Paraffinmentesítés és fehérjekivonás FFPE-szövetekből

Segítse elő a fehérjekivonást formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetmetszetekből a paraffinmentesítés, a szolubilizálás és a VialTweeter többcsöves ultrahangos készülékkel végzett ultrahangos kezelés optimalizált kombinációjával. Ez a protokoll támogatja az ezt követő tömegspektrometria-alapú proteomikai vizsgálatokat, és kompatibilis az SP3-tisztítást és enzimes emésztést alkalmazó munkafolyamatokkal.

Ez a szabványos műveleti eljárás (SOP) olyan laboratóriumi munkatársak számára készült, akik FFPE-szövetminták proteomikai elemzését végzik nagy teljesítményű ultrahangos kezeléssel. Az eljárást legfeljebb tíz FFPE-minta párhuzamos feldolgozására optimalizálták a VialTweeter többcsöves ultrahangos készülék használatával.

Protokoll: fehérjekivonás FFPE-mintákból a VialTweeter használatával

Anyagok és reagensek

Reagensek

• Xilol (szövettani minőségű)
• Etanol (abszolút, 96%)
• Lízispuffer:

6 M guanidin-hidroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (trisz(2-karboxietil)-foszfin)
40 mM CAA (2-klóracetamid)

• Proteázinhibitor (opcionális; például cOmplete™ mini EDTA-free)

Eszközök

• VialTweeter többcsöves ultrahangos készülék
• 1,5 mL-es vagy 2,0 mL-es, alacsony kötőképességű mikrocentrifugacsövek
• Fűtőblokk vagy inkubátor (95°C-os és 80°C-os beállítással)
• Mikrocentrifuga
• Termomixer (opcionális, de ajánlott)

Kiindulási mintamennyiség

• Mintánként (azaz fiolánként) 1–2 metszet 10 µm vastag FFPE-szövetből

VAGY

• Mintánként (azaz fiolánként) összesen ~100 µg szövet

Megjegyzés: A mikrotómos metszéshez használjon új pengéket a paraffintörmelék okozta szennyeződés minimalizálására.

Eljárás

1. Paraffinmentesítés
   1. Helyezze az FFPE-metszeteket alacsony kötőképességű mikrocentrifugacsövekbe.
   2. Adjon hozzá 1 mL xilolt, majd röviden keverje vortexkeverővel.
   3. Inkubálja 10 percig szobahőmérsékleten.
   4. Centrifugálja 14 000 × g mellett 2 percig; távolítsa el a felülúszót.
   5. Ismételje meg még egyszer a xilolos mosást (2–4. lépés).
   6. Mossa az üledéket 1 mL 96%-os etanollal, keverje vortexkeverővel, majd centrifugálja 14 000 × g mellett 2 percig. Távolítsa el a felülúszót.
   7. Ismételje meg még egyszer az etanolos mosást (összesen 2 etanolos mosás).
   8. Szárítsa az üledéket levegőn, szobahőmérsékleten 10 percig, nyitott csőfedelekkel, hogy a maradék etanol elpárologjon.
2. Fehérjekivonás és ultrahangos kezelés
   1. Adjon 200 µL lízispuffert minden száraz üledékhez.

      Megjegyzés: Bár az ultrahangos készülék legfeljebb 1 mL befogadására alkalmas, a további feldolgozáshoz 200 µL az optimális térfogat.

   2. Keverje vortexkeverővel vagy óvatos pipettázással.
3. Első hőinkubálás
   1. Inkubálja a csöveket 95 °C-on 30 min ideig, 400 rpm sebességű rázatás mellett, termomixer vagy fűtőblokk használatával.
   2. Hagyja a mintákat szobahőmérsékleten hűlni 5 min ideig.
4. Első ultrahangos kezelés a VialTweeter használatával
   1. Helyezze a csöveket a VialTweeter készülékbe.
   2. Állítsa be a VialTweeter UP200St készüléket az alábbi értékekre, majd végezze el az ultrahangos kezelést.
Az ultrahangos készülék beállításai
• Állítsa az amplitúdót (A) 100%-ra
• Állítsa az impulzusüzemmódot (C) 100%-ra
• Ciklusidőzítő: bekapcsolva
• Bekapcsolási idő: 60s
• Kikapcsolási idő: 30s
• Határérték: 15 min (10 ciklusnak felel meg)
(Számítási megjegyzés: (60 s bekapcsolva + 30 s kikapcsolva) × 10 ciklus = 900 s = 15 min)
5. Második hőinkubálás
   Vegye ki a csöveket, és inkubálja őket ismét 95 °C-on 15 min ideig, 400 rpm mellett.
6. Második ultrahangos kezelés
   Ismételje meg az ultrahangos kezelést a VialTweeter készüléken ugyanazokkal a beállításokkal (mint fent), további 10 cikluson át (összesen 15 min).
7. A lizátum derítése
   1. Centrifugálja a mintákat 13 000 × g mellett 10 min ideig, 23°C-on (szobahőmérsékleten).
   2. Óvatosan gyűjtse a felülúszót egy új, 2,0 mL-es Safe-lock Eppendorf csőbe. Ügyeljen arra, hogy ne kavarja fel az üledéket.
8. További feldolgozás
   A lizátum most készen áll az SP3-tisztításra és az enzimes emésztésre.

Megjegyzések és bevált gyakorlatok

1. Az ultrahangos kezelés során fellépő túlmelegedés kockázatát a programozott be- és kikapcsolási ciklusok mérséklik.
2. Az ultrahangos kezelés után kerülje a vortexkeverést a fehérjeaggregáció megelőzése érdekében.

Hulladékkezelés és biztonság

Az alábbi táblázat laboratóriumi méretű ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról ad tájékoztatást: