Drosophila melanogaster széles körben használják a laboratóriumokban, mint modell szervezet. Ezért gyakran el kell végezni az olyan analitikai előkészítési lépéseket, mint a lízis, a sejtzavar, a fehérjekivonás és a Drosophila melanogaster minták DNS nyírása. Ultrahangos dismembrators megbízható és hatékony, és lehet használni, hogy végre különböző feladatokat, mint a lízis, fehérje extrakció vagy DNS töredezettség könnyedén csak kiigazításával ultrahangos folyamat paramétereit. Ultrahangos homogenizátorok ezáltal rugalmas eszközök széles körű alkalmazások.

Ultrahangos lezis és fehérje extrakció

Lízis, sejt oldódás, szövethomogenizálás és fehérje extrakciós tipikus feladatok ultrahangos dismembrators biológiai laboratóriumokban. Ultrahangos dismembrátorok és sejt diszruptorok kiválóan alkalmas homogenizálni állati szövetek, rovarok (pl. Drosophila melanogaster, C. elegans) vagy növényi példányok. Későbbi alkalmazása hozzákeverésével a lezissejt szuszpenziók és pellet, valamint az intracelluláris fehérjék kivonása.
Az ultrahangos lezis és fehérjeextrakció rendkívül megbízható és reprodukálható folyamatok, amelyek a megállapított protokollok alapján végezhetők el. Mivel ultrahangos folyamat intenzitása lehet pontosan beállítani keresztül szonikálás paraméterek, mint az amplitúdó, ciklus / impulzus mód, hőmérséklet és a minta térfogata, ha bevált protokollok lehet ismételni az azonos eredményt újra és újra.

Ultrahangos DNS és RNS fragmentáció

A sejtlízis és a fehérjeeltávolítás után a mintaelőkészítés közös szükséges lépése a DNS, az RNS és a kromatin nyírása és töredezettsége, pl. a kromatin immunoprecipitáció (ChIP) előtt. A DNS és az RNS töredezettsége megbízhatóan elérhető a kovalens kötések megtörésével, amelyek fizikai erőkkel tartják össze a DNS-t. A fizikai nyírás, mint a szonikálás, először a DNS szálak törött, majd a DNS töredezett kisebb darabokra.
Az ultrahangos DNS-fragmentáció megbízható és hatékony a DNS célzott hosszúságú, pl. 500bp (bázispárok) nyírásában. Az ultrahangos DNS-töredezettség fő előnyei közé tartozik az ultrahangos folyamat paramétereinek és intenzitásának pontos szabályozása. Az ultrahangos folyamat paramétereit lehet beállítani tuning szonikálás intenzitása, ciklusok és idő pontosan. Ez lehetővé teszi a kívánt DNS-méretek létrehozását, és a célzott DNS-hossz megbízhatóan előállítható és reprodukálható. Ultrahangos DNS nyíró is ideális, hogy hozzon létre nagy molekulatömegű DNS töredékek.

Protokollok ultrahangos lezise Drosophila melanogaster

Az alábbiakban megtalálható a különböző protokollok az ultrahangos rázatással kell támogatott lazis, fehérje extrakció, és a DNS vagy kromatin fragmentáció drosophila minták.

Ultrahangos lezis keresztkötő immuncipcipitációs (CLIP) vizsgálathoz

CLIP vizsgálatot végeztek, mint korábban jelentett néhány módosítást. Körülbelül 20 mg petefészket 0- 1 napos vad típusú nőstények UV keresztre kötő (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizált jégen 1 mL RCB pufferben (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM szacharóz, 1 mM DTT, 1× EDTA-mentes teljes proteáz gátlók, 1 mM PMSF) kiegészítve 300 U RNAseOUT és jégre helyezett 30 percig. A homogenát volt sonicated a jégen, 80%-os teljesítmény, ötször 20 s tört egy 60 s pihenés között használja a Hielscher ultrahangos processzor UP100H (100 W, 30 kHz) és centrifugálták (16000 × g 5 min 4°C-on). Az oldható kivonatot 20 μl Protein-G dynabeads-szal előtisztították 20 min 4°C-on. Az RNS-bemenet immunoblottálására és mennyiségi meghatározására szolgáló minták eltávolítása után a HP1-et 450 μl-es precleared kivonatból 4 órán át 50 μl Protein-G dynabeaadal inkubálással immun-recipitálták anti-HP1 9A9 antitesttel. Az immuncipcipittákat 4-szer mossák RCB-vel. Az immunszercipitúdált RNS elutálásához a pelletált gyöngyöket 100 μL UltraPure DEPC-vel kezelt vízben forralták 5 min. 900 μL Qiazol reagenshozzáadásával az RNS-előkészítéshez visszanyert felülúszóhoz. Az RNS tisztított használták, mint egy sablont szintetizálni cDNS segítségével oligo dT, véletlenszerű hexamers és SuperScript reverse transcriptase III szerint a gyártó protokoll.
(Cassale és mtsai. 2019)

Ultrahangos lazis kromatin immuncipcipitációs vizsgálathoz

A kromatin immunoprecipitációt a Menet által leírt módszer szerint, kisebb módosításokkal hajtották végre. Körülbelül 20 mg 0- 1 napos vadon élő nőstényből származó petefészket homogenizáltak 1 mL NEB pufferben (10 mM HEPES-Na pH-8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH-ban 8, 0,5 mM EDTA-Na pH-on 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA- mentes teljes proteáz-gátlók) homogenizátor / merítés diszpergálószerrel 1 perc (3000 rpm). A homogenátot egy előhűtött üveg dounce-ra helyezték át, és 15 teljes löketet alkalmaztak szűk mozsárban. A szabad atommagokat ezután 6000xg-on centrifugálták 10 percig 4°C-on. A magokat tartalmazó pelleteket 1 mL NEB-ben újraszuszpendálták, és 20000 × g-on centrifugálták 20 percig szacharóz gradiensen (0,65 mL 1,6 M szacharóz NEB-ben, 0,35 mL 0,8 M szacharóz NEB-ben). A pelletet 1 mL NEB-ben és formaldehidben 1%. A nukleinokat szobahőmérsékleten 10 percig keresztbe kapcsolták, és 1/10 térfogatszázalék 1,375 M glicin hozzáadásával oltották ki. Az atommagokat centrifugálással gyűjtötték össze 6000 × g 5 percig. Az atommagokat kétszer mossák 1 mL NEB-ben, és 1 mL Lízispufferben (15 mM HEPES-Na pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH-on 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine és 1× EDTA-mentes teljes proteázgátlók). Nuclei voltak sonicated segítségével Hielscher ultrahangos processzor UP100H (100 W, 30 kHz) hatszor 20 s-on és 1 min jégen. Sonicated magok voltak centrifuged a 13000 × g 4 perc 4 °C-on. A legtöbb sonicated kromatin volt 500 a 1000 bázis pár (bp) hosszú. Minden immunszprecipezéshez 15 μg kromatint inkubáltak 10 μg HP1 9A9 monoklonális ellenanyag jelenlétében (3 óra 4°C-on forgó kerékben). Ezután 50 μl dinabeads Protein G-t adtak hozzá, és az inkubációt egy éjszakán át 4°C-on folytatták. A felülúszókat kidobták, és a mintákat kétszer mossák lazispufferben (mindegyik 15 min-t 4 °C-on mossa le) és kétszer TE pufferben (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8-kor). A kromatint két lépésben eluálták a gyöngyökből; először 100 μl eluition puffer1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8- on) 65 °C-on 15 min-en, majd centrifugálás és a felülúszó visszanyerése. Gyöngyök anyag újra extraháljuk 100 μl TE + 0,67% SDS. A kombinált eluátátot (200 μl) egy éjszakán át 65°C-on inkubálták, hogy megfordítsák a keresztkapcsolódást, és 50 μg/ml RNaseA-val kezelték 15 min 65 °C-on és 500 μg/ml Proteináz K-vel 3 órán át 65 °C-on. A mintákat fenol-kloroform extrahálták és etanolt kitekethettek. A DNS-t 25 μl vízben újra szuszpendálták. A molekuláris analízisek DNS-immuncipcipitennel történő maximalizálása érdekében a jelölt géneket párban erősítették fel egy optimalizált duplex-PCR protokoll segítségével, két különböző, hasonló olvadási hőmérsékletű primerkészletet használva egyetlen reakcióban.
(Casale és mtsai. 2019)
 

Nagy teljesítményű ultrahangos cella diszruptorok biológiai mintákhoz

Hielscher Ultrasonics az Ön régóta tapasztalt partnere, amikor a nagy teljesítményű ultrasonicators a sejt zavar, lezis, fehérje extrakció, DNS, RNS, és a kromatin töredezettség, valamint más pre-analitikai minta előkészítése lépéseket. Kínál egy átfogó portfolió ultrahangos labor homogenizátorok és minta előkészítő egységek, Hielscher az ideális ultrahangos eszköz a biológiai alkalmazás és a követelmények.
Klasszikus szonda típusú ultrasonicator mikro-tip, mint a UP200St (200W; lásd a bal oldali képet) vagy az egyik ultrahangos minta-előkészítő egység VialTweeter vagy UP200St_TD_CupHorn a VialHolder-rel a kutatási és analitikai laboratóriumok kedvenc modelljei. A klasszikus ultrahangos szonda ideális, amikor kevesebb mintát kell lysed, extraháljuk vagy töredezett. A minta előkészítő egységek VialTweeter és UP200St_TD_CupHorn lehetővé teszi konszoltaniktálás akár 10 vagy 5 injekciós üveg, ill.
Ha nagy mintaszámokat (pl. 96-kútlemezeket, mikrotiterlemezeket stb.) kell feldolgozni, a UIP400MTP az ideális szonikálás beállítás. Az UIP400MTP úgy működik, mint egy nagyobb cuphorn, amely tele van vízzel, és elég hely, hogy tartsa mikro-kút lemezek. Powered by egy 400 watt erős ultrahangos processzor, a UIP400MTP szállít egy nagyon egységes és intenzív szonikálás a multi-well lemezek annak érdekében, hogy megzavarják a sejtek, lizin minták, oldódáspellet, kivonat fehérjék vagy nyíró DNS.

Precíz vezérlés intelligens szoftverrel

Minden Hielscher szonikálás megoldások 200 watt felfelé felvannak szerelve egy digitális színes érintőképernyő és egy intelligens szoftver. Keresztül az intelligens adatok protokollt minden ultrahangos folyamat paraméterek automatikusan menti a CSV fájlt a beépített SD-kártya, amint a ultrasonicator elindul. Ez teszi a kutatás és protokollozás sokkal kényelmesebb. Miután a szonikálás vizsgálatok vagy minta előkészítése, akkor egyszerűen felülvizsgálja a szonikálás paramétereit minden szonikálás fut, és hasonlítsa össze őket.
Az intuitív menün keresztül számos paraméter előre beállítható a szonikálás előtt: Például a minta hőmérsékletének szabályozása és hőcsökkenésének megakadályozása érdekében a minta hőmérsékletének felső határa állítható be. A csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelő, amely jön az ultrahangos egység, ad az ultrahangos processzor visszajelzést a tényleges szonikálás hőmérséklete. A felső hőmérsékleti határérték elérésekor az ultrahangos készülék addig szünetel, amíg el nem értékelik a beállított ∆T alsó határát, majd automatikusan újra elkezdi a hangzást.
Ha szonikálás egy adott energia bevitel szükséges, akkor előre be a végső ultrahangos energia a szonikálás futni. Természetesen az ultrahangos pulzálás és a ciklus mód is egyénileg beállítható.
A legsikeresebb szonikálási paraméterek újrafelhasználása érdekében különböző szonikálási módokat menthet (pl. szonikálási idő, intenzitás, ciklus mód stb.), előre beállított módként, hogy könnyen és gyorsan újraindulhassanak.
A nagyobb működési kényelem érdekében minden digitális ultrahangos egység böngészőtávirányítón keresztül működtethető bármely közös böngészőben (pl. InternetExplorer, Safari, Chrome stb.). A LAN-kapcsolat egy egyszerű plug-n-play beállítás, és nem igényel további szoftvertelepítést.
Mi a Hielschernél tudjuk, hogy a biológiai minták sikeres szonikálása pontosságot és ismételhetőséget igényel. Ezért úgy terveztük, a ultrasonicators, mint intelligens eszközök minden olyan funkcióval, amely lehetővé teszi a hatékony, megbízható, reprodukálható és kényelmes minta előkészítése.

Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását az ultrahangos mikrohegyek és a klasszikus ultrahangos homogenizátoroktól a MultiSample ultrahangosítókig számos minta kényelmes és megbízható elkészítéséhez: