Hielscher ultrahang technológia

Ultrahangos DNS nyírása

  • Során DNS-t és RNS-t nyíró, DNS-molekulák kisebb darabokra törni. DNS / RNS fragmentáció fontos minta-prep szükséges lépések létrehozásához könyvtárakat a következő generációs szekvenálás (NGS).
  • Ultrahangos DNS nyíró használja az erők akusztikus kavitáció megtörni a DNS-t vagy RNS-t darabokra 100 – 5KB bp.
  • Ultrahangos nyírási lehetővé teszi a pontos DNS-fragmentáció, és adaptáció a kívánt DNS hossza.

 

Ultrahangos DNS nyírása

Hielscher Ultrasonics kínál különböző ultrahang-alapú megoldások DNS, RNS és a kromatin nyírás. Válasszon egy próba-típusú ultrasonicators (például UP100H) közvetlen szonikáció mikrokatéter segítségével, vagy használja a VialTweeeter vagy ultrahangos cuphorn közvetett DNS elkészítéséhez különböző minta egyidejű. Hielscher ideális eszköz tekintve az Ön igényeinek: Legyen akár 1 vagy akár 10 minta, volumen ul hogy liter térfogatú – Hielscher ultrahangos processzorok állnak, hogy megfeleljen a követelményeknek, hogy készítsen DNS, RNS és a kromatin fragmentumok a megfelelő hosszúságú. A reprodukálhatóság, könnyű kezelhetőség és pontos ellenőrzését teszi lehetővé a megbízható könyvtár következő generációs szekvenálás.
Ezzel szemben az enzimatikus DNS-fragmentáció, ultrahangos nyírási vonatkozik a tiszta mechanikai nyíróerőkkel szemben, anélkül, hogy bármilyen vegyi anyagok. A pontos beállítását a folyamat paramétereinek, ultrahangos nyírási termel nagy molekulatömegű DNS-fragmentumok (plazmid és a genom DNS-t).
Tisztított nukleinsavak is erősíthető előtt vagy után egy fragmentáció lépést.
Az ultrahangos kezelés paraméterei (teljesítmény, impulzus ciklus / robban, idő és hőmérséklet) lehet szabályozni biztonságosan keresztül szoftver beállításait.

Előnyök:

  • pontos ellenőrzés
  • szonikálási ciklusok és az idő pontosan adaptálható a kívánt DNS méretét
  • nagy molekulatömegű DNS-fragmentumok
  • hőmérséklet-szabályozás
  • Gyors
  • reprodukálható eredményeket
  • autoklávozható
  • Különböző megoldások: Szonda-típusú, VialTweeter és Cuphorn

Protokollok Ultrahangos DNS nyírása

A kromatin immunprecipitációs vizsgálat

Röviden, a sejteket 60 mm átmérőjű edényekbe (400 000 per csészébe) bevontuk, és RhoA siRNS-sel transzfektáltuk (a leírás szerint); 72 óra elteltével formaldehiddel (végkoncentráció, 1%) 10 percig 37 ° C-on inkubáltuk a keresztkötéses fehérjék DNS-ével. A térhálósító reakciót egy tizedszernyi 1,25 mol / l glicin hozzáadásával leállítottuk, így 125 mmol / l végkoncentrációt adva. A sejteket jéghideg PBS-sel kétszer mostuk, radioimmunoprecipitációs vizsgálati pufferben (150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxikolát, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl )], amely 1 mmol / l fenil-metil-szulfonil-fluoridot, 1 Ag / ml aprotinint és 1 Ag / ml pepsztatin A-t tartalmaz, és jégen tartjuk 30 percig. Ezután a sejtlizátumokat jégen sonicáltuk a Hielscher UP200S ultrahang szonikátort (3 x 40 s, amplitúdó 40%, 1 ciklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), amíg térhálósított chromatins arra nyírt, így DNS-fragmenseket 200 és 1000 bp. Egy tizedik teljes lizátumot használjuk mennyiségének meghatározására jelen lévő DNS különböző minták és tekinthető “a bevitt teljes DNS”. A felülúszókat inkubáljuk lazac sperma DNS / fehérje-agaróz-50% -os szuszpenzió, hogy csökkentsék a nem specifikus háttér. Immunprecipitáció ezután végzett egy éjszakán át 4 ° C-on, 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vagy antitest nélkül (negatív kontroll). Ezeket a felülúszókat egészítve 5 mol / l nátrium-klorid elegyét egy éjszakán át 65 ° C-on, hogy visszatérjen fehérje-DNS kereszt-kapcsolatok. A immunkomplexek tovább kezeltük DNase- és RN-áz-mentes proteináz-K, és a DNS-t tisztítottuk fenol / kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással. PCR-t a specifikus primerek megfelelő egy szekvenciát a promoter régió a humán iNOS gén (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expressziós vizsgálatok

Az expressziós vizsgálatokhoz a rekombináns törzs L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Németország) és a gén-EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromoszomális SSU integrált, tenyésztünk a különböző médiumok a korábban leírt és a kiegészül további 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Németország). A termesztés során, 1 ml-es mintákat vettünk, centrifugáltuk (2000 x g mellett, 20 ° C, 10 perc), és mossuk 0,9% NaCl-oldattal. Üledéket pufferben (20 mM HEPES, 5 mM EDTA-t, 2 mM DTT), és a szétroncsolt szonifikáció az ultrahangos processzor UP400S (Energia alkalmazásával ~ 400 Ws). A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk (6000 x g, 4 ° C, 5 perc) és a nátrium-dodecil-szulfát-- poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-PAGE) redukáló körülmények között szerinti Laemmli módszerével (1970) 12,5% polyacralamide gélek . EGFP-expressziót vizsgáltuk kevert kultúrában. (Fritsche és munkatársai. 2007)

Hielscher féle UP100H eljárva állítjuk elő EHEC DNS chip tömb elemzés

Elektroforetikus analízis genomi DNS-ének E. coli EDL933 vetjük alá 0 - 15 perc ultrahangos kezeléssel. L jelzi a DNS létrát. (Basselet et al. 2008)

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


kromatin immunprecipitációs

Ultrahangos sejtfeltáróval UP100H (100W) a lízis, sejtfeltárás és DNS nyírás.A kromatin immunprecipitációt vizsgálatot végeztünk a chip-ITTm Expressz (Active Motif, Carlsbad, CA, USA), a gyártó utasításai szerint néhány módosítással. Röviden, a differenciált humán podocyták voltak térhálósított 1% formaldehiddel 10 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A sejteket mostuk jéghideg PBS-sel, és a rögzítőpár reakciót úgy állítottuk le, 0,125 M glicin 5 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ismét mossuk jéghideg PBS-sel, és eltávolítottuk az edényről. A sejteket centrifugálással ülepítjük, és újra szuszpendáljuk lízis-pufferben. Centrifugálás után, ülepítettük sejtmagokat újra felszuszpendáljuk a nyíró pufferben, jégen inkubáltuk 30 percig, majd a kromatin volt nyírt szonikálással, például UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Németország) 25% -os teljesítmény mellett 5 impulzus 20 másodpercenként jégen körülbelül 200-600 bp méretű fragmensekre. A nyírt kromátint ezután centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az immunprecipitációhoz 60 μl kromatinot inkubáltunk 1 μg Sp1-gyel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) vagy NF-κB p50 (Abcam) antitestekkel vagy nyúl IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), negatív kontrollként, éjszakán át 4 ° C-on, enyhe forgatással. A mágneses gyöngyökhöz kötött immunkomplexeket összegyűjtöttük mágneses állvánnyal, extenzíven mossuk, és a fehérje / DNS keresztkötéseket megfordítottuk, és a DNS-t eluáljuk a valós idejű PCR analízishez. (Ristola et al., 2009)

EHEC DNS előkészítése chip tömb elemzés

Elrendezése sejtlizátumok és extraháljuk DNS-ek
A bakteriális pelle-szuszpendáljuk PBS-ben a kívánt végső koncentráció kezeltünk ultrahang diszruptor UP100H (Hielscher GmbH, Németország), amely egy mikrotipp MS1-gyel (átmérője 1 mm) van felszerelve. A működési frekvencia 30 kHz és a tényleges kimeneti teljesítmény 100 W volt. A művelet során a mintákat jeges vizes fürdőben hűtöttük, kevertük és centrifugáltuk. A mintákat áramlási citometriás vizsgálatokhoz használtuk, míg a későbbi kezeléshez a mintákat hőkezelésnek vetettük alá (95 ° C, 5 perc). A nyers sejtlizátumokat fenol: kloroform: izoamil-alkohol (25: 24: 1) elegyével feldolgozzuk. Ehhez a keverékhez hasonló térfogatot adtunk a lizátummintához, az oldatot erőteljesen kevertük 15 másodpercig, és 15 000 xg-en 2 percig szobahőmérsékleten (RT) 22 ° C-on centrifugáltuk. A genomiális DNS-t tartalmazó felső vizes fázist gondosan elválasztottuk és új steril Eppendorf-csőben gyűjtöttük össze.
Ezután a mintákat ultrahangosítottuk a DNS fragmentálására. Az ultrahangos lépést a fent leírt feltételekkel valósítottuk meg. A genomiális DNS fragmens hatásának értékelésére a mintákat agaróz gélelektroforézissel analizáltuk.
(…) A mintákat 2,5 percig ultrahangos ultrahanggal extraháltuk hőkezelés és centrifugálás után. A felszabaduló DNS-t kétszer extraháltuk fenol: kloroform: izoamil-alkohol keverékkel, majd utána második ultrahangos kezelésnek vetettük alá 0-15 percig. Agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk az extrahálás utáni ultrahangos fragmentációnak alávetett DNS méreteloszlásának meghatározására (jobb felső ábra). A nagyon töredezett DNS nyilvánvaló volt a DNS-kenet jelenlétéből, nem pedig a nagy molekulatömegű sávokból, amelyeket a mintákból 2,5 percig vagy hosszabb időtartamig ultrahanggal távolítottunk el. A hosszabb szonikáció fokozatosan csökkentette a töredékhosszat körülbelül 150-600 bázispár nagyságrendig, és az ultrahangos kezelés 15 percig tovább degradálta ezeket a töredékeket, amint ez legtöbbször a kenet felső részén látható. Így az átlagos DNS-fragmens mérete fokozatosan csökkent az ultrahangos idővel, és az 5 perces kezelés lehetővé tette a chipméretarathoz leginkább alkalmas DNS-fragmensek méretének elérését. Végül meghatároztuk az első 2 perc ultrahangos kezelést, DNS-extrakciót (2 ×) és az ezt követő 5 perces ultrahangos kezelést tartalmazó DNS-analit előkészítési eljárást. (Basselet et al., 2008)

A kromatin immunprecipitációs (chip)

Ultrahangos processzor UP100H DNS, RNS és kromatin nyíró. (Kattintson a nagyításhoz!)A HEK293 sejteket a fent leírt módon tenyésztettük, és szobahőmérsékleten 45 percig 2 mM diszukcinimidil-glutáráttal rögzítettük. Ezt követően a sejteket PBS-sel kétszer mossuk. A kromatinot 1% (térfogat / térfogat) formaldehid alkalmazásával 10 percig szobahőmérsékleten keresztkötjük, és jéghideg PBS-sel kétszer mossuk. A térhálósító reakciót leállítjuk glicinnel való inkubálással 0,125 M végső koncentrációban 5 percig szobahőmérsékleten. Tripszinnel végzett inkubálás után a sejteket a sejttenyésztő edényből lekaparjuk és kétszer PBS-sel mossuk. A sejtpelletet újra felszuszpendáltuk lízispufferben (5 mM csövek, pH 8,0, 85 mM KCl és 0,5% (v / v) Nonidet P-40), 10 percig jégen inkubáltuk, és Dounce homogenizátorral homogenizáltuk. Ezután a magokat centrifugálással (3500 xg, 5 perc, 4 ° C) pelletizáltuk, és újból szuszpendáltuk nucleus pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA és 1 térfogat% SDS). A magokat szonikálással szüntettük meg három 20-as impulzussal a UP50H szonikátort (Hielscher Ultraschall Technologie) egy beállított ciklus 0,5 és amplitúdó 30%, így kapunk genomiális DNS-fragmensek egy ömlesztett mérete 200 - 1000 bp. Chip, 50 g DNS-t hígítunk 4-szeres immunprecipitációs pufferben (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA-t, 1,1% (v / v) Triton X-100 és 0,01% (w / v) SDS-t). (Weiske et al. 2006)

A hiszton módosítás elemzés kromatin immunprecipitáció (chip)

Röviden, 6 x 106 a sejteket kétszer PBS-sel mostuk, és a tenyésztő lemezen 15 percen keresztül szobahőmérsékleten 0,5% formaldehid jelenlétében keresztkötöttük. A térhálósító reakciót leállítottuk 0,125 M glicin hozzáadásával. Minden további lépést 48 ° C-on végeztünk. Az összes puffer előhűtött és tartalmazott proteázgátlókat (Complete Mini, Roche). A sejteket PBS-sel kétszer mossuk, majd kaparjuk. A gyűjtött pelleteket feloldjuk 1 ml lízispufferben (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8), és ultrahanggal hidrolizáljuk 10 ciklusban 100% amplitúdóban, UP50H szonikátort (Hielscher, Teltow, Németország). A kromatin fragmentáció tettük láthatóvá 1% -os agaróz gélen. Keletkezett DNS-fragmenseket a 200-500pb tartományban. Oldható kromatin kaptuk végzett centrifugálással mintákat 14,000g 10 percen át 48 ° C-on. Az oldható frakciót 1/10 arányban hígított hígítási pufferben (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH = 8, 150 mM NaCl), majd osztjuk és tároltuk 80 ° C-on tároltuk felhasználásig. (Rodriguez és munkatársai. 2008)

Eszköz Teljesítmény [W] típus Kötet [ml]
VialTweeter 200 Önálló 00,5 1,5
UP50H 50 kézi vagy standmounted 00,01 250
UP100H 100 kézi vagy standmounted 00,01 500
Uf200 ः t 200 kézi vagy standmounted 0.1. 1000
UP200St 200 standmounted 0.1. 1000
UP400St 400 standmounted 5,0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreaktor 10 200
GDmini2 200 szennyeződésmentes áramlási sejt

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


Hielscher a VialTweeter van is'deal egyidejű előállítására több minta

VialTweeter ultrahangos minta-prep

Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!

Kérjen bővebb információt

Kérjük, használja az alábbi űrlapot, ha szeretné, hogy további információt kérni ultrahangos homogenizáció. Mi lesz boldog, hogy Önnek egy ultrahangos rendszer megfelel a követelményeknek.









Kérjük, vegye figyelembe Adatvédelmi irányelvek.


Irodalom / References

  • Basselet P., Węgrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): A minta feldolgozása DNS chip tömb-alapú elemzést enterohemorrhagiás Escherichia coli (EHEC). A mikrobiális sejtgyárak 07:29. 2008-ra.
  • Doublier S., RIGANTI Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA némító Visszaállítja a doxorubicinrezisztenciát Humán Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Módszer értékelése Fusarium DNS extrakció micéliumból és a búza a down-stream valós idejű PCR mennyiségi és összefüggés a mikotoxin szintek . Journal of Mikrobiológiai módszerek 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of a növekedési viselkedésének Leishmania tarentolae - egy új expressziós rendszer rekombináns fehérjék. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): szabályozása Neph3 gén podocyták - kulcsfontosságú szerepe transzkripciós faktorok NF-kB és az SP1. BMC Molecular Biology 10:83 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): genomot követését metilálatlan DNS Alu megismétli a normális és a rákos sejtek. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): A hisztidintriád Protein Hint1 Eseményindítók apoptózis Független genetikai aktivitását. A Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27.356-27.366.


Tudni érdemes

Ultrahangos / akusztikus kavitáció teremt rendkívül intenzív erők, amely elősegíti a kristályosodási és kiválási folyamatok (Kattintson a képre!)

Ultrahangos DNS nyíró alapul akusztikus kavitáció, és hidrodinamikai nyíróerők