FFPE nagy áteresztőképességű mintaelőkészítés: fehérjeextrakció és nukleinsavnyírás
A nagy áteresztőképességű ultrahangos UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics foglalkozik a kihívást a formalin rögzítés és paraffin beágyazott (FFPE) szövet előkészítés. Ismerje meg, hogyan dolgozza fel az ultrahangos kezelés az FFPE mintát nagy számban az FFPE deparaffinizációhoz, szöveti lízishez, homogenizáláshoz, fehérje extrakcióhoz és DNS / RNS nyíráshoz! Használja ki az ultrahangos FFPE szövetelőkészítés előnyeit – Nagy mintaszámok feldolgozása többlyukú lemezeken! Szerezzen kiváló minőségű mintákat, és szerezzen magas mintaszámokat a megbízható kutatási eredmények érdekében! És végül, de nem utolsósorban időt és pénzt takarít meg!
FFPE minta előkészítése megkönnyíti a nagy áteresztőképességű szonikálást
A formalin rögzítés és paraffin beágyazás (FFPE) a leggyakoribb módszer a szilárd szövetek megőrzésére és archiválására. A biomolekulák FFPE szövetmintákból történő kivonása gyakran jelentős kihívást jelent a tárolt minták minősége miatt. Ezek a minták, amelyek felbecsülhetetlen értéket jelentenek a molekuláris biológiában és a klinikai kutatásban, gazdag biológiai információforrást biztosítanak a retrospektív vizsgálatokhoz és a diagnosztikai biomarkerek validálásához. A formalin rögzítésének és a paraffin beágyazásának folyamata azonban, miközben megőrzi a szövetek architektúráját és morfológiáját, bonyolítja a kiváló minőségű nukleinsavak és fehérjék kivonását. A formalin indukálja a nukleinsavak és fehérjék térhálósodását, ami molekuláris fragmentációhoz és kémiai módosításokhoz vezet. Ismerje meg, hogyan győzi le a nagy áteresztőképességű ultrahangos UIP400MTP az FFPE minta előkészítésének kihívásait!
Ultrahangos készülék a hatékony FFPE minta előkészítéséhez
- Könnyen használható munkafolyamat: Egyszerűsített folyamatok, amelyek felhasználóbarátak.
- Deparafinizáció, fehérje extrakció, DNS / RNS nyírás
- Gyors, nagy áteresztőképességű feldolgozás: Több lyukú lemezek hatékony kezelése.
- Hatékony deparaffinizáció: A fehérjék jobb oldódása.
- Nem mérgező oldószerek: Elkerüli a káros szerves oldószerek, például a xilol használatát.
UIP400MTP nagy áteresztőképességű szonikátor nagy áteresztőképességű FFPE mintafeldolgozáshoz többlyukú lemezeken
Az FFPE szövetből származó fehérjekivonási technikák fejlődése
A Hielscher Ultrasonics foglalkozik a nagy áteresztőképességű FFPE minta előkészítésének kihívásaival. A szonikálás ultrahangos hullámokat alkalmaz mechanikai rezgések és fókuszált kavitáció létrehozására, hatékonyan megzavarva a sejtszerkezeteket és fokozva a biomolekulák oldódását. Ez a technika népszerűségre tett szert azon képessége miatt, hogy növeli a nukleinsav és fehérje extrakció hatékonyságát és hozamát az FFPE szövetekből, valamint a DNS és RNS nyírást a könyvtár előkészítéséhez. Nagyon fontos kiemelni, hogy az ultrahangos kezelés a UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor fenntartja ezeknek a biomolekuláknak az integritását a downstream alkalmazásokhoz.
Nukleinsav nyírás nagy áteresztőképességű ultrahangos kezeléssel
A többlyukú ultrahangos UIP400MTP a nagy áteresztőképességű beállításokhoz új szintre emeli az FFPE minták előkészítését. Ez a többlyukú lemezes szonikációs módszer hatékony és megbízható megoldást kínál több minta egyidejű feldolgozására. Megkönnyíti a DNS, RNS és fehérjék gyors és reprodukálható extrakcióját, amelyek kritikusak a különböző analitikai technikákhoz, beleértve a következő generációs szekvenálást (NGS), a kvantitatív PCR-t és a proteomikai elemzéseket. Az ultrahangos paraméterek, például az amplitúdó, az időtartam és a hőmérséklet optimalizálása tovább javítja az extrahált biomolekulák minőségét és mennyiségét.
A többlyukú lemezek UIP400MTP szonikátora jelentős előnyöket kínál a DNS és az RNS töredezettségéhez és nyírásához az FFPE szövetből. Ennek a rendszernek az egyik kiemelkedő jellemzője, hogy képes elérni a DNS és az RNS szűk fragmensméreteit, biztosítva az ultrahangos intenzitás pontos hangolhatóságát, hogy 150-200 bázispár (bp) vagy 15-20 kilobázispár hosszabb töredékeit (kbp) kapja. Ez a sokoldalúság nélkülözhetetlenné teszi a UIP400MTP mind a rövid, mind a hosszú olvasású szekvenálási alkalmazásokhoz, kiváló minőségű eredményeket biztosítva a következő generációs szekvenáláshoz (NGS) és a teljes genom szekvenáláshoz (WGS). A töredékméret pontos ellenőrzése kulcsfontosságú a genomika minden területén dolgozó kutatók számára, mivel lehetővé teszi a minták specifikáció szerinti előkészítését.
Lépjen kapcsolatba velünk az FFPE szövet fejlett megoldásaiért
Fedezze fel a UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátort az FFPE mintákból származó hatékony biomolekulák visszanyeréséhez, fenntartva az extrahált nukleinsavak és fehérjék integritását és biztosítva az eredmények reprodukálhatóságát. Ez a technológia zökkenőmentesen integrálódik más előkészítő és analitikai munkafolyamatokkal, egyszerűsítve és javítva a molekuláris vizsgálatokat az FFPE szövetarchívumok segítségével.
Fixálószerek és hatásaik
A rögzítés kulcsfontosságú lépés a minta előkészítésében, amely megőrzi a sejtszerkezeteket, megállítja a biokémiai reakciókat és megakadályozza a lebomlást. Különböző fixálószereket alkalmaznak az adott kísérleti követelményektől függően. A két leggyakoribb fixáló a formaldehid és a paraformaldehid, amelyek fehérjéket és nukleinsavakat kereszteznek, megőrizve a sejtek és szövetek morfológiáját és antigenitását. Más fixálószereket, például etanolt, metanolt és glutáraldehidet használnak speciális alkalmazásokhoz.
A formaldehid és a paraformaldehid fixálószerek metilén-hidakat képeznek az aminocsoportok között, ami fehérje térhálósodást eredményez. Ez a folyamat hatékonyan immobilizálja a sejtkomponenseket, megőrizve integritásukat a következő elemzési lépések során. Ezeknek a fixálószereknek a hatásait olyan tényezők befolyásolhatják, mint a koncentráció, a pH és a hőmérséklet, és ezeknek a paramétereknek az optimalizálása elengedhetetlen a sejtstruktúrák optimális megőrzéséhez.
Az ultrahangos FFPE készítmény előnyei
Az ultrahangos kezelés egy hatékony technika a rögzített sejtek és szövetek megzavarására, amely kiemelkedik a hagyományos technikákból. Számos figyelemre méltó előnyt kínál a hagyományos lízis módszerekkel szemben:
- Sebesség és hatékonyság: Az ultrahangos lízis a sejtek és szövetek gyors megzavarását biztosítja, jelentősen csökkentve a feldolgozási időt a mechanikai vagy kémiai lízis módszerekhez képest. Az ultrahangos szonda által generált nagyfrekvenciás hanghullámok mechanikai nyíróerőket hoznak létre, ami megzavarja a rögzített sejtszerkezeteket. Ez a gyors és hatékony zavar lehetővé teszi a kutatók számára, hogy rövid időn belül nagy mintamennyiségeket dolgozzanak fel.
- Gyengéd és állítható: Az ultrahangos lízis gyengéd zavaró mechanizmust kínál, amely minimalizálja az érzékeny biomolekulák, például fehérjék, nukleinsavak és enzimek károsodását. Ellentétben a mechanikai módszerekkel, amelyek túlzott hőt vagy nyíróerőket generálnak, az ultrahangos lízis szabályozott kavitációt alkalmaz a sejtek megzavarására, miközben megőrzi az intracelluláris komponensek integritását és funkcionalitását.
- Sokoldalúság: Az ultrahangos lízis különböző fixálószerekre alkalmazható, lehetővé téve a kutatók számára, hogy a rögzített minták széles skálájával dolgozzanak. Akár formaldehidet, paraformaldehidet vagy alternatív fixálószereket használ, az ultrahangos lízis következetesen hatékony megszakítást biztosít, biztosítva a sejtkomponensek optimális helyreállítását.
- Nagy hozam és minőség: Az ultrahangos lízis megkönnyíti az ép sejtkomponensek magas hozamát, mivel képes egyenletesen megzavarni a rögzített sejteket és szöveteket. Ez lehetővé teszi, hogy a későbbi alkalmazások, például a fehérjeelemzés, a nukleinsav-extrakció és az enzimatikus vizsgálatok megbízható és reprodukálható eredményeket hozzanak.
- Automatizálási kompatibilitás: Az ultrahangos lízis könnyen integrálható az automatizált rendszerekbe, lehetővé téve a nagy áteresztőképességű mintafeldolgozást. Ez a kompatibilitás lehetővé teszi a kutatók számára, hogy egyszerűsítsék munkafolyamataikat és növeljék a termelékenységet, különösen a nagyszabású tanulmányokban.
96 lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP mikrotiter és multiwell lemezek szonikálására
Az ultrahangos lízis forradalmasította a rögzített sejtek és szövetek megzavarását, számos előnyt kínálva a hagyományos lízis módszerekkel szemben. Gyorsasága, hatékonysága, szelektivitása, sokoldalúsága, magas hozama és automatizálási kompatibilitása nélkülözhetetlen eszközzé teszi a molekuláris biológia és a biotechnológiai kutatások terén. Kínálva érintés nélküli sonicatorok, valamint szonda típusú sonicator, Hielscher Ultrasonics kínál a legmegfelelőbb ultrahangos homogenizátor az élettudományi alkalmazás. Akár egyetlen mintát, több mintát vagy nagyon magas mintaszámot szeretne egyszerre feldolgozni, a legjobb ultrahangos készüléket kínáljuk Önnek, amely megfelel a kutatási és diagnosztikai követelményeknek.
További információ Hielscher érintés nélküli szonikátorok több minta és nagy áteresztőképességű minta előkészítéséhez!
- egyszeri befektetés
- Használja saját fogyóeszközeit
- Nincsenek ismétlődő költségek a szabadalmaztatott tartozékok és fogyóeszközök esetében
- Nagy áteresztőképesség
- precíziós vezérlés
- A legkorszerűbb technológia
- megbízhatóság & Erőteljesség
- állítható, precíz folyamatvezérlés
- ipari minőségű: folyamatosan működtethető 24/7
- könnyen és biztonságosan kezelhető
- Alacsony karbantartási igény
További információ az ultrahangos készülékek alkalmazásáról az élettudományban!
Lemez sonicator UIP400MTP bármely 96 lyukú lemezhez, mikrotiter lemezhez és több lyukú lemezhez.
Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség
A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!
UIP400MTP Ultrasonicator: Nagy áteresztőképességű FFPE mintaelőkészítés több lyuklemezben
GYIK
Az alábbiakban válaszolunk a gyakran feltett kérdésekre, amelyek relevánsak az FFPE szövet előkészítése és az FFPE minták ultrahangos kezelése szempontjából.
Hogyan készül az FFPE szövet?
Az FFPE szövet előkészítésének lépései: A friss szövetek aprólékos kezelése és feldolgozása kritikus fontosságú a kiváló minőségű FFPE minták előállításához. A sejtszerkezet, a nukleinsavak és a fehérjék megőrzésének biztosítása elengedhetetlen a pontos downstream elemzéshez. Minden lépés - a gyűjtéstől a beágyazásig - pontosságot igényel a minta integritásának megőrzése érdekében a különböző elemzésekhez, beleértve a szövettani vizsgálatot, az immunhisztokémiai és molekuláris vizsgálatokat. Megfelelően végrehajtva ez a rögzítési és beágyazási folyamat biztosítja, hogy a megőrzött szövet pontosan tükrözze az in vivo állapotot, lehetővé téve a megbízható diagnosztikai és kutatási eredményeket.
Végigvezetjük Önt az FFPE szövetminták beágyazási folyamatának 6 fő lépésén.
- Szövetgyűjtés
Az élő emlősökből és szövetkultúrákból származó biopsziák egyaránt életképes források az FFPE minta előkészítéséhez szükséges friss szövetek előállításához.
Fontos, hogy aszeptikus technikát alkalmazzunk: A szennyeződés elkerülése érdekében steril eszközöket és kesztyűt használjon. Ideális esetben steril környezetben, például sebészeti csomagban vagy lamináris áramlású burkolatban gyűjtse össze a szöveteket.
Mivel a minta nagyon törékeny, érzékeny kezelése elengedhetetlen: minimalizálja a feldolgozás késedelmét, és a kivágás után azonnal kezdje meg a szöveti feldolgozást. Ez elengedhetetlen az autolízis és a degradáció megelőzéséhez. Tartsa a szövetet szobahőmérsékleten; Kerülje a fagyasztást, mivel jégkristályképződést és szövetkárosodást okozhat. - Szöveti rögzítés
Először a szövetet fixáló oldattal kezeljük: Használjon 10% semleges pufferolt formalint (NBF), amely egyenértékű a vízben lévő 4% formaldehiddel, semleges pH-ra pufferelve.
Merítse a szövetet teljesen formalinba. Ügyeljen arra, hogy a fixálószer-szövet térfogatarány legalább 10:1 legyen. A rögzítési idő általában 6 és 24 óra között mozog, a szövet típusától és méretétől függően. Fontos, hogy a fixálószer alaposan behatoljon a szövetbe. A túlzott fixáció azonban keresztkötéshez vezethet, ami megnehezíti az antigén leszívását, míg az alulfixálás rossz szövetmegőrzést eredményezhet. - Szövetvágás
Másodszor, vágja le a szövetet körülbelül 3-5 mm vastagságra, hogy lehetővé tegye a fixálószer megfelelő behatolását. Biztosítsa a szövet megfelelő orientációját a releváns szövettani struktúrák rögzítéséhez. Ez megkönnyíti az extrakciós folyamatot, amikor a szövetet később elemzésre használják. - A rögzített minta feldolgozása
Most a rögzített szövetet dehidratálni kell: A rögzítés után a szövetet dehidratálni kell, hogy a paraffinviasz alaposan behatoljon. Vezesse át a szövetet egy osztályozott etanolsorozaton (70%, 80%, 90% és 100%) a víz eltávolításához.
Tisztítás xilollal: A paraffinviasz vízben nem oldódik, de xilolban oldódik. Ezért a szövetben lévő vizet xilollal kell helyettesíteni. Maga a xilol azonban vízben nem oldódik, de alkoholban oldódik, ami szükségessé tesz egy közbenső lépést, ahol a vizet először alkohollal helyettesítik. Merítse a szövetet xilolba vagy xilol helyettesítőbe az etanol eltávolításához, és készítse elő a szövetet a paraffin infiltrációhoz.
Infiltráció paraffinnal: Ágyazza be a szövetet olvadt paraffinviaszba, biztosítva a teljes beszivárgást. Ez a lépés általában a paraffin többszöri cseréjét foglalja magában az alapos impregnálás biztosítása érdekében. - A szövet beágyazása
Ebben a lépésben a szövetet szövetblokkba öntik: Helyezze a szövetet a kívánt orientációjú formába, és öntsön rá olvadt paraffint. Hagyjuk a paraffint szobahőmérsékleten vagy hideg tányéron történő hűtéssel megszilárdulni. - Szakaszolás és szerelés
Mikrotómia: A beágyazott szövet szeleteléséhez használjon mikrotómot, hogy vékony szakaszokat (általában 4-5 mikrométert) vágjon a paraffinblokkból. Ezután a mintát felszereljük, és a szakaszokat üveglemezekre helyezzük a későbbi festéshez és mikroszkópos elemzéshez.
Végül ellenőrizze a szövettan minőségét: Értékelje az első szakaszokat mikroszkóp alatt a megfelelő rögzítés és feldolgozás biztosítása érdekében. Szükség szerint módosítsa a protokollokat a szövettípus és a megfigyelt minőség alapján.
Az FFPE szövetek felhasználhatók RNS, DNS és fehérjék visszanyerésére, valamint rák vagy más betegség jeleinek felfedezésére. Évekig tárolhatók, és alapvető részét képezik annak, hogy a kutatók és az orvosok hogyan használják fel a szövetmintákat a diagnózishoz és a kutatáshoz.
Melyek az FFPE szövetekkel kapcsolatos gyakori problémák és kihívások?
A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetmintákat széles körben használják a kutatásban és a diagnosztikában, de számos kihívást és gyakori problémát jelentenek:
- Biomolekulák lebomlása: A hosszan tartó rögzítés a DNS, az RNS és a fehérjék lebomlásához vezethet, ami megnehezíti a kiváló minőségű nukleinsavak vagy fehérjék kivonását későbbi alkalmazásokhoz. A helyes rögzítés (az alul- és túlfixáció elkerülése) elengedhetetlen a szövetek megőrzéséhez.
- Antigén maszkolás: A fixációs folyamat elfedheti az antigén helyeket, csökkentve az antitestkötés hatékonyságát az immunhisztokémiai és egyéb immunológiai vizsgálatokban. Ez gyakran antigén leszívást igényel, olyan eljárást, amelynek során az epitóp maszkolása megfordul, és az epitóp-antitest kötődés helyreáll. A teljes antigenitás azonban nem mindig állítható helyre.
- Változtatható rögzítési minőség: A rögzítési idők és feltételek eltérései következetlen mintaminőséghez vezethetnek, ami befolyásolja az eredmények reprodukálhatóságát és összehasonlíthatóságát. Használjon megbízható rögzítési protokollokat, és kerülje az alul- és túlrögzítést.
- DNS-károsodás és fragmentáció: Az FFPE minták formalin rögzítése különböző típusú DNS-károsodást okozhat, beleértve a citozin dezaminációt (C-T mutációk), oxidatív károsodást (pl. 8-oxo-guanin, amely G-T mutációkhoz vezet), valamint fizikai zavarokat, például nickeket, réseket és abázisos helyeket, amelyek akadályozzák a DNS-polimeráz aktivitását. A formalin rögzítési folyamata a DNS fragmentációját okozhatja, ami bonyolítja a genetikai és genomikai elemzéseket, például a PCR-t és a szekvenálást.
- RNS minőség: Az FFPE szövetekből kivont RNS gyakran fragmentált és kémiailag módosított, ami megnehezíti a kiváló minőségű transzszkriptómiai elemzések elvégzését.
- Fehérje módosítások: A formalin kémiai módosításokat indukálhat a fehérjékben, befolyásolva azok szerkezetét és működését, ami zavarhatja a proteomikai elemzéseket.
- Mintafeldolgozási összetevők: A beágyazási és metszetezési folyamat során a mechanikai feszültség és a hő műtermékeket vezethet be, és további károsodást okozhat a szövetben.
- Tételenkénti variabilitás: A rögzítési és beágyazási protokollok eltérései a különböző tételek között az eredmények jelentős eltéréseihez vezethetnek, ami megnehezíti a vizsgálatok közötti összehasonlítást.
- Tárolási problémák: Az FFPE blokkok hosszú távú tárolása idővel további lebomláshoz és a nukleinsav integritásának elvesztéséhez vezethet, ami befolyásolja az archív minták életképességét retrospektív vizsgálatokhoz.
Térhálósítás: A formalin fixáció fehérjék és nukleinsavak térhálósodását okozza, ami akadályozhatja a molekuláris analízist, és befolyásolhatja az immunhisztokémia és más vizsgálatok pontosságát.
Az optimalizált protokollok használata, a gondos mintakezelés és a fejlett technikák alkalmazása segít javítani az FFPE szövetekből nyert adatok minőségét és megbízhatóságát.
Mi a különbség az FFPE és a fagyasztott szövet között?
Az FFPE (formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott) szövetet formalin segítségével megőrzik a szövet rögzítéséhez, majd paraffinviaszba ágyazzák, lehetővé téve a szobahőmérsékleten történő hosszú távú tárolást, miközben fenntartják a szövet morfológiáját. Ezzel szemben a fagyasztott szövet fagyasztással gyorsan megmarad, ami jobban megőrzi a nukleinsavak és fehérjék integritását, de nagyon alacsony hőmérsékleten történő tárolást igényel.
Milyen vegyszereket használnak az FFPE beágyazásához?
Az FFPE beágyazásához használt vegyi anyagok általában formalint tartalmaznak a rögzítéshez és paraffinviaszt a beágyazáshoz. Az FFPE beágyazáshoz a szöveteket általában 10% (v/v) semleges pufferolt formalinnal (FA) vagy frissen készített 4% (w/v) formaldehid oldattal (PFA) rögzítik, amely paraformaldehid porból készül. A formalint, amely a formaldehid vizes oldata, semleges pH-ra pufferelik a szövetek morfológiájának megőrzése és a túlzott térhálósodás megelőzése érdekében. A paraformaldehid alapú oldat hatékony rögzítést is biztosít a fehérjék térhálósításával, ezáltal stabilizálva a szövetszerkezetet a paraffinviaszba történő későbbi beágyazáshoz. Ezek a vegyi anyagok elengedhetetlenek a szövetek integritásának és morfológiájának fenntartásához a rögzítési és beágyazási folyamat során.
Hogyan távolítják el a paraffint az FFPE mintákból?
A paraffin FFPE mintákból történő eltávolításához a szövetrészeket jellemzően xilolos mosások sorozatának vetik alá, majd alkoholok és végül víz osztályozott sorozatán keresztül rehidratálják. Mivel a xilol nagyon mérgező, egészségügyi kockázatokat jelent, mint például a légzőszervi problémák, bőrirritáció, és lehetséges hosszú távú hatások ismételt expozícióval, az ultrahangos paraffin eltávolítása ígéretes alternatívaként jelenik meg számos laboratóriumban. Ez a módszer intenzív ultrahangos hullámokat használ a paraffin hatékony és biztonságos eltávolítására mérgező oldószerek, például xilol nélkül, ezáltal csökkentve a laboratóriumi személyzet kockázatát és biztonságosabb munkakörnyezetet teremtve.
Mennyi ideig kell rögzítenem a szöveteimet a jó FFPE mintaminőség érdekében?
A rögzítés időtartamára vonatkozó általános ajánlások általában azt javasolják, hogy a szövetmintákat formalinban rögzítsék 24-48 órán keresztül. Ez az időtartam általában elegendő a szöveti morfológia és a sejtstruktúrák megőrzéséhez, miközben minimalizálja a túlzott rögzítést, ami a nukleinsavak és fehérjék túlzott térhálósodásához és lebomlásához vezethet. Az optimális rögzítési idő azonban a szövet méretétől és típusától függően változhat, kisebb vagy finomabb minták rövidebb rögzítési időt igényelnek. Alapvető fontosságú a megfelelő rögzítés kiegyensúlyozása a szöveti autolízis és lebomlás megelőzése érdekében, elkerülve ugyanakkor a hosszan tartó rögzítést, amely bonyolíthatja a későbbi molekuláris elemzéseket.