Ultrahangos mintaelőkészítés ELISA vizsgálatokhoz
Az ELISA-hoz hasonló vizsgálatokat széles körben használják in vitro diagnosztikában, betegséggel kapcsolatos fehérjekimutatásban és minőség-ellenőrzésben (pl. élelmiszerallergének monitorozása). Az ultrahangos mintaelőkészítés gyors, megbízható és reprodukálható technika a sejtek lizálására és az intracelluláris fehérjék, DNS, RNS és organellák izolálására. A Hielscher Ultrasonics különböző ultrahangos megoldásokat kínál az egyes minták, több injekciós üveg, valamint mikrotiter lemezek és 96-lyukú lemezek kényelmes előkészítéséhez.
ELISA – Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat
Az ELISA az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat rövidítése, és a ligandumkötő vizsgálatok kategóriájának széles körben használt biokémiai elemzési technikája. ELISA-ban folyékony mintát adnak egy speciális kötési tulajdonságokkal rendelkező álló szilárd fázishoz. Általában az álló szilárd fázist bevonatként alkalmazzák egy kútlemezre vagy ELISA lemezre. Ezután különböző folyékony reagenseket adunk hozzá egymás után, inkubáljuk és mossuk, hogy végül optikai változás (pl. színfejlődés enzimatikus reakció terméke által) történjen a vájatban lévő végső folyadékban. Az optikai változás lehetővé teszi az analit mennyiségének mérését egy úgynevezett kvantitatív “olvasás". A kvantitatív leolvasáshoz spektrofotométert, fluorométert vagy luminométert használnak az áteresztett fény intenzitásának kimutatására és mérésére. A detektálás érzékenységét befolyásolja a jel erősítése az analitikai reakciók során. Mivel az enzimreakciók jól tanulmányozottak és megbízhatóak az erősítési folyamatok, enzimeket használnak a jel létrehozásához. Az enzimek rögzített arányban kapcsolódnak a detektáló reagensekhez, hogy lehetővé tegyék a pontos mennyiségi meghatározást, ami megmagyarázza az "enzimhez kötött" immunszorbens vizsgálat elnevezését is.
Mivel az ELISA-vizsgálatokat mikrotiter lemezeken / 96 lyukú lemezeken végzik, lemezalapú vizsgálati technikának nevezik, és pl. klinikai in vitro diagnosztikában, kutatásban, gyógyszerfejlesztésben stb. használják antitestek, peptidek, fehérjék és hormonok kimutatására és mennyiségi meghatározására.
Az ELISA technikát gyakran használják diagnosztikai eszközként az orvostudományban, a biotechnológiában, a növénypatológiában, és számos iparágban fontos minőségellenőrzési mérés.
Az ultrahangos minta előkészítő egység VialTweeter sejtlízisre és fehérjeextrakcióra használják ELISA-vizsgálatok előtt
Ultrahangos mintaelőkészítés ELISA előtt
Az ELISA-vizsgálat elvégzése előtt a minták előkészítési lépéseket igényelnek, mint például a sejtlízis és az intracelluláris fehérjék, DNS, RNS stb. Extrakciója. Az ultrahangos sejtlízis és a fehérje izolálás előnye a nagy hatékonyság, megbízhatóság és reprodukálhatóság. Mindezek a tényezők fontosak a magas színvonalú diagnosztika és kutatási eredmények megszerzéséhez
- Homogén mintakezelés
- Teljes lízis
- Teljes fehérjeextrakció (pl. antitestek, DNS)
- Optimális alkalmazkodás a sejttípushoz
- Bármilyen mintamérethez
- ismételhető
- hőmérséklet-szabályozott
- Automatikus adatprotokoll az SD-kártyán
Protokoll a pre-ELISA ultrahangos sejtlízishez
- Sejtkultúrák esetében: Az ultrahangos sejtlízis előtt centrifugálja a cellákat 5 percig 270 x g sebességgel mikrocentrifugában. A felülúszót aspirációval távolítsuk el, és szuszpendáljuk újra a sejteket 30–100 μl RIPA pufferben. Ezután inkubáljuk a sejtpelletet jégen 30 percig.
- Most a sejtminta készen áll az ultrahangos lízisre:
Használjon szonda típusú ultrahangos készüléket (pl. UP200Ht S26d2 szondával) vagy ultrahangos többmintás eszköz (pl. VialTweeter legfeljebb 10 injekciós üveg egyidejű ultrahangos kezeléséhez vagy a mikrotiter lemezek / 96 lyukú lemezek UIP400MPT) az előkészítendő minták mennyiségétől függően.
Egyetlen minta szonda típusú szondájához helyezze a sejteket 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövekbe. - Előre állítsa be az ultrahangos időtartamot, a teljes energiabevitelt, a ciklus üzemmódot és / vagy a hőmérsékleti határokat az ultrahangos készülék digitális menüjében. Ez biztosítja a rendkívül megbízható szonikálást és ismételhetőséget.
- Helyezze be a sonotrode-ot és kapcsolja be az ultrahangos készüléket. Óvatosan mozgassa az ultrahangos szonda mikrocsúcsát a mintán keresztül, hogy a mintát egyenletesen ultrahangosítsa.
A legtöbb sejt esetében az ultrahangos lízis 2 -4 ciklus után 10 másodperces szonikálás fejeződik be. - Szonikálás után távolítsa el a sonotrodot a mintából. A mintákat jégen 5 percig kell inkubálni. Ezután centrifugáljuk 10 000 × g-on 20 percig, hogy a törmeléket pelletáljuk. Vigyük át a felülúszókat egy új mikrocentrifugacsőbe. Címkézzük fel az analiteket, és tároljuk -20°C-on.
- Az ultrahangos sonotrode tisztítható úgy, hogy megfelelően törli alkohollal vagy szonikáttal egy alkohollal töltött főzőpohárban, pl. 70% etanol. Minden titánból készült ultrahangos szonda autoklávozható.
Fehérje extrakció E.coli sejtekből a ultrahangos szonda UP200St
- Öblítse le a szövetet jéghideg PBS-sel (0,01M, pH = 7,4), hogy alaposan eltávolítsa a felesleges hemolízis vért.
- Mérjük le a szövetet (vese, szív, tüdő, lép stb.), és maceráljuk apró darabokra, amelyeket PBS-ben homogenizálunk. A szükséges PBS térfogata összefügg a szövet súlyával. Ökölszabályként 1 g szövethez kb. 9 ml PBS szükséges. Javasoljuk, hogy adjon hozzá néhány proteázgátlót a PBS-hez. (RIPA vagy hipotóniás lízispuffer, amely proteázt és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmaz, alternatívaként használható.)
- A szövet méretétől függően egy rövid örvénykezelés (kb. 1-2 perc 15 másodperces impulzusokban) hasznos lehet a szövet előkezelésében.
- Szereljen fel egy mikro-hegyet, pl. S26d2, az ultrahangos készülékre. Helyezzük a mintavevő csövet a szövettel együtt jégfürdőbe.
- Sonicate a minta az ultrahangos készülék, pl. UP200St (80% amplitúdó) 1 percig. impulzus üzemmódban (15 másodperc be, 15 másodperces szünet). Tartsuk a mintát jégfürdőben.
- A homogenizátumokat ezután centrifugálják, hogy specifikus (citoszolikus, nukleáris, mitokondriális vagy lizoszómális) készleteket kapjanak az elemzéshez szükséges fehérje gazdagítása érdekében. A mintát 5 percig 5000 ×g-n centrifugálva a felülúszót kinyerjük.
Az MTP-24-8-96 szonotród nyolc ultrahangos szondával rendelkezik a mikrotiter lemezek kútjainak szonikálására.
Megbízható hőmérséklet-szabályozás szonikálás közben
A hőmérséklet kulcsfontosságú folyamatbefolyásoló tényező, amely különösen fontos a biológiai minták kezelésekor, például a fehérjék termikus lebomlásának megelőzése érdekében. Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az szonikálás hőt hoz létre. Azonban a minták hőmérséklete jól szabályozható a Hielscher ultrahangos készülékek használatakor. Különböző lehetőségeket mutatunk be a minták hőmérsékletének figyelemmel kísérésére és szabályozására, miközben előkészítjük őket a szonda típusú ultrahangos készülékkel vagy a VialTweeterrel.
- A minta hőmérsékletének ellenőrzése: Minden Hielscher digitális ultrahangos processzor intelligens szoftverrel és dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel van felszerelve. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az ultrahangos készülékhez (pl. UP200Ht, UP200St, VialMagassugárzó, UIP400MTP) és helyezze be a hőmérséklet-érzékelő hegyét az egyik mintacsőbe. Digitális színes érintőképernyőn keresztül beállíthatja az ultrahangos processzor menüjében egy meghatározott hőmérsékleti tartományt a minta szonikálásához. Az ultrahangos készülék automatikusan leáll, amikor eléri a maximális hőmérsékletet, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete a beállított hőmérséklet alacsonyabb értékére ∆. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megakadályozza a hő okozta degradációt.
- Ami az ultrahangos többmintás egységet illeti VialTweeter, a titánblokk, amely a mintacsöveket tartja, előhűthető. Helyezze a VialTweeter blokkot (csak a szonotródát jelátalakító nélkül!) a hűtőszekrénybe vagy a fagyasztóba, hogy előhűtse a titánblokkot, és segít elhalasztani a minta hőmérsékletének emelkedését. Ha lehetséges, maga a minta is előhűthető.
- Használjon jégfürdőt vagy szárazjeget, hogy lehűljön az ultrahangos kezelés során. Helyezze a mintacsövet (csöveket) szonikálás közben jégfürdőbe. A VialTweeter esetében használjon szárazjéggel töltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweetert a szárazjégre, hogy a hő gyorsan eloszlasson.
Az ügyfelek világszerte használják a Hielscher szonda-ultrahangosítókat, valamint a többmintás szonikációs egységeket VialTweeter és UIP400MTP napi mintaelőkészítési munkájukhoz biológiai, biokémiai, orvosi és klinikai laboratóriumokban. A Hielscher processzorok intelligens szoftvere és hőmérséklet-szabályozása, a hőmérséklet megbízhatóan szabályozható és elkerülhető a hő okozta mintalebomlás. Ultrahangos minta előkészítés Hielscher ultrahangos megoldásokkal rendkívül megbízható és reprodukálható eredményeket biztosít!
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt keverési alkalmazásokhoz, diszperzióhoz, emulgeáláshoz és extrakcióhoz laboratóriumi, kísérleti és ipari méretekben.
Irodalom / Hivatkozások
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Tények, amelyeket érdemes tudni
Az ELISA típusai
Többféle ELISA létezik, amelyeket működési elvük különböztet meg. Ezeket közvetlen ELISA, közvetett ELISA, szendvics ELISA, versenyképes ELISA és fordított ELISA néven ismerik. Az alábbiakban áttekintést nyújtunk a különböző ELISA típusokról, valamint azok főbb jellemzőiről és különbségeiről.
Az ELISA minőségi vagy mennyiségi formátumban futtatható. A kvalitatív eredmények egyszerű pozitív vagy negatív eredményt adnak, míg kvantitatív ELISA-ban a minta optikai sűrűségét (OD) egy standard görbével hasonlítják össze, amely jellemzően a célmolekula ismert koncentrációjú oldatának sorozatos hígítása.
Közvetlen ELISA
A közvetlen ELISA az Elisa legegyszerűbb vizsgálati formája, ahol csak enzimmel jelölt primer antitestet használnak, és nincs szükség másodlagos antitestekre. Az enzimmel jelölt primer antitest közvetlenül kötődik a célhoz, azaz az antigénhez. A pufferolt antigénoldatot egy mikrotiterlemez minden vájatába (általában 96 lyukú lemezek, ELISA-lemezek) adják, ahol töltéskölcsönhatások révén tapad a műanyag felülethez. Amikor az elsődleges antitesthez kapcsolódó enzim reakcióba lép a szubsztrátjával, látható jelet hoz létre, amely spektrofotométerrel, fluorométerrel vagy luminométerrel mérhető.
Közvetett ELISA
Az indirekt ELISA-próbához primer és másodlagos antitest is szükséges. A közvetlen ELISA-val ellentétben azonban nem az elsődleges antitest, hanem a másodlagos antitest enzimmel van jelölve. Az antigént immobilizálják a vájatlemezhez, és az elsődleges antitest köti meg. Ezt követően az enzimmel jelölt másodlagos antitest kötődik az elsődleges antitesthez. Végül a másodlagos antitesthez kapcsolódó enzim reagál a szubsztrátjával, hogy látható jelet hozzon létre, amely kimutatható.
Szendvics ELISA
Míg a közvetlen és közvetett ELISA-próbákban az antigént immobilizálják és bevonják a kútlemez felületére, addig a szendvics-ELISA-ban az ellenanyagot az ELISA-lemez műanyag felületéhez rögzítik. A szendvics ELISA-ban lévő immobilizált antitesteket capture antitesteknek nevezik. A befogási antitestek mellett a szendvics ELISA-ban úgynevezett detektáló antitestekre is szükség van. A detektálási antitestek közé tartozik egy jelöletlen elsődleges detektáló antitest és egy enzimmel jelölt másodlagos detektáló antitest.
Lépésről lépésre a kérdéses antigén kötődik a lemezhez immobilizált befogási antitesthez. Ezután az elsődleges detektáló antitest kötődik az antigénhez. Ezt követően a másodlagos detektáló antitest kötődik az elsődleges detektáló antitesthez. A reakció utolsó lépésében az enzim reakcióba lép a szubsztrátjával, hogy optikailag kimutatható látható jelet hozzon létre.
Versenyképes ELISA
A kompetitív ELISA, más néven gátló ELISA, a legösszetettebb ELISA típus, mivel gátló antigén alkalmazásával jár. A három formátum, a közvetlen, közvetett és a szendvics ELISA mindegyike adaptálható a versenyképes ELISA formátumhoz. A kompetitív ELISA-ban az inhibitor antigén és a kérdéses antigén verseng az elsődleges antitesthez való kötődésért.
A kompetitív ELISA esetében jelöletlen antitestet inkubálunk antigénje, azaz minta jelenlétében. Ezeket a kötött antitest/antigén komplexeket ezután antigénnel bevont vájatba adják.
A lemezt mossuk, hogy eltávolítsuk a nem kötött antitesteket. A versenyképes ELISA neve annak a ténynek köszönhető, hogy minél több antigén van a mintában, annál több antigén-antitest komplex képződik. Ez azt jelenti, hogy kevesebb kötetlen antitest áll rendelkezésre a vájatban lévő antigénhez való kötődéshez, és az antigéneknek versenyezniük kell a rendelkezésre álló antitestért. Az elsődleges antitestnek megfelelő másodlagos antitestet adunk hozzá. Ez a második antitest az enzimhez kapcsolódik. A szubsztrátum hozzáadásakor a fennmaradó enzimek kromogén vagy fluoreszcens jelet termelnek.
Ezen a ponton a reakció leáll, hogy elkerülje a jel esetleges telítettségét.
Néhány kompetitív ELISA-készlet enzimhez kötött antitest helyett enzimhez kötött antigént tartalmaz. A jelölt antigén verseng az elsődleges antitestkötő helyekért a minta antigénnel (jelöletlen). Minél kevesebb antigén van a mintában, annál több jelölt antigén marad a vájatban, és annál erősebb a jel.
Fordított ELISA
A fordított ELISA nem használ kútlemezeket, hanem az antigéneket szuszpendálva hagyja a vizsgálati folyadékban. A fordított ELISA teszt az antigénen keresztül kötött antitest mennyiségét méri. Kifejezetten a nyugat-nílusi vírus burokfehérje kimutatására és vizsgálatára fejlesztették ki, valamint arra, hogy hogyan képes vírusspecifikus antitesteket találni.
Az ELISA-hoz használt enzimatikus marker
Az alábbi lista tartalmazza az ELISA-vizsgálatokban használt leggyakoribb enzimatikus markereket, amelyek lehetővé teszik a vizsgálat eredményeinek mérését a befejezés után.
- Az OPD (o-feniléndiamin-dihidroklorid) borostyánszínűvé válik, hogy kimutassa a HRP-t (tormaperoxidáz), amelyet gyakran konjugált fehérjeként használnak.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametil-benzidin) kékre vált a HRP kimutatásakor, és sárgára változik kénsav vagy foszforsav hozzáadása után.
- ABTS (2,2′-Az azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]-diammóniumsó) zöldre vált a HRP kimutatásakor.
- A PNPP (p-nitrofenil-foszfát, dinátriumsó) sárgára változik az alkalikus foszfatáz kimutatásakor.