Drosophila Melanogaster minták ultrahangos lízise

A Drosophila melanogastert széles körben használják modellorganizmusként a laboratóriumokban. Ezért gyakran kell elvégezni a Drosophila melanogaster minták analízis előtti előkészítési lépéseit, például a lízist, a sejtfeltárást, a fehérjeextrakciót és a DNS nyírását. Az ultrahangos sejtfeltárók megbízhatóak és hatékonyak, és pusztán az ultrahangos folyamatparaméterek beállításával könnyedén használhatók különféle feladatok, például lízis, fehérjeextrakció vagy DNS-fragmentálás elvégzésére. Az ultrahangos homogenizátorok így rugalmas, széles alkalmazási körrel rendelkező eszközök.

Ultrahangos lízis és fehérjeextrakció

A lízis, a sejtek szolubilizálása, a szövetek homogenizálása és a fehérjeextrakció az ultrahangos sejtfeltárók tipikus feladatai a biológiai laboratóriumokban. Az ultrahangos sejtfeltárók kiválóan alkalmasak állati szövetek, rovarok (pl. Drosophila melanogaster, C. elegans) vagy növényi minták homogenizálására. Az ultrahangos kezelés további alkalmazásai közé tartozik a sejtszuszpenziók és pelletek lízise, valamint az intracelluláris fehérjék extrakciója.
Az ultrahangos lízis és fehérjeextrakció rendkívül megbízható és reprodukálható folyamatok, amelyek bevált protokollok alapján végezhetők el. Mivel az ultrahangos folyamat intenzitása pontosan beállítható a kezelés olyan paramétereivel, mint az amplitúdó, a ciklus- / impulzusüzemmód, a hőmérséklet és a mintatérfogat, az egyszer már bevált protokollok újra és újra megismételhetők ugyanazzal az eredménnyel.

DNS és RNS ultrahangos fragmentálása

A sejtlízis és a fehérjeextrakció után a minta-előkészítés során gyakran szükséges lépés a DNS, az RNS és a kromatin nyírása és fragmentálása, például a kromatin-immunprecipitáció (ChIP) előtt. A DNS és az RNS fragmentálása megbízhatóan elérhető a DNS-t összetartó kovalens kötések fizikai erőkkel történő felbontásával. Fizikai nyírás, például ultrahangos kezelés alkalmazásakor először a DNS-szálak szakadnak el, majd a DNS kisebb darabokra fragmentálódik.
Az ultrahangos DNS-fragmentálás megbízható és hatékony módszer a DNS célzott hosszúságúra, például 500bp (bázispár) hosszúságúra történő nyírásához. Az ultrahangos DNS-fragmentálás fő előnyei közé tartozik az ultrahangos folyamatparaméterek és az intenzitás pontos szabályozása. Az ultrahangos folyamatparaméterek a kezelés intenzitásának, ciklusainak és időtartamának pontos beállításával módosíthatók. Ez lehetővé teszi a kívánt DNS-méretek létrehozását, és a célzott DNS-hosszúság megbízhatóan előállítható és reprodukálható. Az ultrahangos DNS-nyírás nagy molekulatömegű DNS-fragmentumok létrehozására is ideális.

Protokollok a Drosophila melanogaster ultrahangos líziséhez

Az alábbiakban különféle protokollokat talál a Drosophila minták ultrahanggal segített líziséhez, fehérjeextrakciójához, valamint DNS- vagy kromatinfragmentálásához.

Ultrahangos lízis keresztkötéses immunprecipitációs (CLIP) vizsgálathoz

A CLIP-vizsgálatot a korábban leírtak szerint, néhány módosítással végezték. A 0–1 napos vad típusú nőstényekből származó, körülbelül 20 mg petefészket UV-fénnyel keresztkötötték (3 × 2000 μJ/cm2), jégen homogenizálták 300 U RNAseOUT-tal kiegészített 1 mL RCB pufferben (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM szacharóz, 1 mM DTT, 1× EDTA-mentes Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF), majd 30 min időtartamra jégre helyezték. A homogenátumot jégen, 80%-os teljesítményen, öt alkalommal, 20 s időtartamú impulzusokkal, közöttük 60 s pihenőidővel kezelték ultrahanggal a Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) ultrahangos processzorral, majd centrifugálták (16 000 × g, 5 min, 4°C). Az oldható kivonatot 20 μl Protein-G dynabeads gyönggyel 20 min időtartamig, 4°C-on előtisztították. Az immunblothoz és a kiindulási RNS mennyiségi meghatározásához szükséges minták (1%) kivétele után a HP1-et anti-HP1 9A9 antitesttel immunprecipitálták 450 μl előtisztított kivonatból, 50 μl Protein-G dynabeads gyönggyel 4 h időtartamig inkubálva. Az immunprecipitátumokat 4 alkalommal mosták RCB-vel. Az immunprecipitált RNS-ek eluálásához a leülepített gyöngyöket 100 μL UltraPure DEPC-kezelt vízben 5 min időtartamig forralták. Az RNS-előkészítéshez visszanyert felülúszóhoz 900 μL Qiazol Reagent reagenst adtak. A tisztított RNS-t templátként használták a cDNS szintéziséhez oligo dT, véletlenszerű hexamerek és SuperScript reverz transzkriptáz III alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint.
(Cassale et al. 2019)

Ultrahangos lízis kromatin-immunprecipitációs vizsgálathoz

A kromatin-immunprecipitációt a Menet által leírt módszer szerint, kisebb módosításokkal végezték. A 0–1 napos vad típusú nőstényekből származó, körülbelül 20 mg petefészket 1 mL NEB pufferben (10 mM HEPES-Na pH 8,0 mellett, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH 8 mellett, 0,5 mM EDTA-Na pH 8 mellett, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-mentes Complete Protease Inhibitors) homogenizálták homogenizátorral / merülő diszpergálóval 1 min időtartamig (3000 rpm mellett). A homogenátumot előhűtött üveg Dounce-homogenizátorba helyezték, és szorosan illeszkedő mozsártörővel 15 teljes löketet végeztek. A szabad sejtmagokat ezután 6000xg mellett 10 min időtartamig, 4°C-on centrifugálták. A sejtmagokat tartalmazó pelleteket 1 mL NEB-ben reszuszpendálták, és 20 000 × g mellett 20 min időtartamig szacharózgradiensen centrifugálták (0,65 mL 1,6 M szacharóz NEB-ben, 0,35 mL 0,8 M szacharóz NEB-ben). A pelletet 1 mL NEB-ben reszuszpendálták, és formaldehidet adtak hozzá 1%-os végkoncentrációig. A sejtmagokat 10 min időtartamig szobahőmérsékleten keresztkötötték, majd a reakciót 1/10 térfogatnyi 1,375 M glicin hozzáadásával leállították. A sejtmagokat 6000 × g mellett 5 min időtartamú centrifugálással gyűjtötték össze. A sejtmagokat kétszer mosták 1 mL NEB-ben, majd 1 mL lízispufferben reszuszpendálták (15 mM HEPES-Na pH 7,6 mellett, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH 8 mellett, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-dezoxikolát, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilszarkozin és 1× EDTA-mentes Complete Protease Inhibitors). A sejtmagokat Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) ultrahangos processzorral hat alkalommal kezelték, alkalmanként 20 s bekapcsolt ultrahanggal és 1 min jégen tartással. Az ultrahanggal kezelt sejtmagokat 13 000 × g mellett 4 min időtartamig, 4°C-on centrifugálták. Az ultrahanggal kezelt kromatin többsége 500–1000 bázispár (bp) hosszúságú volt. Minden immunprecipitációhoz 15 μg kromatint inkubáltak 10 μg HP1 9A9 monoklonális antitest jelenlétében (3 h, 4°C, forgatókeréken). Ezután 50 μl dynabeads protein G gyöngyöt adtak hozzá, és az inkubálást egy éjszakán át folytatták 4°C-on. A felülúszókat eldobták, a mintákat pedig kétszer mosták lízispufferben (minden mosás 15 min, 4 °C), majd kétszer TE pufferben (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8 mellett). A kromatint két lépésben eluálták a gyöngyökről; először 100 μl 1. elúciós pufferben (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8 mellett), 65°C-on, 15 min időtartamig, majd centrifugálták és visszanyerték a felülúszót. A gyöngyök anyagát 100 μl TE + 0,67% SDS oldatban újra extrahálták. Az egyesített eluátumot (200 μl) egy éjszakán át 65°C-on inkubálták a keresztkötések felbontásához, majd 50 μg/ml RNaseA-val 15 min időtartamig 65°C-on, valamint 500 μg/ml proteináz K-val 3 h időtartamig 65°C-on kezelték. A mintákat fenol–kloroformmal extrahálták és etanollal kicsapták. A DNS-t 25 μl vízben reszuszpendálták. Az immunprecipitált DNS-sel végzett molekuláris analízisek maximalizálásához a jelölt géneket páronként amplifikálták egy optimalizált duplex-PCR-protokollal, egyetlen reakcióban két különböző, hasonló olvadási hőmérsékletű primerkészletet használva.
(Casale et al. 2019)
 

Nagy teljesítményű ultrahangos sejtfeltárók biológiai mintákhoz

A Hielscher Ultrasonics nagy tapasztalattal rendelkező partnere a sejtfeltáráshoz, lízishez, fehérjeextrakcióhoz, DNS-, RNS- és kromatinfragmentáláshoz, valamint más, analízis előtti minta-előkészítési lépésekhez használt nagy teljesítményű ultrahangos készülékek területén. Az ultrahangos laboratóriumi homogenizátorok és minta-előkészítő egységek átfogó választékával a Hielscher ideális ultrahangos készüléket kínál az Ön biológiai alkalmazásához és követelményeihez.
A mikroheggyel ellátott klasszikus szondás ultrahangos készülékek, például az UP200St (200W; lásd a bal oldali képet), vagy az ultrahangos minta-előkészítő egységek valamelyike, a VialTweeter vagy az UP200ST_TD_CupHorn VialHolder tartóval, népszerű modellek a kutató- és analitikai laboratóriumokban. A klasszikus ultrahangos szonda ideális, ha kisebb számú mintán kell lízist, extrakciót vagy fragmentálást végezni. A VialTweeter és az UP200St_TD_CupHorn minta-előkészítő egységek legfeljebb 10, illetve 5 fiola egyidejű ultrahangos kezelését teszik lehetővé.
Ha nagy számú mintát (pl. 96 lyukú lemezeket, mikrotiterlemezeket stb.) kell feldolgozni, az UIP400MTP az ideális ultrahangos kezelőrendszer. Az UIP400MTP egy nagyobb, vízzel töltött cuphorn egységként működik, amelyben elegendő hely van a mikrokútlemezek elhelyezésére. A 400 watt teljesítményű ultrahangos processzorral működtetett UIP400MTP rendkívül egyenletes és intenzív ultrahangos kezelést biztosít a többlyukú lemezekhez, sejtfeltárás, mintalízis, pellet-szolubilizálás, fehérjeextrakció vagy DNS-nyírás céljából.

Pontos szabályozás intelligens szoftverrel

A Hielscher minden, 200 watt vagy nagyobb teljesítményű ultrahangos kezelési megoldása digitális színes érintőképernyővel és intelligens szoftverrel rendelkezik. Az intelligens adatnaplózás révén az ultrahangos készülék elindításától kezdve minden ultrahangos folyamatparaméter automatikusan CSV-fájlként mentődik a beépített SD-kártyára. Ez sokkal kényelmesebbé teszi a kutatást és a dokumentálást. Az ultrahangos kezelési kísérletek vagy a minta-előkészítés után egyszerűen áttekintheti és összehasonlíthatja az egyes kezelések paramétereit.
Az intuitív menüben számos paraméter előre beállítható az ultrahangos kezelés előtt: például a minta hőmérsékletének szabályozásához és termikus degradációjának megelőzéséhez beállítható a minta hőmérsékletének felső határértéke. Az ultrahangos egységhez mellékelt, csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelő visszajelzést ad az ultrahangos processzornak a kezelés tényleges hőmérsékletéről. A felső hőmérsékleti határérték elérésekor az ultrahangos készülék szünetel, amíg a hőmérséklet el nem éri a beállított ∆T alsó határértékét, majd automatikusan újraindítja az ultrahangos kezelést.
Ha meghatározott energiabevitellel végzett ultrahangos kezelésre van szükség, előre beállíthatja a kezelés végső ultrahangos energiáját. Természetesen az ultrahangos pulzálás és a ciklusüzemmód is egyedileg beállítható.
A legsikeresebb ultrahangos kezelési paraméterek újbóli használatához különféle kezelési üzemmódokat (pl. kezelési idő, intenzitás, ciklusüzemmód stb.) menthet előre beállított üzemmódként, így azok könnyen és gyorsan újraindíthatók.
A még kényelmesebb működtetés érdekében minden digitális ultrahangos egység távolról vezérelhető bármely elterjedt böngészőből (pl. InternetExplorer, Safari, Chrome stb.). A LAN-kapcsolat egyszerű, plug-n-play beállítással létrehozható, és nem igényel további szoftvertelepítést.
Mi, a Hielscher munkatársai tudjuk, hogy a biológiai minták sikeres ultrahangos kezelése pontosságot és megismételhetőséget igényel. Ezért ultrahangos készülékeinket olyan intelligens eszközökként terveztük meg, amelyek minden szükséges funkcióval rendelkeznek a hatékony, megbízható, reprodukálható és kényelmes minta-előkészítéshez.

Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról az ultrahangos mikrohegyektől és a klasszikus ultrahangos homogenizátoroktól a számos minta kényelmes, megbízható előkészítésére szolgáló MultiSample ultrahangos készülékekig: