Ultrahangos DNS fragmentáció a következő generációs szekvenáláshoz
A következő generációs szekvenálás (NGS) megköveteli a genomikus DNS megbízható nyírását és fragmentációját a genomikus DNS-szálak szekvenálásához és a genomkönyvtárak létrehozásához. A DNS DNS-töredékekké való ellenőrzött fragmentálása alapvető mintaelőkészítési lépés, amely a DNS szekvenálása előtt szükséges. Ultrahangos bizonyított, mint hatékony és megbízható technika DNS töredezettség bizonyos hosszúságú. Ultrahangos DNS fragmentációs protokollok elérni reprodukálható fragmentációs eredményeket. A Hielscher ultrahangosok képesek genomikus DNS-fragmentum méreteloszlások széles skáláját előállítani, amelyek pontosan szabályozhatók a működési paramétereken keresztül. Mivel a Hielscher ultrahangos DNS nyíró rendszerek állnak rendelkezésre egy- és több injekciós üvegek, valamint a mikrolemezek, minta előkészítése válik rendkívül hatékony.
Elektroforetikus analízis genomi DNS-ének E. coli EDL933 vetjük alá 0 - 15 perc ultrahangos kezeléssel. L jelzi a DNS létrát. (Basselet et al. 2008)
- megismételhető / reprodukálható eredmények
- pontosan állítható bizonyos töredékhossz eléréséhez
- gyors feldolgozáshoz
- konzisztens DNS-fragmentációs eredmények
- bármilyen mintamennyiségre (pl. több injekciós üveg vagy mikrolemez)
- nagy áteresztőképesség
- pontos hőmérséklet-szabályozás
- egyszerű, felhasználóbarát működés
Következő generációs szekvenálás: Ultrahangos DNS-fragmentáció a könyvtár előkészítéséhez
A következő generációs szekvenálás elvégzéséhez el kell végezni az (1) könyvtári előkészítés, (2) a szekvenálás és a (3) adatelemzés három alapvető lépését. A könyvtár előkészítése során a DNS töredezett, majd a töredékvégeket egyetlen adeninalap hozzáadásával javítják (polírozzák), és a céldarabokat kettős szálú DNS-sé alakítják. Végül az úgynevezett adaptereket szalagozással, PCR-rel vagy tagmentációval rögzítik, hogy a végső könyvtár DNS-terméke szekvenálható legyen.
DNS fragmentáció Sonication segítségével: Különösen akkor, ha a rövid olvasott szekvenálási technológiák, mint például az Illumina, amely nem tudja könnyen olvasni a hosszabb DNS-töredékeket, a DNS-állványokat egy bizonyos méretre kell törni, amelyet ultrahanggal megbízhatóan el lehet érni.
Az ultrahangos kezelés megbízhatóan használható DNS, RNS és kromatin fragmentációhoz.
Hogyan működik ultrahangos DNS fragmentáció munka?
Sonication, más néven akusztikus minta feldolgozás, egy széles körben használt módszer a DNS töredezettség. Az ultrahangos DNS-nyírás, a minták vannak kitéve ultrahangos hullámok ellenőrzött állapotban. Az ultrahangos DNS töredezettség működési elve az ultrahanghullámok által generált rezgéseken és kavitáción alapul. Az ultrahangos (akusztikus) kavitációból eredő nyíróerők nagy molekulatömegű DNS molekulákat törnek meg. Az olyan szonikáció beállítása, mint az intenzitás (amplitúdó, időtartam), a pulzálási mód és a hőmérséklet lehetővé teszi a DNS-fragmentáció pontos meghatározását a DNS-töredékek bizonyos kívánt hosszáig. Míg a DNS gyakran csökken 100-600 bp ultrahangos kezeléssel, hosszabb DNS-töredékek akár 1300 bp lehet beszerezni, ha enyhébb ultrahangos feltételeket alkalmaznak.
Ultrahangos DNS nyírás során ChIP – kromatin immunprecipitációs
Átdolgozott Jkwchui alatt CC-BY-SA.03
Hőmérséklet-szabályozás a DNS lebomlásának megakadályozására
A DNS kettős szálú molekuláris alakja rendkívül érzékeny a magas hőmérsékletre, így a hőmérséklet pontos szabályozása a minta előkészítési lépései során kulcsfontosságú tényező a megbízható elemzési eredmények szempontjából.
Akár Hielscher szonda ultrahangos készülékek, a VialTweeter vagy az UIP400MTP – a folyamatos hőmérséklet-monitorozás és szabályozás a csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelőnek és az intelligens eszköz szoftverének köszönhetően biztosított. Annak érdekében, hogy a hőmérséklet egy bizonyos tartományon belül tartható, beállíthat egy felső és alsó hőmérsékleti határértéket. Következésképpen az ultrahangosító szünetel, amint ezt a hőmérsékleti határértéket túllépik, és automatikusan tovább szonikál, ha a hőmérséklet egy meghatározott ∆T.
A Hielscher ultrahangos berendezések kifinomult szoftvere biztosítja az ideális mintakezelési feltételek megbízható fenntartását.
Tömeges minta DNS fragmentáció az UIP400MTP multi-well plate ultrasonicator
Az élettudományok mintaszámai jelentősen megnőttek az elmúlt évtizedben. Ez azt jelenti, hogy a minták előkészítése és elemzése során mikrolemezenként nagyon nagy számú mintát (pl. 384, 1536 vagy 3456 kutat) kell feldolgozni következetesen egyenlő feltételek mellett, összehasonlítható és érvényes eredmények elérése érdekében. Az UIP400MTP-vel a Hielscher Ultrasonics követi a tömeges mintafeldolgozás trendét. Az UIP400MTP egy ultrahangos minta előkészítése mikrolemezek. Az UIP400MTP 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 vagy 3456 kutakkal képes feldolgozni a lemezeket. A mikrolemez típusától függően minden kút jellemzően több tíz nanoliter és több milliliter közötti mintamennyiséget képes tárolni. Széles körben használják az élettudományi kutatás, az UIP400MTP nagyon gyakran használják a minta előkészítése előtt vizsgálatok, mint például ELISA (enzim-kapcsolt immunsorbens vizsgálat) vagy PCR, fehérje analitika előtt, valamint a kromatin készítmény előtt CHiP és CHiP-seq, histone módosítás azonosítása, és egyéb analitikai kezelések (pl. gél elektroforézis, tömegspektrometria).
A VialTweeter minta praparáció legfeljebb 10 injekciós üveg
A VialTweeter egy széles körben használt laboratóriumi ultrahangos VialTweeter, amely lehetővé teszi a hatékony és kényelmes szonikálás akár 10 injekciós üveg egyszerre. Mivel az injekciós üvegek és kémcsövek (pl. Eppendorf injekciós üvegek, krio injekciós üvegek, centrifugacsövek) közvetetten szonikálódnak, elkerülhető a keresztszennyeződés. Mivel minden mintához ugyanazt az ultrahang intenzitást adják, az összes ultrahangos eredmény homogén és reprodukálható. A VialTweeter minden olyan intelligens funkciót kínál, mint más digitális eszközeink (pl. intelligens menü, programozható beállítások, hőmérséklet-szabályozás, távirányító stb.), hogy a legmagasabb felhasználói kényelmet biztosítsa.
Többujjas szondák Microwell lemezekhez
Elérhető az ultrahangos szonda homogenizálók UP200Ht és UP200St, többujjas szondák 4 vagy 8 ujjal egy kényelmes lehetőség, hogy sonicate több mintát ugyanabban az időben azonos körülmények között. Például a sonotrode MTP-24-8-96 egy nyolcujjas szonda, amely ideális az automatizált rendszerekbe való integrációhoz vagy a többkúti lemezek kutáinak hatékony kézi mintaelőkészítéséhez. A többujjas sonotrode ideális laboratóriumok automatizált, ahol többnyire csőr és kémcsövek segítségével szabványos ultrahangos sonotrode dolgozzák fel. A többujjas és szabványos szondák néhány percen belül gyorsan megváltoztathatók, és az egyszondás ultrahangos szondát többszondás ultrahangos diszruptorrá alakítják.
Hielscher ultrahangosok DNS töredezettség
Hielscher Ultrasonics kínál különböző ultrahang-alapú platformok DNS, RNS, és a kromatin fragmentáció. Ezek a különböző platformok közé tartoznak az ultrahangos szondák (szonotródok), közvetett ultrahangos megoldások több cső vagy több kútlemez egyidejű mintavételi előkészítéséhez (pl. 96-kútlemezek, mikrotiter lemezek), szonoreactors és ultrahangos cuphornok. A DNS-nyírás minden platformját frekvenciahangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok hajtják, amelyek pontosan szabályozhatók és reprodukálható eredményeket biztosítanak.
Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mérethez
A Hielscher többmintás ultrahangos vialTweeter (akár 10 kémcső) és UIP400MTP (mikrolemezek / multiwell lemezek) segítségével könnyen lehetővé válik a minta feldolgozási idejének csökkentése az intenzív és pontosan szabályozható ultrahangos kezelésnek köszönhetően, miközben megkapja a kívánt DNS-fragmentum méreteloszlást és hozamot. Ultrahangos DNS töredezettség teszi minta előkészítése hatékony, megbízható és skálázható. A protokollok lineárisan skálázhatók egyről számos mintára, folyamatosan ellenőrzött ultrahang alkalmazásával.
Az egy-öt ujjal rendelkező szonda ultrahangok ideálisak kisebb mintaszámok előkészítéséhez. A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékei különböző méretekben állnak rendelkezésre, így az alkalmazáshoz és a követelményekhez ideális készüléket ajánlunk.
pontos folyamatszabályozás
A pontosan szabályozható ultrahangos beállítások kulcsfontosságúak, mivel a teljes szonifikáció elpusztíthatja a DNS-t, az RNS-t és a kromatint, de a nem megfelelő ultrahangos nyírás túl hosszú DNS- és kromatin-töredékeket eredményez. Hielscher digitális ultrahangos könnyen beállítható pontos ultrahangos paraméter. A speciális szonikációs beállítások programozott beállításként is elmenthetők ugyanazon eljárás gyors ismétléséhez.
Minden szonikálás automatikusan protokollal történik, és CSV fájlként tárolódik egy beépített SD-kártyán. Ez lehetővé teszi az elvégzett kísérletek pontos dokumentálását, és lehetővé teszi az ultrahangos kezelés egyszerű felülvizsgálatát.
A böngésző távirányítón keresztül az összes digitális ultrahangos eszköz bármilyen szabványos böngészőn keresztül működtethető és felügyelhető. További szoftverek telepítése nem szükséges, mivel a LAN-kapcsolat nagyon egyszerű plug-n-play beállítást teszi lehetővé.
A legmagasabb felhasználóbarát az ultrahangos mintaelőkészítésben
Minden Hielscher ultrahangos készüléket úgy terveztek, hogy nagy teljesítményű ultrahangot biztosítson, miközben mindig nagyon felhasználóbarát és könnyen kezelhető. Minden beállítás jól strukturált egy világos menüben, amely könnyen elérhető színes érintőképernyővel vagy böngésző távirányítóval. A programozható beállításokkal és automatikus adatrögzítéssel rendelkező intelligens szoftver optimális szonikációs beállításokat biztosít a megbízható és reprodukálható eredmények érdekében. A tiszta és könnyen használható menüfelület a Hielscher ultrahangos készülékeket felhasználóbarát és hatékony eszközökké nyitja.
Az alábbi táblázat jelzi laboratóriumi ultrahangosaink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását, amelyek ideálisak a minta előkészítésére, mint például a DNS és az RNS fragmentációja, a sejtlízis, valamint a fehérje extrakció:
| Eszköz | Teljesítmény [W] | típus | Kötet [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | mikrolemezek esetében | 6 – 3456 kutak | VialTweeter | 200 | akár 10 injekciós üveg plusz befogó lehetőség | 00,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Szonda-típusú | 00,01 – 250 |
| UP100H | 100 | Szonda-típusú | 00,01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Szonda-típusú | 0.1. – 1000 |
| UP200St | 200 | Szonda-típusú | 0.1. – 1000 |
| UP400St | 400 | Szonda-típusú | 5,0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | szennyeződésmentes áramlási sejt |
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!
Az ultrahangos többmintás előkészítő egység VialTweeter lehetővé teszi akár 10 injekciós üveg egyidejű szonikálását. A VialPress szorítóeszközzel akár 4 további cső is nyomható az elejére az intenzív szonikálás érdekében.
A összehegeszthetősége MTP-24-8-96 nyolc ultrahangos szondák a szonikálás a kutak a mikrotiter lemezek.
Irodalom / Referenciák
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Tudni érdemes
Mi az új generációs szekvenálás?
A következő generációs szekvenálás, más néven Next Gen Sequencing (NGS), a nagy áteresztőképességű szekvenálás vagy a második generációs szekvenálás a masszív párhuzamos szekvenálás megközelítésére utal, ahol nagyon nagy (hatalmas) mennyiségű, több millió darabból álló DNS-t szekvenálnak párhuzamosan futásonként.
A következő generációs szekvenálás elvégzéséhez el kell végezni az (1) könyvtári előkészítés, (2) a szekvenálás és a (3) adatelemzés három alapvető lépését. A könyvtári előkészítés során a DNS-szálakat bizonyos hosszúságú DNS-töredékekre kell törni. A szonikálás az egyik legkedveltebb technika a DNS töredezettségére.
A DNS-szekvenálás folyamata során a DNS-ben lévő nukleotidok sorrendje – nukleinsav-szekvencia néven ismert – meghatározásra kerül. A nukleinsav-szekvencia négy nukleotid bázisból áll – adenin, citozin, guanin, timin – melyik kódot.
A következő generációs szekvenálás az élettudományi és a személyre szabott orvoslás kutatásának motorja, mivel a DNS és az RNS szekvenálást erősen használják a genomikai kutatásban, a rákkutatásban, a ritka és összetett betegségek kutatásában, a mikrobiális kutatásban, az agrigenomikában és sok más kutatási területen.
Következő generációs szekvenálás vs Sanger szekvenálás
Míg a következő generációs szekvenálással (NGS) nagyszámú genomikus mintát lehet szekvenálni, a Sanger Szekvenálás (más néven láncmegszüntetési módszer vagy első generációs szekvenálás) csak kis mintaszámok szekvenálására képes. Sanger szekvenálása egyszerre csak egyetlen DNS-töredéket szekvenál, és egyetlen nap alatt megvalósítható. A sangeri szekvenálást akkkréciója miatt aranyszabvány-technológiának is tekintik, amelyet a következő generációs szekvenálás eredményeinek ellenőrzésére használnak.
A Sanger szekvenálás körülbelül 800bp olvasási hosszt ér el (jellemzően 500-600bp nem dúsított DNS-sel). A Sanger szekvenálás hosszabb olvasási hossza jelentős előnyöket mutat más szekvenálási módszerekkel szemben, különösen a genom ismétlődő régióinak szekvenálása szempontjából. A rövid olvasott szekvenciaadatok kihívása különösen az új genomok (de novo) szekvenálása és az erősen átrendezett genomszegmensek szekvenálása, jellemzően a rákos genomok vagy a szerkezeti eltéréseket mutató kromoszómák régióiban tapasztaltak. [cp. Morozova és Marra, 2008]
Hielscher Ultrahang gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok Labor nak nek ipari méretben.