Drosophila melanogaster minták ultrahangos lízise

A Drosophila melanogastert széles körben használják laboratóriumokban modellszervezetként. Ezért gyakran kell elvégezni az analitikus előtti előkészítési lépéseket, például lízist, sejtzavart, fehérjeextrakciót és DNS-nyírást a Drosophila melanogaster mintákon. Az ultrahangos dismembrátorok megbízhatóak és hatékonyak, és különböző feladatok, például lízis, fehérjekivonás vagy DNS-fragmentáció elvégzésére használhatók könnyedén, csak ultrahangos folyamatparaméterek beállításával. Az ultrahangos homogenizátorok ezáltal rugalmas eszközök, széles körű alkalmazásokkal.

Ultrahangos lízis és fehérje extrakció

A lízis, a sejtoldódás, a szövethomogenizálás és a fehérje extrakció tipikus feladatok az ultrahangos dismembrátorok számára a biológiai laboratóriumokban. Az ultrahangos diszmembrátorok és sejtzavarók jól alkalmazhatók állati szövetek, rovarok (pl. Drosophila melanogaster, C. elegans) vagy növényi minták homogenizálására. Az ultrahangos kezelés későbbi alkalmazásai a sejtszuszpenziók és pelletek lízise, valamint az intracelluláris fehérjék kivonása.
Az ultrahangos lízis és a fehérje extrakció rendkívül megbízható és reprodukálható folyamatok, amelyek a megállapított protokollok alapján hajthatók végre. Mivel az ultrahangos folyamat intenzitása pontosan beállítható szonikációs paramétereken keresztül, mint például amplitúdó, ciklus / impulzus mód, hőmérséklet és minta térfogata, miután bizonyított protokollok megismételhetők ugyanazzal az eredménnyel újra és újra.

Ultrahangos DNS és RNS töredezettség

A sejtlízis és a fehérjeextrakció után a mintaelőkészítés gyakori szükséges lépése a DNS, RNS és kromatin nyírása és fragmentálása, pl. kromatin immunprecipitáció (ChIP) előtt. A DNS és az RNS fragmentációja megbízhatóan elérhető a DNS-t fizikai erők által összetartó kovalens kötések megszakításával. Fizikai nyírással, például szonikálással, először a DNS-szálak megszakadnak, majd a DNS kisebb darabokra töredezik.
Az ultrahangos DNS-fragmentáció megbízható és hatékony a DNS célzott hosszúságra, pl. 500bp (bázispárok) nyírására. Az ultrahangos DNS-fragmentáció fő előnyei közé tartozik az ultrahangos folyamatparaméterek és intenzitás pontos szabályozása. Az ultrahangos folyamatparaméterek beállíthatók az ultrahangos intenzitás, a ciklusok és az idő pontos beállításával. Ez lehetővé teszi a kívánt DNS-méretek létrehozását, és a megcélzott DNS-hossz megbízhatóan előállítható és reprodukálható. Az ultrahangos DNS-nyírás ideális nagy molekulatömegű DNS-fragmensek létrehozásához is.

A Drosophila melanogaster ultrahangos lízisének protokolljai

Az alábbiakban különböző protokollokat talál a Drosophila minták ultrahanggal segített líziséhez, fehérje extrakciójához és DNS vagy kromatin fragmentációjához.

Ultrahangos lízis térhálósító immunprecipitáció (CLIP) vizsgálathoz

A CLIP vizsgálatot a korábban leírtak szerint végeztük, néhány módosítással. Körülbelül 20 mg petefészket 0-1 napos vad típusú nőstényekből UV-térhálósított (3 × 2000 μJ/cm2), jégen homogenizáltak 1 ml RCB pufferben (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM szacharóz, 1 mM DTT, 1× EDTA-mentes teljes proteázgátló, 1 mM PMSF), kiegészítve 300 U RNSseOUT-tal és jégre helyezve 30 percre. A homogenizátumot jégen ultrahanggal ultrahangoztuk, 80% -os teljesítményen, ötször 20 másodperces sorozatokban, 60 másodperces pihenéssel a Hielscher ultrahangos processzor segítségével UP100H (100 W, 30 kHz) és centrifugáljuk (16000 × g 5 percig 4 °C-on). Az oldható extraktumot 20 μl protein-G dinabegyöngyökkel 20 percig 4°C-on előtisztítottuk. Az immunoblot és az RNS-bevitel mennyiségi meghatározása (1%) céljából vett minták eltávolítása után a HP1-et anti-HP1 9A9 antitesttel immunkicsapattuk 450 μl előtisztított kivonatból 4 órán át 50 μl Protein-G dinabőgyöngyökkel végzett inkubálással. Az immuncsapadékokat 4-szer mostuk RCB-vel. Az immunkicsapódott RNS-ek eluálásához a pelletált gyöngyöket 100 μl UltraPure DEPC-vel kezelt vízben 5 percig forraltuk. 900 μl Qiazol reagenst adtunk az RNS-készítmény előállításához visszanyert felülúszóhoz. A tisztított RNS-t sablonként használták cDNS szintetizálására oligo dT, véletlenszerű hexamerek és SuperScript reverz transzkriptáz III felhasználásával a gyártó protokollja szerint.
(Cassale et al. 2019)

Ultrahangos lízis kromatin immunprecipitációs vizsgálathoz

A kromatin immunprecipitációt a Menet által leírt módszer szerint végeztük kisebb módosításokkal. Körülbelül 20 mg petefészket homogenizáltunk 0-1 napos vad típusú nőstényektől 1 ml NEB pufferben (10 mM HEPES-Na 8,0 pH-n, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na 8-as pH-n, 0,5 mM EDTA-Na 8-as pH-n, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-mentes teljes proteázgátlók) homogenizátorral / merülő diszpergálószerrel 1 perc alatt (3000 fordulat / percnél). A homogenizátumot egy előhűtött üvegcseppre vittük át, és 15 teljes ütemet alkalmaztunk szoros mozsártörővel. A szabad atommagokat ezután 6000xg-on centrifugálták 10 percig 4 °C-on. A magtartalmú pelleteket 1 ml NEB-ben szuszpendáltuk, és 20000 × g-n 20 percig centrifugáltuk szacharózgradiensen (0,65 ml 1,6 M szacharóz NEB-ben, 0,35 ml 0,8 M szacharóz NEB-ben). A pelletet 1 ml NEB-ben és formaldehidben szuszpendáltuk 1% -os végső koncentrációig. Az atommagokat szobahőmérsékleten 10 percig térhálósították, majd 1/10 térfogat 1,375 M glicin hozzáadásával leállították. Az atommagokat centrifugálással gyűjtöttük 6000 × g-n 5 percig. A sejtmagokat kétszer átmostuk 1 ml NEB-ben, majd 1 ml lízispufferben szuszpendáltuk újra (15 mM HEPES-Na 7,6 pH-n, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA 8-as pH-n, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-dezoxikolát, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroil-szarkozin és 1× EDTA-mentes teljes proteázgátlók). A magokat Hielscher ultrahangos processzorral ultrahangosítottuk UP100H (100 W, 30 kHz) hatszor 20 másodpercig és 1 percig jégen. Az ultrahangos magokat centrifugáltuk 13000 × g-n 4 percig 4 ° C-on. Az ultrahangos kromatin többsége 500-1000 bázispár (bp) hosszú volt. Minden immunprecipitáció esetében 15 μg kromatint inkubáltunk 10 μg HP1 9A9 monoklonális ellenanyag jelenlétében (3 óra 4°C-on forgó kerékben). Ezután 50 μl protein G dinagyöngyöt adtunk hozzá, és az inkubálást egy éjszakán át 4°C-on folytattuk. A felülúszókat el kellett dobni, és a mintákat kétszer kellett mosni lízispufferben (mindegyik mosás 15 percig 4 °C-on) és kétszer TE-pufferben (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl 8-as pH-n). A kromatint két lépésben eluálták a gyöngyökből; először 100 μl 100 μl 1. eluiciós pufferbe (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl 8-as pH-n) 65 °C-on 15 percig, majd centrifugálás és a felülúszó visszanyerése. A gyöngyök anyagát 100 μl TE + 0,67% SDS-ben extraháltuk újra. Az egyesített eluátumot (200 μl) egy éjszakán át 65 °C-on inkubáltuk fordított keresztkötések céljából, és 50 μg/ml RNázA-val kezeltük 15 percig 65 °C-on, majd 500 μg/ml proteináz K-val 3 órán keresztül 65 °C-on. A mintákat fenol-kloroformmal extraháltuk és etanolt csaptunk ki. A DNS-t 25 μl vízben szuszpendáltuk. Az immunkicsapódott DNS-sel végzett molekuláris elemzések maximalizálása érdekében a jelölt géneket párokban amplifikáltuk egy optimalizált duplex-PCR protokollon keresztül, két különböző, hasonló olvadási hőmérsékletű primerkészlet felhasználásával egyetlen reakcióban.
(Casale et al. 2019)
 

Nagy teljesítményű ultrahangos sejtzavarók biológiai mintákhoz

A Hielscher Ultrasonics az Ön régóta tapasztalt partnere, amikor nagy teljesítményű ultrahangos készülékekről van szó a sejtek megzavarásához, lízishez, fehérje extrakcióhoz, DNS-hez, RNS-hez és kromatin fragmentációhoz, valamint más pre-analitikai minta-előkészítési lépésekhez. Az ultrahangos laboratóriumi homogenizátorok és mintaelőkészítő egységek átfogó portfólióját kínálja, a Hielscher ideális ultrahangos készüléket kínál biológiai alkalmazásához és követelményeihez.
Klasszikus szonda típusú ultrahangos készülék mikro-hegygel, mint például a UP200St (200W; lásd a bal oldali képet) vagy az egyik ultrahangos mintaelőkészítő egység VialMagassugárzó vagy UP200St_TD_CupHorn a VialHolderrel a kutató- és analitikai laboratóriumok kedvenc modelljei. A klasszikus ultrahangos szonda ideális, ha kevesebb mintát kell lizálni, extrahálni vagy töredezni. A VialTweeter és UP200St_TD_CupHorn mintaelőkészítő egységek lehetővé teszik legfeljebb 10 vagy 5 injekciós üveg egyidejű ultrahangos kezelését.
Ha nagy számú mintát (pl. 96-lyukú lemezek, mikrotiterlemezek stb.) kell feldolgozni, a UIP400MTP az ideális szonikációs beállítás. A UIP400MTP úgy működik, mint egy nagyobb csészeszarv, amely tele van vízzel, és elegendő hely van a mikrokút lemezek tárolására. Powered by egy 400 wattos erős ultrahangos processzor, a UIP400MTP biztosítja a nagyon egyenletes és intenzív szonikáció több lyukú lemezek annak érdekében, hogy megzavarja a sejteket, lizálja a mintákat, oldja a pelleteket, extraháló fehérjék vagy nyírja a DNS-t.

Precíz vezérlés intelligens szoftverrel

Minden Hielscher szonikációs megoldás 200 watttól felfelé digitális színes érintőképernyővel és intelligens szoftverrel van felszerelve. Az intelligens adatprotokollon keresztül az összes ultrahangos folyamatparaméter automatikusan mentésre kerül CSV fájlként egy beépített SD-kártyán, amint az ultrahangos készülék elindul. Ez sokkal kényelmesebbé teszi a kutatást és a protokollálást. Az ultrahangos vizsgálatok vagy a minta előkészítése után egyszerűen áttekintheti az egyes ultrahangos futtatások szonikációs paramétereit és összehasonlíthatja őket.
Az intuitív menüben számos paraméter előre beállítható az ultrahangos kezelés előtt: Például a minta hőmérsékletének szabályozásához és a termikus lebomlás megakadályozásához beállítható a minta hőmérsékletének felső határa. A dugaszolható hőmérséklet-érzékelő, amely az ultrahangos egységhez tartozik, visszajelzést ad az ultrahangos processzornak a tényleges ultrahangos hőmérsékletről. A felső hőmérsékleti határérték elérésekor az ultrahangos készülék szünetel, amíg el nem éri a beállított ∆T alsó határát, majd automatikusan újra szonikálni kezd.
Ha ultrahangos kezelésre van szükség egy adott energiabevitellel, előre beállíthatja az ultrahangos futás végső ultrahangos energiáját. Természetesen az ultrahangos pulzálás és a ciklus üzemmód egyedileg is beállítható.
A legsikeresebb szonikációs paraméterek újbóli felhasználásához különféle szonikációs módokat (pl. Szonikációs idő, intenzitás, ciklus mód stb.) előre beállított módként menthet el, hogy könnyen és gyorsan újraindulhassanak.
A nagyobb működési kényelem érdekében minden digitális ultrahangos egység működtethető a böngésző távirányítóján keresztül bármely általános böngészőben (pl. InternetExplorer, Safari, Chrome stb.). A LAN-kapcsolat egyszerű plug-n-play beállítás, és nem igényel további szoftvertelepítést.
Mi a Hielschernél tudjuk, hogy a biológiai minták sikeres szonikálása pontosságot és megismételhetőséget igényel. Ezért úgy terveztük ultrahangos készülékeinket, mint intelligens eszközöket, amelyek minden olyan funkcióval rendelkeznek, amelyek lehetővé teszik a hatékony, megbízható, reprodukálható és kényelmes mintaelőkészítést.

Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását ultrahangos mikrotippektől és klasszikus ultrahangos homogenizátoroktól a MultiSample ultrasonicatorokig számos minta kényelmes, megbízható előkészítéséhez: