Ultrahangos DNS-fragmentálás

A DNS és az RNS nyíróerőkkel végzett fragmentálása során a hosszú DNS-molekulákat kisebb darabokra bontják, ami kulcsfontosságú lépés a minták előkészítésében az újgenerációs szekvenáláshoz (NGS) szükséges könyvtárak létrehozásához. Az ultrahangos DNS-fragmentálás az akusztikus kavitáció erőit használja fel a DNS vagy az RNS 100 bp és 5 kb közötti méretű fragmentumokra bontására. Ez a módszer lehetővé teszi a fragmentumméret pontos szabályozását, így az optimális szekvenálási eredmények érdekében a kívánt DNS-hosszhoz igazítható.

DNS-fragmentálás ultrahangos kezeléssel

A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahangon alapuló megoldásokat kínál a DNS, az RNS és a kromatin fragmentálására. Válasszon szondás ultrahangos kezelőkészüléket (pl. UP100H) a mikroheggyel végzett közvetlen ultrahangos kezeléshez, vagy használja a VialTweeeter készüléket vagy az ultrahangos Cuphorn készüléket különböző minták egyidejű, közvetett DNS-előkészítéséhez. A Hielscher az Ön igényeit figyelembe véve kínálja az ideális készüléket: akár 1, akár legfeljebb 10 mintával dolgozik, mikroliterestől literes térfogatokig – a Hielscher ultrahangos kezelőkészülékei megfelelnek az Ön követelményeinek a megfelelő hosszúságú DNS-, RNS- és kromatinfragmentumok előállításához. A reprodukálhatóság, az egyszerű kezelés és a pontos szabályozás megbízható könyvtár létrehozását teszi lehetővé az újgenerációs szekvenáláshoz.
Az enzimatikus DNS-fragmentálással szemben az ultrahangos fragmentálás kizárólag mechanikai nyíróerőket alkalmaz, vegyszerek hozzáadása nélkül. A folyamatparaméterek pontos beállításával az ultrahangos fragmentálás nagy molekulatömegű DNS-fragmentumokat állít elő (plazmid- és genomi DNS).
A tisztított nukleinsavak a fragmentálási lépés előtt vagy után is amplifikálhatók.
Az ultrahangos kezelés paraméterei (teljesítmény, impulzusciklus / impulzussorozatok, idő és hőmérséklet) szoftveres beállításokkal biztonságosan szabályozhatók.

Protokollok ultrahangos DNS-fragmentáláshoz

Kromatin-immunprecipitációs vizsgálathoz

Röviden: a sejteket 60mm átmérőjű tenyésztőedényekbe helyezték (edényenként 400 000 sejt), és RhoA siRNS-sel transzfektálták (a leírtak szerint); 72 h elteltével formaldehiddel (végső koncentráció: 1%) inkubálták őket 10 min ideig, 37°C-on, hogy a fehérjéket a DNS-hez keresztkössék. A keresztkötési reakciót a térfogat egytizedének megfelelő mennyiségű 1,25 mol/L glicin hozzáadásával állították le, így 125 mmol/L végső koncentrációt értek el. A sejteket kétszer mosták jéghideg PBS-sel, majd 1 mmol/L fenilmetilszulfonil-fluoridot, 1 Ag/mL aprotinint és 1 Ag/mL pepsztatin A-t tartalmazó radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferben [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoxikolát, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] reszuszpendálták, és 30 min ideig jégen tartották. Ezután a sejtlizátumokat jégen kezelték ultrahanggal a Hielscher UP200S ultrahangos kezelőkészülékkel (3 x 40 s, amplitúdó: 40%, ciklus: 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), amíg a keresztkötött kromatin fragmentálásával 200 és 1 000 bp közötti DNS-fragmentumokat nem kaptak. A teljes lizátum egytizedét a különböző mintákban jelen lévő DNS mennyiségének meghatározására használták, és ezt tekintették a „teljes kiindulási DNS”-nek. A felülúszókat lazacsperma-DNS/fehérje-agaróz 50%-os szuszpenziójával inkubálták a nem specifikus háttér csökkentésére. Az immunprecipitációt ezután egy éjszakán át, 4°C-on végezték 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) jelenlétében vagy antitest nélkül (negatív kontroll). Ezekhez a felülúszókhoz 5 mol/L NaCl-t adtak, és egy éjszakán át 65°C-on melegítették őket a fehérje–DNS keresztkötések felbontására. Az immunkomplexeket ezt követően DNáz- és RNáz-mentes proteináz K-val kezelték, a DNS-t pedig fenol/kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással tisztították. A PCR-t a humán iNOS gén promoterrégióján belüli szekvenciának megfelelő specifikus primerekkel végezték (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expressziós vizsgálatok

Az expressziós vizsgálatokhoz az EGFP (fokozott fluoreszcenciájú zöld fluoreszcens fehérje) génjét a kromoszomális ssu helyre integrálva tartalmazó rekombináns L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 törzset (Jena Bioscience, Németország) a korábban leírtak szerint különböző tápközegekben tenyésztették, és a tápközegeket ezenfelül 100 mg l^-1 Nourseothricinnel (Jena Bioscience, Németország) egészítették ki. A tenyésztés során 1 ml mintákat vettek, centrifugálták őket (2000 × g, 20°C, 10 min), majd 0,9%-os NaCl-oldattal mosták. Az üledéket pufferben (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) reszuszpendálták, és ultrahangos kezeléssel feltárták az UP400S ultrahangos processzorral (bevitt energia: ∼ 400 Ws). A sejttörmeléket centrifugálással eltávolították (6000 × g, 4°C, 5 min), és nátrium-dodecil-szulfát–poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemezték redukáló körülmények között, Laemmli (1970) módszere szerint, 12,5%-os poliakrilamidgéleken. Az EGFP-expressziót rázatott tenyészetben vizsgálták. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin-immunprecipitáció

A kromatin-immunprecipitációs vizsgálatot a ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) készlettel végezték a gyártó utasításai szerint, néhány módosítással. Röviden: a differenciált humán podocitákat 1%-os formaldehiddel keresztkötötték 10 min ideig szobahőmérsékleten. A sejteket jéghideg PBS-sel mosták, és a fixálási reakciót 0,125 M glicin hozzáadásával, 5 min ideig szobahőmérsékleten állították le. A sejteket ismét jéghideg PBS-sel mosták, majd lekaparták a tenyésztőedényről. A sejteket centrifugálással ülepítették, és lízispufferben reszuszpendálták. Centrifugálás után az ülepített sejtmagokat fragmentálási pufferben reszuszpendálták, 30 min ideig jégen inkubálták, és a kromatint ultrahangos kezeléssel fragmentálták, például az UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Németország) készülékkel, 25%-os teljesítményen, jégen, 5 darab, egyenként 20 sec időtartamú impulzussal, körülbelül 200–600 bp méretű fragmentumokra. A fragmentált kromatint ezután centrifugálták, és a felülúszót összegyűjtötték. Az immunprecipitációkhoz 60 μl kromatint inkubáltak 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) vagy NF-κB p50 (Abcam) antitesttel, illetve negatív kontrollként nyúl-IgG-vel (Zymed Laboratories), egy éjszakán át, 4°C-on, kíméletes forgatás mellett. A mágneses gyöngyökhöz kötött immunkomplexeket mágneses állvánnyal gyűjtötték össze, alaposan mosták, majd felbontották a fehérje/DNS keresztkötéseket, és eluálták a DNS-t a valós idejű PCR-elemzéshez. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNS előkészítése chip-array elemzéshez

Sejtlizátumok és kivont DNS-ek előkészítése
A kívánt végső koncentrációra PBS-ben szuszpendált baktériumüledékeket az UP100H ultrahangos sejtfeltáró készülékkel (Hielscher GmbH, Németország) kezelték, amely MS1 mikroheggyel volt felszerelve (átmérő: 1mm). Az üzemi frekvencia 30 kHz, az effektív kimeneti teljesítmény pedig 100 W volt. A kezelés során a mintákat jeges vízfürdőben hűtötték, keverték és centrifugálták. A mintákat áramlási citometriás vizsgálatokhoz használták, míg a későbbi feldolgozáshoz hőkezelésnek vetették alá őket (95°C, 5 min). A nyers sejtlizátumokat fenol:kloroform:izoamil-alkohol keverékkel (25:24:1) dolgozták fel. Ebből a keverékből a lizátummintával azonos térfogatot adtak a mintához, az oldatot 15 s ideig erőteljesen vortexelték, majd 15 000 x g mellett 2 min ideig centrifugálták szobahőmérsékleten (RT), körülbelül 22°C-on. A genomi DNS-t tartalmazó felső vizes fázist óvatosan elválasztották, és új, steril Eppendorf-csőbe gyűjtötték.
Ezt követően a mintákat ultrahanggal kezelték a DNS fragmentálására. Az ultrahangos kezelési lépést a fent leírtakkal azonos körülmények között végezték. A fragmentálás genomi DNS-re gyakorolt hatásának értékeléséhez a mintákat agaróz-gélelektroforézissel elemezték.
(…) A korábban 2,5 min ideig ultrahanggal kezelt mintákat a hőkezelés és a centrifugálás után extrakciós lépésnek vetették alá. A felszabadult DNS-t kétszer extrahálták fenol:kloroform:izoamil-alkohol keverékkel, majd második ultrahangos kezelésnek vetették alá 0 – 15 min ideig. Agaróz-gélelektroforézissel határozták meg az extrakció utáni ultrahangos fragmentálásnak alávetett DNS méreteloszlását (ábra a jobb felső részen). A nagymértékben fragmentált DNS-re a nagy molekulatömegű sávok helyett megjelenő elkenődött DNS-jel utalt; ezek a sávok a 2,5 min ideig vagy hosszabban ultrahanggal kezelt mintákból eltűntek. A hosszabb ultrahangos kezelés fokozatosan körülbelül 150 – 600 bp méretre csökkentette a fragmentumok hosszát, és a 15 min ideig tartó ultrahangos kezelés tovább bontotta ezeket a fragmentumokat, amint az főként az elkenődött jel felső részén látható. Így az átlagos DNS-fragmentumméret az ultrahangos kezelés időtartamával fokozatosan csökkent, az 5 min kezelés pedig lehetővé tette a chip-array vizsgálatokhoz legalkalmasabb DNS-fragmentumméretek elérését. Végül kialakították a DNS-analit előkészítési eljárását, amely először 2 min ultrahangos kezelésből, DNS-extrakcióból (2×), majd ezt követően 5 min ultrahangos kezelésből állt. (Basselet et al. 2008)

Kromatin-immunprecipitáció (ChIP)

A HEK293 sejteket a fent leírtak szerint tenyésztették, és 2 mM diszukcinimidil-glutaráttal fixálták 45 min ideig szobahőmérsékleten. Ezt követően a sejteket kétszer mosták PBS-sel. A kromatint 1% (v/v) formaldehiddel keresztkötötték 10 min ideig szobahőmérsékleten, majd kétszer mosták jéghideg PBS-sel. A keresztkötési reakciót 0,125 M végső koncentrációjú glicinnel végzett, 5 min ideig tartó szobahőmérsékletű inkubációval állították le. Tripszinnel történő inkubáció után a sejteket lekaparták a sejttenyésztő edényről, és kétszer mosták PBS-sel. A sejtüledéket lízispufferben (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl és 0,5% (v/v) Nonidet P-40) reszuszpendálták, 10 min ideig jégen inkubálták, majd Dounce-homogenizátorral homogenizálták. Ezt követően a sejtmagokat centrifugálással ülepítették (3500 x g, 5 min, 4 °C), és sejtmagpufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA és 1% (w/v) SDS) reszuszpendálták. A sejtmagokat ultrahangos kezeléssel tárták fel három 20-s impulzussal, az UP50H ultrahangos kezelőkészülékkel (Hielscher Ultraschall Technologie), 0,5 ciklusbeállítással és 30%-os amplitúdóval, így túlnyomórészt 200 – 1000 bp méretű genomi DNS-fragmentumokat kaptak. A ChIP-hez 50g DNS-t 4-szeresére hígítottak immunprecipitációs pufferben (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 és 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Hisztonmódosítások elemzése kromatin-immunprecipitációval (ChIP)

Röviden: 6 x 10⁶ sejtet kétszer mostak PBS-sel, majd a tenyésztőlemezen 15 min ideig szobahőmérsékleten keresztkötöttek 0,5% formaldehid jelenlétében. A keresztkötési reakciót 0,125 M glicin hozzáadásával állították le. Minden további lépést 48°C-on végeztek. Valamennyi puffert előhűtötték, és mindegyik proteázgátlókat (Complete Mini, Roche) tartalmazott. A sejteket kétszer mosták PBS-sel, majd lekaparták. Az összegyűjtött üledékeket 1 ml lízispufferben (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) oldották fel, és hideg etanolfürdőben 10 cikluson keresztül, 100%-os amplitúdóval kezelték ultrahanggal az UP50H ultrahangos kezelőkészülékkel (Hielscher, Teltow, Németország). A kromatin fragmentálását 1%-os agarózgélben tették láthatóvá. A kapott fragmentumok a 200–500pb tartományba estek. Az oldható kromatint az ultrahanggal kezelt minták 14 000g mellett, 10 min ideig, 48°C-on végzett centrifugálásával nyerték ki. Az oldható frakciót 1/10 arányban hígították hígítópufferben (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), majd aliquotokra osztották, és felhasználásig 80°C-on tárolták. (Rodriguez et al. 2008)