Ultrahangos minta-előkészítés ELISA-vizsgálatokhoz

Az olyan vizsgálatokat, mint az ELISA, széles körben alkalmazzák in vitro diagnosztikára, betegségekhez kapcsolódó fehérjék kimutatására és minőség-ellenőrzésre (pl. élelmiszer-allergének nyomon követésére). Az ultrahangos minta-előkészítés gyors, megbízható és reprodukálható technika a sejtek lizálására, valamint az intracelluláris fehérjék, a DNA, az RNA és a sejtorganellumok izolálására. A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahangos megoldásokat kínál egyedi minták, több mintafiola, valamint mikrotiterlemezek és 96 lyukú lemezek kényelmes előkészítéséhez.

ELISA – Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

Az ELISA az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat angol elnevezésének rövidítése, és a ligandumkötési vizsgálatok kategóriájába tartozó, széles körben alkalmazott biokémiai analitikai technika. Az ELISA során folyékony mintát juttatnak egy speciális kötési tulajdonságokkal rendelkező, helyhez kötött szilárd fázisra. A helyhez kötött szilárd fázist rendszerint egy többlyukú lemez vagy ELISA-lemez bevonataként alakítják ki. Ezután különféle folyékony reagenseket adnak hozzá egymás után, inkubálják, majd mossák, így végül a lyukban lévő végső folyadékban optikai változás következik be (pl. egy enzimreakció terméke által kiváltott színképződés). Az optikai változás lehetővé teszi az analit mennyiségének mérését egy úgynevezett kvantitatív „leolvasással”. A kvantitatív leolvasáshoz spektrofotométert, fluorométert vagy luminométert használnak az áteresztett fény intenzitásának detektálására és mérésére. A kimutatás érzékenységét az analitikai reakciók során történő jelerősítés befolyásolja. Mivel az enzimreakciók alaposan tanulmányozott és megbízható erősítési folyamatok, a jel létrehozásához enzimeket használnak. Az enzimeket meghatározott arányban kapcsolják a kimutató reagensekhez a pontos mennyiségi meghatározás érdekében, ami az „enzimhez kapcsolt” immunszorbens vizsgálat elnevezést is magyarázza.
Mivel az ELISA-vizsgálatokat mikrotiterlemezeken / 96 lyukú lemezeken végzik, lemezalapú vizsgálati technikaként ismertek, és például a klinikai in vitro diagnosztikában, a kutatásban, a gyógyszerfejlesztésben stb. alkalmazzák antitestek, peptidek, fehérjék és hormonok kimutatására és mennyiségi meghatározására.
Az ELISA-technikát gyakran használják diagnosztikai eszközként az orvostudományban, a biotechnológiában és a növénykórtanban, emellett számos iparágban fontos minőség-ellenőrzési mérési módszer.

Ultrahangos minta-előkészítés az ELISA előtt

Az ELISA-vizsgálat elvégzése előtt a minták olyan előkészítési lépéseket igényelnek, mint a sejtlízis és az intracelluláris fehérjék, a DNA, az RNA stb. kivonása. Az ultrahangos sejtlízis és fehérjeizolálás előnye a nagy hatékonyság, a megbízhatóság és a reprodukálhatóság. Mindezek a tényezők fontosak a kiváló minőségű diagnosztikai és kutatási eredmények eléréséhez

Az ELISA előtti ultrahangos sejtlízis protokollja

• Sejttenyészetek esetén: Az ultrahangos sejtlízis előtt centrifugálja a sejteket 5 mins időtartamig, 270 x g mellett, mikrocentrifugában. Szívja le a felülúszót, és szuszpendálja újra a sejteket 30 – 100 μL RIPA-pufferben. Ezután inkubálja a sejtüledéket jégen 30 min időtartamig.
• A sejtminta most készen áll az ultrahangos lízisre:
  Használjon szondás ultrahangos készüléket (pl. UP200Ht S26d2 szondával) vagy több minta kezelésére alkalmas ultrahangos készüléket (pl. VialTweeter készüléket akár 10 mintafiola egyidejű ultrahangos kezeléséhez, vagy UIP400MPT készüléket mikrotiterlemezekhez / 96 lyukú lemezekhez), az előkészítendő minták számától függően.
  Egyetlen minta szondás ultrahangos kezeléséhez helyezze a sejteket 1,5 mL-es mikrocentrifuga-csövekbe.
• Az ultrahangos készülék digitális menüjében előre állítsa be az ultrahangos kezelés időtartamát, a teljes energiabevitelt, a ciklusüzemmódot és/vagy a hőmérsékleti határértékeket. Ez rendkívül megbízható ultrahangos kezelést és ismételhetőséget biztosít.
• Helyezze be a szonotródát, és kapcsolja be az ultrahangos készüléket. Óvatosan mozgassa az ultrahangos szonda mikrohegyét a mintában, hogy a minta ultrahangos kezelése egyenletes legyen.
  A legtöbb sejt esetében az ultrahangos lízis 2–4, egyenként 10 sec időtartamú ultrahangos kezelési ciklus után befejeződik.
• Az ultrahangos kezelés után távolítsa el a szonotródát a mintából. A mintákat jégen kell inkubálni 5 min időtartamig. Ezután centrifugálja őket 10 000 x g mellett 20 min időtartamig, hogy a sejttörmelék leülepedjen. Vigye át a felülúszókat egy új mikrocentrifuga-csőbe. Címkézze fel az analitokat, és tárolja őket -20°C-on.
• Az ultrahangos szonotróda alapos alkoholos áttörléssel tisztítható, vagy alkohollal, például 70%-os etanollal töltött főzőpohárban végzett ultrahangos kezeléssel. Minden titánból készült ultrahangos szonda autoklávozható.

• Öblítse át a szövetet jéghideg PBS-sel (0,01M, pH=7,4), hogy alaposan eltávolítsa a felesleges hemolizált vért.
• Mérje meg a szövet (vese, szív, tüdő, lép stb.) tömegét, és aprítsa fel kis darabokra, amelyeket PBS-ben homogenizál. A szükséges PBS térfogata a szövet tömegétől függ. Ökölszabályként 1g szövethez körülbelül 9mL PBS szükséges. Ajánlott némi proteázgátlót adni a PBS-hez. (Alternatívaként proteáz- és foszfatázgátló koktélt tartalmazó RIPA-puffer vagy hipotóniás lízispuffer is használható.)
• A szövet méretétől függően rövid vortexkezelés (kb. 1–2 min, 15 sec időtartamú impulzusokban) segítheti a szövet előkezelését.
• Szereljen mikrohegyet, például S26d2-t, az ultrahangos készülékére. Helyezze a szövetet tartalmazó mintacsövet jégfürdőbe.
• Kezelje a mintát az ultrahangos készülékével, például UP200St készülékkel (80%-os amplitúdóval), 1 min időtartamig, impulzusüzemmódban (15sec bekapcsolva, 15sec szünet). Tartsa a mintát a jégfürdőben.
• A homogenátumokat ezután centrifugálják, hogy meghatározott frakciókat (citoszolikus, sejtmagi, mitokondriális vagy lizoszomális frakciókat) nyerjenek, és így feldúsítsák a fehérjét az analízishez. A mintát 5 percig, 5000×g mellett centrifugálva nyerik ki a felülúszót.

Megbízható hőmérséklet-szabályozás az ultrahangos kezelés során

A hőmérséklet a folyamatot meghatározóan befolyásoló tényező, amely különösen fontos a biológiai minták kezelésénél, például a fehérjék hő okozta lebomlásának megelőzéséhez. Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az ultrahangos kezelés is hőt termel. A minták hőmérséklete azonban jól szabályozható a Hielscher Ultrasonics készülékeinek használatával. Különféle lehetőségeket mutatunk be a minták hőmérsékletének nyomon követésére és szabályozására, miközben szondás ultrahangos készülékkel vagy a VialTweeter készülékkel előkészíti őket az analízishez.

1. A minta hőmérsékletének nyomon követése: Minden Hielscher digitális ultrahangos processzor intelligens szoftverrel és csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel rendelkezik. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az ultrahangos készülékhez (pl. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP ultrahangos készülék többlyukú lemezekhez), és helyezze a hőmérséklet-érzékelő hegyét az egyik mintacsőbe. A digitális, színes érintőkijelzőn az ultrahangos processzor menüjében beállíthat egy meghatározott hőmérséklet-tartományt a minta ultrahangos kezeléséhez. Az ultrahangos készülék automatikusan leáll a maximális hőmérséklet elérésekor, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete a beállított hőmérséklet ∆ alsó értékére nem csökken. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megakadályozza a hő okozta lebomlást.
2. A több minta ultrahangos kezelésére alkalmas VialTweeter egység mintacsöveket tartó titántömbje előhűthető. Helyezze a VialTweeter tömbjét (csak a szonotródát, az átalakító nélkül!) hűtőszekrénybe vagy fagyasztóba; a titántömb előhűtése segít késleltetni a minta hőmérsékletének emelkedését. Ha lehetséges, maga a minta is előhűthető.
3. Az ultrahangos kezelés közbeni hűtéshez használjon jégfürdőt vagy szárazjeget. Az ultrahangos kezelés idejére helyezze a mintacsövet vagy mintacsöveket jégfürdőbe. A VialTweeter esetében használjon szárazjéggel töltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweeter készüléket a szárazjégre, hogy a hő gyorsan elvezetődhessen.

Világszerte használnak ügyfeleink Hielscher szondás ultrahangos készülékeket, valamint több minta ultrahangos kezelésére alkalmas VialTweeter és UIP400MTP egységeket a biológiai, biokémiai, orvosi és klinikai laboratóriumok napi minta-előkészítési munkájához. A Hielscher processzorok intelligens szoftvere és hőmérséklet-szabályozása megbízhatóan szabályozza a hőmérsékletet, és elkerülhetővé teszi a minták hő okozta lebomlását. A Hielscher ultrahangos megoldásaival végzett ultrahangos minta-előkészítés rendkívül megbízható és reprodukálható eredményeket biztosít!
Tudjon meg többet a nagy mintaáteresztő képességű ultrahangos kezelésről a vizsgálatokhoz használt, többlyukú lemezek kezelésére alkalmas UIP400MTP ultrahangos készülékkel!