoll a foszfoproteom reakcióinak gyors leállításához, a foszfopeptidek dúsításához és a Phos-DIA-MS eljáráshoz.
Protokoll és kép: ©Die et al. 2023

A reprodukálhatóság és az adatminőség javítása ultrahangos kezeléssel

A foszfoproteomika egyik központi kihívása a következetes mennyiségi meghatározás elérése nagy adatkészletek esetén. A minta-előkészítés során keletkező változékonyság elfedheti a biológiailag jelentős különbségeket.

Az ultrahangos kezelés ezt a következők biztosításával kezeli:

1. Szabványosított energiabevitel minden mintánál
2. A kézi munkából eredő változékonyság csökkentése
3. Jobb reprodukálhatóság a fehérjekivonásban és az emésztésben

Az UIP400MTP készülékhez hasonló, nagy mintafeldolgozási kapacitású platformokkal kombinálva a laboratóriumok olyan szintű következetességet érhetnek el, amely elengedhetetlen a rendszerbiológiai vizsgálatokhoz és a klinikai biomarkerek felfedezéséhez.

A foszfoproteomika jövője: automatizálás és skálázhatóság

Ahogy a foszfoproteomika egyre inkább kiterjed a nagyszabású és klinikai alkalmazásokra, az automatizálás és a mintafeldolgozási kapacitás iránti igény csak növekedni fog. Az ultrahangos kezelésen alapuló minta-előkészítés, különösen mikrolemezekkel kompatibilis rendszerekbe integrálva, kulcsfontosságú támogató technológiát jelent.
A hatékony ultrahangos lízis, a párhuzamos feldolgozás és az automatizált munkafolyamatokkal való kompatibilitás egyesítésével az olyan készülékek, mint a VialTweeter és az UIP400MTP, új mércét állítanak fel a proteomikai minta-előkészítésben.
Tudjon meg többet az UIP400MTP automatizált laboratóriumi munkafolyamatokba történő integrálásáról!

Használja ki az ultrahangos kezeléssel támogatott minta-előkészítés előnyeit a foszfoproteomikában!

Az ultrahangos kezeléssel támogatott fehérjekivonás a modern foszfoproteomika kulcsfontosságú elemévé vált, páratlan hatékonyságot, skálázhatóságot és reprodukálhatóságot kínálva. Mivel egyre nagyobb szükség van összetett biológiai rendszerek nagy mintacsoportokon történő elemzésére, az ultrahangos technológiák nem csupán előnyösek – elengedhetetlenek.
A nagy mintafeldolgozási kapacitású, szabványosított munkafolyamatok lehetővé tételével az olyan megoldások, mint a VialTweeter és az UIP400MTP, felgyorsítják a sejtes jelátvitel, a betegségmechanizmusok és a precíziós orvoslás területén tett felfedezéseket.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékei a legmagasabb minőségi és tervezési követelményekről ismertek. Robusztusságuk és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékei könnyedén megbirkóznak a mostoha körülményekkel és a nagy igénybevételt jelentő környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a csúcstechnológiát és felhasználóbarát működést kínáló, nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre. Természetesen a Hielscher ultrahangos készülékei megfelelnek a CE előírásainak, valamint az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

A Hielscher több minta kezelésére szolgáló ultrahangos készülékmodelljei, a mikrolemezekhez készült UIP400MTP, a VialTweeter és a CupHorn: nagy sebességű és nagy mintafeldolgozási kapacitású minta-előkészítés