Ultrahangos DNS-töredezettség a következő generációs szekvenáláshoz
A következő generációs szekvenálás (NGS) megköveteli a genomi DNS megbízható nyírását és fragmentálását a genomi DNS-szálak szekvenálásához és genomkönyvtárak létrehozásához. A DNS DNS-fragmensekre történő szabályozott fragmentálása alapvető minta-előkészítési lépés, amely a DNS szekvenálása előtt szükséges. Az ultrahangos kezelés bizonyítottan hatékony és megbízható technika bizonyos hosszúságú DNS-fragmentációhoz. Az ultrahangos DNS-fragmentációs protokollok reprodukálható fragmentációs eredményeket érnek el. A Hielscher ultrasonicators képes a genomi DNS-fragmens méreteloszlások széles skáláját előállítani, pontosan szabályozható a működési paramétereken keresztül. Mivel a Hielscher ultrahangos DNS-nyíró rendszerek egy- és többinjekciós üvegekhez, valamint mikrolemezekhez állnak rendelkezésre, a minta előkészítése rendkívül hatékony lesz.
A UIP400MTP lemezes szonikátor A nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez egyenletesen szonikálja a mintákat több lyukú, mikrotiter lemezekben és 96 lyukú lemezekben
- Megismételhető? reprodukálható eredmények
- pontosan állítható bizonyos töredékhossz eléréséhez
- Gyors feldolgozás
- konzisztens DNS-fragmentációs eredmények
- bármilyen mintatérfogat kezelésére szolgáló eszközök (pl. több injekciós üveg vagy mikrolemez)
- Nagy áteresztőképesség
- Precíz hőmérséklet-szabályozás
- egyszerű, felhasználóbarát kezelés
Következő generációs szekvenálás: Ultrahangos DNS-fragmentáció a könyvtár előkészítéséhez
A következő generációs szekvenálás elvégzéséhez el kell végezni a (1) könyvtár-előkészítés, (2) a szekvenálás és (3) az adatelemzés három alapvető lépését. A könyvtár előkészítése során a DNS-t fragmentálják, majd a fragmensvégeket egyetlen adeninbázis hozzáadásával javítják (polírozzák), és a célfragmenseket kettős szálú DNS-sé alakítják. Végül az úgynevezett adaptereket ligálással, PCR-rel vagy tagmentációval csatlakoztatják, hogy a végső könyvtári DNS-termék mennyiségileg meghatározható legyen a szekvenáláshoz.
DNS fragmentáció szonikálással: Különösen akkor, ha a rövid olvasású szekvenálási technológiák, mint például az Illumina, amely nem tudja könnyen olvasni a hosszabb DNS-fragmenseket, a DNS-állványokat egy bizonyos méretre kell töredezni, amely ultrahanggal megbízhatóan elérhető.
Az ultrahangos kezelés megbízhatóan használható DNS, RNS és kromatin fragmentációhoz.
Következő generációs szekvenálás – Könyvtár előkészítése
Az ultrahangos DNS-fragmentációt általában a DNS-szekvenálási könyvtárak előkészítésében alkalmazzák a következő generációs szekvenálási (NGS) platformok számára. Ezt a technikát arra használják, hogy a DNS-molekulákat a kívánt mérettartományú kisebb töredékekre bontsák, ami megkönnyíti a könyvtár előkészítésének következő lépéseit. Az ultrahangos DNS-fragmentáció jellemzően az NGS-munkafolyamatok könyvtár-előkészítési lépése során szükséges, hogy a genomi DNS-t kisebb darabokra fragmentálja, amelyek alkalmasak a későbbi feldolgozásra és szekvenálásra. Döntő szerepet játszik a szekvenálási kísérlet sikerének biztosításában azáltal, hogy az alkalmazott szekvenáló platformnak megfelelő mérettartományú DNS-fragmenseket hoz létre.
Az E. coli EDL933 genomi DNS-ének elektroforetikus elemzése 0-15 perces ultrahangos kezelésnek van kitéve. L jelzi a DNS-létrát. (Basselet et al. 2008)
Új generációs szekvenálás – A folyamat lépései:
- Ultrahangos DNS-töredezettség: A könyvtár építése előtt a genomi DNS-t kisebb, könnyebben kezelhető darabokra tördelik. Az ultrahangos fragmentáció nagyfrekvenciás hanghullámok használatát foglalja magában a DNS-molekulák kívánt mérettartományú töredékekké történő nyírására. Ez a lépés kulcsfontosságú, mert segít biztosítani, hogy a később létrehozott szekvenálási olvasások megfelelő hosszúságúak legyenek a használt szekvenálási platformhoz. A fragmensek mérettartománya a szekvenálási kísérlet speciális követelményei alapján állítható be.
- Klonális amplifikáció PCR-rel: Az ultrahangos fragmentáció után a DNS-fragmensek végső javításon, adapter ligáláson és PCR-amplifikáción mennek keresztül, hogy létrehozzák a végső DNS-szekvenálási könyvtárakat. Ezek a lépések előkészítik a fragmentált DNS-molekulákat a szekvenálási folyamatra a szekvenáló platformhoz való kötődéshez szükséges adapterszekvenciák hozzáadásával és a PCR-amplifikáció alapozóhelyeinek biztosításával.
- DNS-szekvenálás szintézissel: A szekvenálási könyvtárak elkészítése után megkezdődik a szintézissel történő DNS-szekvenálás (SBS) folyamata. Az SBS során a DNS-szekvenciát a nukleotidok szekvenciális hozzáadásával határozzuk meg a komplementer szálhoz. Ez a lépés magában foglalja a nukleotid beépítésének, képalkotásának és hasításának ciklikus reakcióit, lehetővé téve a DNS-szekvencia meghatározását a beépített nukleotidok által kibocsátott fluoreszcens jelek alapján.
- Masszívan párhuzamos szekvenálás: Az utolsó lépésben a térben elkülönített, felerősített DNS-sablonokat egyidejűleg, masszívan párhuzamosan szekvenáljuk. Ez a nagy áteresztőképességű szekvenálási megközelítés lehetővé teszi több millió vagy milliárd szekvenálási olvasás generálását egyetlen szekvenálási menetben, lehetővé téve a DNS-szekvenciák hatékony és gyors meghatározását.
Hogyan működik az ultrahangos DNS-töredezettség?
Sonication, más néven akusztikus minta feldolgozás, széles körben használt módszer a DNS fragmentálására. Az ultrahangos DNS-nyíráshoz a mintákat ultrahangos hullámoknak tesszük ki ellenőrzött körülmények között. Az ultrahangos DNS-fragmentáció működési elve az ultrahanghullámok által generált rezgéseken és kavitáción alapul. Az ultrahangos (akusztikus) kavitációból eredő nyíróerők megszakítják a nagy molekulatömegű DNS-molekulákat. Az ultrahangos kezelés, például az intenzitás (amplitúdó, időtartam), pulzálási mód és hőmérséklet beállítása lehetővé teszi a pontos DNS-fragmentációt a DNS-fragmensek bizonyos kívánt hosszáig. Míg a DNS gyakran 100-600 bp-re csökken ultrahangos kezeléssel, hosszabb DNS-fragmensek akár 1300 bp-ig is elérhetők, ha enyhébb ultrahangos körülmények között alkalmazzák.
Ultrahangos DNS-nyírás a ChIP alatt – Kromatin immunprecipitáció
Hőmérséklet-szabályozás a DNS lebomlásának megakadályozására
A DNS kettős szálú molekuláris alakja nagyon érzékeny a magas hőmérsékletre, így a minta előkészítési lépései során a hőmérséklet pontos szabályozása döntő tényező a megbízható elemzési eredmények szempontjából.
Whether you are using Hielscher’s probe ultrasonicators, the VialTweeter or the UIP400MTP – A folyamatos hőmérséklet-felügyeletet és -szabályozást a csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelő és az intelligens eszköz szoftvere biztosítja. Annak érdekében, hogy a hőmérsékletet egy bizonyos tartományon belül tartsa, beállíthat egy felső és alsó hőmérsékleti határértéket. Következésképpen az ultrahangos készülék szünetel, amint ezt a hőmérsékleti határértéket túllépik, és automatikusan folytatja az ultrahangos kezelést, ha a hőmérséklet egy beállított ∆T-vel csökkent.
A Hielscher ultrasonicators kifinomult szoftvere biztosítja az ideális mintakezelési feltételek megbízható fenntartását.
Tömegminta DNS fragmentáció a UIP400MTP Multi-Well lemezes ultrahangosítóval
Az élettudományok területén a minták száma jelentősen nőtt az elmúlt évtizedben. Ez azt jelenti, hogy nagyon nagy számú mintát (pl. mikrolemezenként 384, 1536 vagy 3456 vájatot) kell feldolgozni a minta előkészítése és elemzése során következetesen egyenlő feltételek mellett, hogy összehasonlítható és érvényes eredményeket kapjunk. A UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics követi a tömeges mintafeldolgozás trendjét. A UIP400MTP egy ultrahangos készülék a minta előkészítéséhez mikrolemezekkel. A UIP400MTP 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 vagy 3456 kúttal rendelkező lemezeket képes feldolgozni. A mikrolemez típusától függően az egyes vájatok jellemzően több tíz nanoliter és több milliliter közötti mintatérfogatot képesek tárolni. Az élettudományi kutatásokban széles körben használt UIP400MTP nagyon gyakran használják a minták előkészítésére olyan vizsgálatok előtt, mint az ELISA (enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat) vagy a PCR, a fehérjeelemzés előtt, valamint kromatin előkészítésére CHiP és CHiP-seq előtt, hiszton módosítás azonosítására és egyéb analitikai kezelésekre (pl. gélelektroforézis, tömegspektrometria).
Tudjon meg többet a PCR lemezek nagy áteresztőképességű feldolgozásáról!
A VialTweeter akár 10 injekciós üveg mintavételezéséhez
A VialTweeter egy széles körben használt laboratóriumi ultrasonicator VialTweeter, amely lehetővé teszi a hatékony és kényelmes ultrahangos kezelést akár 10 injekciós üveg egyszerre. Mivel az injekciós üvegeket és a kémcsöveket (pl. Eppendorf injekciós üvegek, krio fiolák, centrifugacsövek) közvetetten ultrahanggal kezelik, elkerülhető a keresztszennyeződés. Mivel ugyanazt az ultrahang intenzitást szállítják minden mintához, minden szonikációs eredmény homogén és reprodukálható. A VialTweeter minden intelligens funkciót kínál, mint más digitális eszközeink (pl. intelligens menü, programozható beállítások, hőmérséklet-szabályozás, távirányító stb.), Hogy a legmagasabb felhasználói kényelem biztosított legyen.
Többujjas szondák mikrolyukú lemezekhez
Elérhető ultrahangos szonda homogenizátorok UP200Ht és UP200St, többujjas szondák 4 vagy 8 ujjal kényelmes lehetőség több minta egyidejű ultrahangos kezelésére azonos körülmények között. Például az MTP-24-8-96 szonotród egy nyolc ujjas szonda, amely ideális az automatizált rendszerekbe való integráláshoz vagy a többlyukú lemezek kútjainak hatékony kézi mintaelőkészítéséhez. A többujjas sonotrode ideális automatizált laboratóriumokhoz, ahol többnyire főzőpoharakat és kémcsöveket használnak szabványos ultrahangos sonotrode segítségével. A többujjas és a standard szondák néhány percen belül gyorsan cserélhetők, átalakítva az egyszondás ultrahangos készüléket többszondás ultrahangos zavaróvá.
Hielscher ultrahangos készülékek DNS-töredezettséghez
A Hielscher Ultrasonics különböző ultrahang alapú platformokat kínál a DNS, RNS és kromatin töredezettséghez. Ezek a különböző platformok közé tartoznak az ultrahangos szondák (sonotrodes), közvetett szonikációs megoldások több cső vagy több lyukú lemez egyidejű mintaelőkészítéséhez (pl. 96-lyukú lemezek, mikrotiter lemezek), szonoreaktorok, és ultrahangos cuphorns. A DNS-nyírás minden platformját frekvenciahangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok táplálják, amelyek pontosan vezérelhetők és reprodukálható eredményeket nyújtanak.
Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mérethez
With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes sample preparation efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constantly controlled ultrasound.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s laboratory ultrasonicators are available at various sizes so that we can recommend you the ideal device for your application and requirements.
precíz folyamatvezérlés
Precisely controllable sonication settings are crucial since exhaustive sonification can destroy DNA, RNA and chromatin, but inadequate ultrasonic shearing results in too long DNA and chromatin fragments. Hielscher’s digital ultrasonicators can be easily set to precise sonication parameter. Specific sonication settings can be also saved as programmed setting for fast repetition of the same procedure.
Minden szonikáció automatikusan protokollálódik és CSV fájlként tárolódik egy beépített SD-kártyán. Ez lehetővé teszi az elvégzett vizsgálatok pontos dokumentálását, és lehetővé teszi az ultrahangos futtatások egyszerű felülvizsgálatát.
A böngésző távirányítóján keresztül minden digitális ultrahangos készülék működtethető és felügyelhető bármely szabványos böngészőn keresztül. Nincs szükség további szoftver telepítésére, mivel a LAN-kapcsolat nagyon egyszerű plug-n-play beállítást tesz lehetővé.
A legmagasabb felhasználóbarát az ultrahangos mintaelőkészítésben
Minden Hielscher ultrasonicators úgy tervezték, hogy nagy teljesítményű ultrahangot nyújtson, ugyanakkor mindig nagyon felhasználóbarát és könnyen kezelhető. Minden beállítás jól strukturált, áttekinthető menüben, amely könnyen elérhető színes érintőképernyővel vagy böngésző távirányítóval. Az intelligens szoftver programozható beállításokkal és automatikus adatrögzítéssel biztosítja az optimális szonikációs beállításokat a megbízható és reprodukálható eredmények érdekében. A tiszta és könnyen használható menüfelület a Hielscher ultrasonicatorokat felhasználóbarát és hatékony eszközökké alakítja.
Az alábbi táblázat jelzi laboratóriumi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását, amelyek ideálisak mintaelőkészítési feladatokhoz, például DNS és RNS fragmentációhoz, sejtlízishez, valamint fehérje extrakcióhoz:
| Eszköz | Teljesítmény [W] | Típus | Térfogat [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | mikrolemezekhez | 6 – 3456 kút | VialMagassugárzó | 200 | Akár 10 injekciós üveghez, plusz befogási lehetőség | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | szonda típusú | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | szonda típusú | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | szonda típusú | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | szonda típusú | 0.1 – 1000 |
| UP400ST | 400 | szonda típusú | 5.0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, szonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | szennyeződésmentes áramlási cella |
Kapcsolat!? Kérdezzen tőlünk!
Az ultrahangos többmintás előkészítő egység VialMagassugárzó Lehetővé teszi legfeljebb 10 injekciós üveg egyidejű ultrahangos kezelését. A VialPress szorítókészülékkel legfeljebb 4 további csövet lehet elöl nyomni az intenzív szonikáláshoz.
Az MTP-24-8-96 szonotród nyolc ultrahangos szondával rendelkezik a mikrotiter lemezek kútjainak szonikálására.
Irodalom? Hivatkozások
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Tények, amelyeket érdemes tudni
Mi az a következő generációs szekvenálás?
A következő generációs szekvenálás, más néven Next Gen Sequencing (NGS), nagy áteresztőképességű szekvenálás vagy második generációs szekvenálás a masszív párhuzamos szekvenálás megközelítésére utal, ahol nagyon nagy (masszív) mennyiségű DNS-t szekvenálnak párhuzamosan párhuzamosan futásonként.
A következő generációs szekvenálás elvégzéséhez a
- könyvtár előkészítése,
- szekvenálás, és
- adatelemzés
kötelező.
A könyvtár előkészítése során a DNS-szálakat bizonyos hosszúságú DNS-fragmensekké kell fragmentálni. A szonikálás az egyik előnyben részesített technika a DNS fragmentálására.
A DNS-szekvenálás során a nukleotidok sorrendje a DNS-ben – nukleinsav-szekvencia néven ismert - meghatározzák. A nukleinsavszekvencia négy nukleotidbázisból áll - adenin, citozin, guanin, timin – melyik információs kód.
A következő generációs szekvenálás az élettudományok és a személyre szabott orvoslás kutatásának mozgatórugója, mivel a DNS- és RNS-szekvenálást nagymértékben használják a genomikai kutatásban, a rákkutatásban, a ritka és összetett betegségek kutatásában, a mikrobiális kutatásban, az agrogenomikában és sok más kutatási területen.
Új generációs szekvenálás vs Sanger szekvenálás
Míg a következő generációs szekvenálással (NGS) nagyszámú genomi minta szekvenálása lehetséges, a Sanger szekvenálás (más néven láncvégződési módszer vagy első generációs szekvenálás) csak kis számú minta szekvenálására képes. A Sanger szekvenálás egyszerre csak egyetlen DNS-fragmenst szekvenál, és egyetlen nap alatt elvégezhető. Akkurátussága miatt a Sanger szekvenálást aranystandard technológiának is tekintik, amelyet a következő generációs szekvenálással kapott eredmények ellenőrzésére használnak.
A Sanger szekvenálás körülbelül 800 bp olvasási hosszúságot ér el (jellemzően 500-600 bp nem dúsított DNS-sel). A Sanger szekvenálás hosszabb olvasási hossza jelentős előnyöket mutat más szekvenálási módszerekkel szemben, különösen a genom ismétlődő régióinak szekvenálása szempontjából. A rövid olvasású szekvencia adatok kihívása különösen az új genomok szekvenálása (de novo) és az erősen átrendezett genomszegmensek szekvenálása során jelent problémát, jellemzően a rákos genomokban vagy a kromoszómák szerkezeti variációt mutató régióiban. [vö. Morozova és Marra, 2008]
DNS – Dezoxiribonukleinsav – Formái és funkciói
A DNS minden formája egyedi jellemzőkkel és alkalmazásokkal rendelkezik, hozzájárulva a kutatási területek széles spektrumához, beleértve az onkológiát, a genetikát, a törvényszéki tudományt és az evolúciós biológiát. A Hielscher szonikátorok rendkívül hatékony és megbízható megoldás a DNS és RNS izolálására és fragmentálására elemzési célokra. Az alábbi listában elmagyarázzuk a DNS konkrét formáit, és biológiai kontextusuk és funkcióik alapján kategorizáljuk őket:
- Genomikus DNS (gDNS)
Genomikus DNS (gDNS): A szervezet teljes DNS-készlete, beleértve mind a kódoló (géneket), mind a nem kódoló régiókat. - Extracelluláris DNS
Keringő tumor DNS (ctDNS): A tumorsejtek által a véráramba kibocsátott DNS-töredékek.
Sejtmentes DNS (cfDNS): A véráramban szabadon keringő DNS-töredékek, amelyek különböző szövetekből származnak. - Extrakromoszómális körkörös DNS (eccDNS): Körkörös DNS-molekulák, amelyek az eukarióta sejtekben a kromoszómákon kívül találhatók.
Vírus DNS: Vírusokból származó DNS, akár a gazdagenomba integrálva, akár episzomális DNS-ként. - mitokondriális DNS
Mitokondriális DNS (mtDNS): A mitokondriumokban található, anyai úton öröklött és az energiatermelésben részt vevő DNS. - plazmid DNS
Plazmid DNS: Kis, körkörös DNS-molekulák, amelyek a kromoszóma DNS-től függetlenül replikálódnak, általában baktériumokban találhatók és a génsebészetben használatosak. - nukleáris DNS
Nukleáris DNS (nDNS): Az eukarióta sejtek magjában található DNS, amely a szervezet genetikai anyagának többségét tartalmazza. - Egysejtű DNS
Egysejtű DNS (scDNS): Egyetlen sejtből kivont DNS, amelyet részletes genomikai elemzéshez használnak az egyes sejtek szintjén. - Rekombináns DNS
Rekombináns DNS (rDNS): DNS-molekulák, amelyeket genetikai rekombináció laboratóriumi módszereivel hoztak létre több forrásból származó genetikai anyag egyesítésére. - Speciális űrlapok
Környezeti DNS (eDNS): Környezeti mintákból (talaj, víz) gyűjtött DNS a forrásszervezetek elkülönítése nélkül
Ősi DNS (aDNS): Az ősi példányokból kivont DNS, amely betekintést nyújt az evolúciós biológiába és az ősi populációkba. - Kromoszóma DNS
Kromoszóma DNS: DNS, amely a sejtmagon belüli kromoszómákat alkotja, beleértve mind a kódoló, mind a nem kódoló régiókat. - Vírusos és szintetikus formák
Vírus DNS: Vírusokból származó DNS, amelyek vagy integrálhatók a gazdaszervezet genomjába, vagy önálló entitásként létezhetnek.
Szintetikus DNS: Kémiai folyamatok során mesterségesen szintetizált DNS-szekvenciák, amelyeket gyakran használnak a kutatásban és a biotechnológiában.
Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.