Deparaffinizálás és fehérje extrakció FFPE-ből
Megkönnyíti a fehérje kivonását a formalinhoz rögzített paraffinba ágyazott (FFPE) szövetmetszetekből a paraffinezés, az oldás és az ultrahangos kezelés optimalizált kombinációjával egy VialTweeter többcsöves ultrahangos készülékkel. Ez a protokoll támogatja a tömegspektrometrián alapuló proteomikát, és kompatibilis az SP3 tisztítási és enzimatikus emésztési munkafolyamatokkal.
Ez az SOP az FFPE szövetminták proteomikai elemzésében részt vevő laboratóriumi személyzet számára készült, nagy teljesítményű ultrahangos kezeléssel. Legfeljebb tíz FFPE mintára van optimalizálva, amelyeket párhuzamosan dolgoznak fel a VialTweeter Multi-Tube Sonicator segítségével.
VialTweeter szonikátor 10 minta egyidejű ultrahangos kezeléséhez, pl. lízishez és fehérje extrakcióhoz FFPE mintákból
Protokoll: Fehérje extrakció FFPE mintákból a VialTweeter segítségével
Anyagok és reagensek
Reagensek
- Xilol (szövettani fokozatú)
- Etanol (abszolút 96%)
- Lízis puffer:
- Proteáz inhibitor (opcionális; pl. cOmplete™ mini EDTA-mentes)
6 M Guanidin-hidroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (trisz(2-karboxjetil)foszfin)
40 mM CAA (2-klór-acetamid)
Berendezés
- VialTweeter többcsöves ultrahangos készülék
- 1,5 ml-es vagy 2,0 ml-es alacsony kötésű mikrocentrifuga csövek
- Hőblokk vagy inkubátor (95°C és 80°C beállítások)
- Mikrocentrifuga
- Thermomixer (opcionális, de ajánlott)
Minta bemenet
- 1-2 szakasz 10 μm vastag FFPE szövet mintánként (azaz injekciós üvegenként)
- Összesen ~100 μg szövet mintánként (azaz injekciós üvegenként)
vagy
Megjegyzés: Használjon friss pengéket a mikrotómiához, hogy minimalizálja a paraffintörmelék szennyeződését.
Eljárás
- deparaffinizáció
- Helyezze az FFPE szakaszokat alacsony kötésű mikrocentrifuga csövekbe.
- Adjunk hozzá 1 ml xilolt, örvényt röviden.
- Inkubáljuk 10 percig szobahőmérsékleten.
- Centrifugáljuk 14 000 × g-on 2 percig; Dobja el a szupernatánst.
- Ismételje meg még egyszer a xilol mosást (2–4. lépés).
- Mossa le a pelletet 1 ml 96%-os etanollal, örvénylel, majd centrifugálja 14 000 × g-on 2 percig. Dobja el a felülúszót.
- Ismételje meg az etanolos mosást még egyszer (összesen 2 etanolos mosás).
- Szárítsa meg a pelletet 10 percig szobahőmérsékleten, nyitott fedéllel a maradék etanol elpárologtatására.
- Fehérje extrakció és ultrahangos kezelés
- Adjunk hozzá 200 μL lízispuffert minden száraz pellethez.
Megjegyzés: Bár a szonikátor legfeljebb 1 ml-t képes befogadni, a 200 μL optimális a későbbi feldolgozáshoz. - Keverjük össze vortexinggel vagy gyengéd pipettázással.
- Adjunk hozzá 200 μL lízispuffert minden száraz pellethez.
- Első termikus inkubáció
- Inkubáljuk a csöveket 95 °C-on 30 percig, 400 fordulat/perc sebességgel keverve hőkeverővel vagy hőblokkkal.
- Hagyja a mintákat szobahőmérsékleten hűlni 5 percig.
- Első ultrahangos kezelés a VialTweeterrel
- Helyezze a csöveket a VialTweeterbe.
- Állítsa a VialTweeter UP200St készüléket az alábbi értékekre, és ultrahangozzon.
- Második termikus inkubáció
Távolítsuk el a csöveket, és inkubáljuk újra 95 °C-on 15 percig, 400 fordulat/perc sebességgel. - Második ultrahangos kezelés
Ismételje meg az ultrahangos kezelést a VialTweeteren ugyanazokkal a beállításokkal (mint fent) további 10 ciklusig (összesen 15 perc). - A lizátum tisztázása
- Centrifugáljuk a mintákat 13 000 × g-on 10 percig 23 °C-on (szobahőmérsékleten).
- Óvatosan gyűjtse össze a felülúszót egy új, 2,0 ml-es Safe-lock Eppendorf csőbe. Kerülje a pellet megzavarását.
- Downstream feldolgozás
A lizátum készen áll az SP3 tisztítására és az enzimatikus emésztésre.
• Állítsa az amplitúdót (A) 100%-ra
• Állítsa a pulzációs módot (C) 100%-ra
• Időszak órája: Be
• Időben: 60-as évek
• Kikapcsolási idő: 30 másodperc
• Határérték: 15 perc (10 ciklusnak felel meg)
(Számítási megjegyzés: (60 s be + 30 s ki) × 10 ciklus = 900 s = 15 perc)
Hielscher VialTweeter 10 Eppendorf csővel
Megjegyzések és bevált módszerek
- Az ultrahangos kezelés során a túlmelegedés kockázatát a programozott BE / KI ciklus mérsékli.
- Kerülje az ultrahangos kezelés utáni vortexinget, hogy megakadályozza a fehérje aggregációját.
Hulladékkezelés és biztonság
Az alábbi táblázat jelzi laboratóriumi méretű ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását:
| Ajánlott eszközök | Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96 lyukú lemezes szonikátor | Több lyukú / mikrotiter lemezek | n.a. |
| Ultrahangos CupHorn | CupHorn injekciós üvegekhez vagy főzőpohárhoz | n.a. |
| GDmini2 | ultrahangos mikro-flow reaktor | n.a. |
| VialMagassugárzó | 0.5-től 1,5 ml-ig | n.a. |
| UP100H | 1–500 ml | 10–200 ml/perc |
| UP200Ht, UP200St | 10–1000 ml | 20–200 ml/perc |
| UP400ST | 10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc |
| Ultrahangos szitarázó | n.a. | n.a. |
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt keverési alkalmazásokhoz, diszperzióhoz, emulgeáláshoz és extrakcióhoz laboratóriumi, kísérleti és ipari méretekben.
Irodalom / Hivatkozások
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Gyakran Ismételt Kérdések
Miért rögzítik a szövetmintákat FFPE-ként?
A formalinhoz kötött paraffinba ágyazott (FFPE) tartósítás stabilizálja a szövetek morfológiáját és a fehérjeszerkezetet azáltal, hogy formaldehid segítségével kovalens keresztkötéseket képez. A paraffinba ágyazás lehetővé teszi a hosszú távú tárolást szobahőmérsékleten, miközben megőrzi a szövettani és molekuláris integritást a retrospektív elemzésekhez.
Hogyan paraffinizálhatom az FFPE mintákat?
A paraffinmentesítés egymást követő oldószeres mosást foglal magában a paraffin eltávolítására: jellemzően két xilollal történő inkubálást, majd két etanollal történő mosást (96%). Centrifugálás és szárítás után a szövet készen áll a későbbi extrakcióra. Ez a folyamat helyreállítja a minta hozzáférhetőségét a lízishez és az enzimatikus emésztéshez.
Mi a termikus inkubáció célja?
A termikus inkubáció a minta meghatározott hőmérsékletnek való ellenőrzött expozícióját jelenti egy meghatározott ideig, hogy biokémiai vagy fizikai változásokat idézzen elő. A proteomikában általában fehérjék denaturálására, formaldehid keresztkötések visszafordítására használják az FFPE szövetekben, vagy fokozzák a lízispuffer hatékonyságát. A hőmérséklet és az időtartam kritikus paraméterek, amelyek a célreakcióhoz vagy a minta típusához igazodnak.
Mi az SP3 emésztés?
Az egypotos szilárd fázisú minta-előkészítés (SP3) egy gyöngyalapú proteomikai munkafolyamat. Paramágneses gyöngyöket használ a fehérjék megkötésére, lehetővé téve a hatékony tisztítást, koncentrációt és a gyöngyön történő enzimatikus emésztést denaturálási körülmények között. Az SP3 minimalizálja a mintaveszteséget, és nagymértékben kompatibilis az alacsony bemenetű és FFPE mintákkal.
Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.