• A DNS és az RNS nyírás során a DNS molekulák kisebb darabokra bomlik. A DNS / RNS fragmentáció az egyik fontos mintaelőkészítési lépés a következő generációs szekvenálás (NGS) könyvtárainak létrehozásához.
• Ultrahangos DNS nyíró használja az erők akusztikus kavitáció megtörni a DNS-t vagy RNS-t darabokra 100 – 5KB bp.
• Ultrahangos nyírási lehetővé teszi a pontos DNS-fragmentáció, és adaptáció a kívánt DNS hossza.

DNS nyírás ultrahangos kezeléssel

Hielscher Ultrasonics kínál különböző ultrahang-alapú megoldások DNS, RNS és a kromatin nyírás. Válasszon egy próba-típusú ultrasonicators (például UP100H) közvetlen szonikáció mikrokatéter segítségével, vagy használja a VialTweeeter vagy ultrahangos cuphorn közvetett DNS elkészítéséhez különböző minta egyidejű. Hielscher ideális eszköz tekintve az Ön igényeinek: Legyen akár 1 vagy akár 10 minta, volumen ul hogy liter térfogatú – Hielscher ultrahangos processzorok állnak, hogy megfeleljen a követelményeknek, hogy készítsen DNS, RNS és a kromatin fragmentumok a megfelelő hosszúságú. A reprodukálhatóság, könnyű kezelhetőség és pontos ellenőrzését teszi lehetővé a megbízható könyvtár következő generációs szekvenálás.
Ezzel szemben az enzimatikus DNS-fragmentáció, ultrahangos nyírási vonatkozik a tiszta mechanikai nyíróerőkkel szemben, anélkül, hogy bármilyen vegyi anyagok. A pontos beállítását a folyamat paramétereinek, ultrahangos nyírási termel nagy molekulatömegű DNS-fragmentumok (plazmid és a genom DNS-t).
Tisztított nukleinsavak is erősíthető előtt vagy után egy fragmentáció lépést.
Az ultrahangos kezelés paraméterei (teljesítmény, impulzus ciklus / robban, idő és hőmérséklet) lehet szabályozni biztonságosan keresztül szoftver beállításait.

Protokollok Ultrahangos DNS nyírása

A kromatin immunprecipitációs vizsgálat

Röviden, a sejteket 60 mm átmérőjű edényekbe (400 000 per csészébe) bevontuk, és RhoA siRNS-sel transzfektáltuk (a leírás szerint); 72 óra elteltével formaldehiddel (végkoncentráció, 1%) 10 percig 37 ° C-on inkubáltuk a keresztkötéses fehérjék DNS-ével. A térhálósító reakciót egy tizedszernyi 1,25 mol / l glicin hozzáadásával leállítottuk, így 125 mmol / l végkoncentrációt adva. A sejteket jéghideg PBS-sel kétszer mostuk, radioimmunoprecipitációs vizsgálati pufferben (150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxikolát, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl )], amely 1 mmol / l fenil-metil-szulfonil-fluoridot, 1 Ag / ml aprotinint és 1 Ag / ml pepsztatin A-t tartalmaz, és jégen tartjuk 30 percig. Ezután a sejtlizátumokat jégen sonicáltuk a Hielscher UP200S ultrahang szonikátort (3 x 40 s, amplitúdó 40%, 1 ciklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), amíg térhálósított chromatins arra nyírt, így DNS-fragmenseket 200 és 1000 bp. Egy tizedik teljes lizátumot használjuk mennyiségének meghatározására jelen lévő DNS különböző minták és tekinthető “a bevitt teljes DNS”. A felülúszókat inkubáljuk lazac sperma DNS / fehérje-agaróz-50% -os szuszpenzió, hogy csökkentsék a nem specifikus háttér. Immunprecipitáció ezután végzett egy éjszakán át 4 ° C-on, 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vagy antitest nélkül (negatív kontroll). Ezeket a felülúszókat egészítve 5 mol / l nátrium-klorid elegyét egy éjszakán át 65 ° C-on, hogy visszatérjen fehérje-DNS kereszt-kapcsolatok. A immunkomplexek tovább kezeltük DNase- és RN-áz-mentes proteináz-K, és a DNS-t tisztítottuk fenol / kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással. PCR-t a specifikus primerek megfelelő egy szekvenciát a promoter régió a humán iNOS gén (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expressziós vizsgálatok

Az expressziós vizsgálatokhoz a rekombináns törzs L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Németország) és a gén-EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromoszomális SSU integrált, tenyésztünk a különböző médiumok a korábban leírt és a kiegészül további 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Németország). A termesztés során, 1 ml-es mintákat vettünk, centrifugáltuk (2000 x g mellett, 20 ° C, 10 perc), és mossuk 0,9% NaCl-oldattal. Üledéket pufferben (20 mM HEPES, 5 mM EDTA-t, 2 mM DTT), és a szétroncsolt szonifikáció az ultrahangos processzor UP400S (Energia alkalmazásával ~ 400 Ws). A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk (6000 x g, 4 ° C, 5 perc) és a nátrium-dodecil-szulfát-- poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-PAGE) redukáló körülmények között szerinti Laemmli módszerével (1970) 12,5% polyacralamide gélek . EGFP-expressziót vizsgáltuk kevert kultúrában. (Fritsche és munkatársai. 2007)

kromatin immunprecipitációs

A kromatin immunprecipitációt vizsgálatot végeztünk a chip-IT^Tm Expressz (Active Motif, Carlsbad, CA, USA), a gyártó utasításai szerint néhány módosítással. Röviden, a differenciált humán podocyták voltak térhálósított 1% formaldehiddel 10 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A sejteket mostuk jéghideg PBS-sel, és a rögzítőpár reakciót úgy állítottuk le, 0,125 M glicin 5 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ismét mossuk jéghideg PBS-sel, és eltávolítottuk az edényről. A sejteket centrifugálással ülepítjük, és újra szuszpendáljuk lízis-pufferben. Centrifugálás után, ülepítettük sejtmagokat újra felszuszpendáljuk a nyíró pufferben, jégen inkubáltuk 30 percig, majd a kromatin volt nyírt szonikálással, például UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Németország) 25% -os teljesítmény mellett 5 impulzus 20 másodpercenként jégen körülbelül 200-600 bp méretű fragmensekre. A nyírt kromátint ezután centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük. Az immunprecipitációhoz 60 μl kromatinot inkubáltunk 1 μg Sp1-gyel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) vagy NF-κB p50 (Abcam) antitestekkel vagy nyúl IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), negatív kontrollként, éjszakán át 4 ° C-on, enyhe forgatással. A mágneses gyöngyökhöz kötött immunkomplexeket összegyűjtöttük mágneses állvánnyal, extenzíven mossuk, és a fehérje / DNS keresztkötéseket megfordítottuk, és a DNS-t eluáljuk a valós idejű PCR analízishez. (Ristola et al., 2009)

EHEC DNS előkészítése chip tömb elemzés

Elrendezése sejtlizátumok és extraháljuk DNS-ek
A bakteriális pelle-szuszpendáljuk PBS-ben a kívánt végső koncentráció kezeltünk ultrahang diszruptor UP100H (Hielscher GmbH, Németország), amely egy mikrotipp MS1-gyel (átmérője 1 mm) van felszerelve. A működési frekvencia 30 kHz és a tényleges kimeneti teljesítmény 100 W volt. A művelet során a mintákat jeges vizes fürdőben hűtöttük, kevertük és centrifugáltuk. A mintákat áramlási citometriás vizsgálatokhoz használtuk, míg a későbbi kezeléshez a mintákat hőkezelésnek vetettük alá (95 ° C, 5 perc). A nyers sejtlizátumokat fenol: kloroform: izoamil-alkohol (25: 24: 1) elegyével feldolgozzuk. Ehhez a keverékhez hasonló térfogatot adtunk a lizátummintához, az oldatot erőteljesen kevertük 15 másodpercig, és 15 000 xg-en 2 percig szobahőmérsékleten (RT) 22 ° C-on centrifugáltuk. A genomiális DNS-t tartalmazó felső vizes fázist gondosan elválasztottuk és új steril Eppendorf-csőben gyűjtöttük össze.
Ezután a mintákat ultrahangosítottuk a DNS fragmentálására. Az ultrahangos lépést a fent leírt feltételekkel valósítottuk meg. A genomiális DNS fragmens hatásának értékelésére a mintákat agaróz gélelektroforézissel analizáltuk.
(…) A mintákat 2,5 percig ultrahangos ultrahanggal extraháltuk hőkezelés és centrifugálás után. A felszabaduló DNS-t kétszer extraháltuk fenol: kloroform: izoamil-alkohol keverékkel, majd utána második ultrahangos kezelésnek vetettük alá 0-15 percig. Agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk az extrahálás utáni ultrahangos fragmentációnak alávetett DNS méreteloszlásának meghatározására (jobb felső ábra). A nagyon töredezett DNS nyilvánvaló volt a DNS-kenet jelenlétéből, nem pedig a nagy molekulatömegű sávokból, amelyeket a mintákból 2,5 percig vagy hosszabb időtartamig ultrahanggal távolítottunk el. A hosszabb szonikáció fokozatosan csökkentette a töredékhosszat körülbelül 150-600 bázispár nagyságrendig, és az ultrahangos kezelés 15 percig tovább degradálta ezeket a töredékeket, amint ez legtöbbször a kenet felső részén látható. Így az átlagos DNS-fragmens mérete fokozatosan csökkent az ultrahangos idővel, és az 5 perces kezelés lehetővé tette a chipméretarathoz leginkább alkalmas DNS-fragmensek méretének elérését. Végül meghatároztuk az első 2 perc ultrahangos kezelést, DNS-extrakciót (2 ×) és az ezt követő 5 perces ultrahangos kezelést tartalmazó DNS-analit előkészítési eljárást. (Basselet et al., 2008)

A kromatin immunprecipitációs (chip)

A HEK293 sejteket a fent leírt módon tenyésztettük, és szobahőmérsékleten 45 percig 2 mM diszukcinimidil-glutáráttal rögzítettük. Ezt követően a sejteket PBS-sel kétszer mossuk. A kromatinot 1% (térfogat / térfogat) formaldehid alkalmazásával 10 percig szobahőmérsékleten keresztkötjük, és jéghideg PBS-sel kétszer mossuk. A térhálósító reakciót leállítjuk glicinnel való inkubálással 0,125 M végső koncentrációban 5 percig szobahőmérsékleten. Tripszinnel végzett inkubálás után a sejteket a sejttenyésztő edényből lekaparjuk és kétszer PBS-sel mossuk. A sejtpelletet újra felszuszpendáltuk lízispufferben (5 mM csövek, pH 8,0, 85 mM KCl és 0,5% (v / v) Nonidet P-40), 10 percig jégen inkubáltuk, és Dounce homogenizátorral homogenizáltuk. Ezután a magokat centrifugálással (3500 xg, 5 perc, 4 ° C) pelletizáltuk, és újból szuszpendáltuk nucleus pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA és 1 térfogat% SDS). A magokat szonikálással szüntettük meg három 20-as impulzussal a UP50H szonikátort (Hielscher Ultraschall Technologie) egy beállított ciklus 0,5 és amplitúdó 30%, így kapunk genomiális DNS-fragmensek egy ömlesztett mérete 200 - 1000 bp. Chip, 50 g DNS-t hígítunk 4-szeres immunprecipitációs pufferben (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA-t, 1,1% (v / v) Triton X-100 és 0,01% (w / v) SDS-t). (Weiske et al. 2006)

A hiszton módosítás elemzés kromatin immunprecipitáció (chip)

Röviden, 6 x 10⁶ a sejteket kétszer PBS-sel mostuk, és a tenyésztő lemezen 15 percen keresztül szobahőmérsékleten 0,5% formaldehid jelenlétében keresztkötöttük. A térhálósító reakciót leállítottuk 0,125 M glicin hozzáadásával. Minden további lépést 48 ° C-on végeztünk. Az összes puffer előhűtött és tartalmazott proteázgátlókat (Complete Mini, Roche). A sejteket PBS-sel kétszer mossuk, majd kaparjuk. A gyűjtött pelleteket feloldjuk 1 ml lízispufferben (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8), és ultrahanggal hidrolizáljuk 10 ciklusban 100% amplitúdóban, UP50H szonikátort (Hielscher, Teltow, Németország). A kromatin fragmentáció tettük láthatóvá 1% -os agaróz gélen. Keletkezett DNS-fragmenseket a 200-500pb tartományban. Oldható kromatin kaptuk végzett centrifugálással mintákat 14,000g 10 percen át 48 ° C-on. Az oldható frakciót 1/10 arányban hígított hígítási pufferben (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH = 8, 150 mM NaCl), majd osztjuk és tároltuk 80 ° C-on tároltuk felhasználásig. (Rodriguez és munkatársai. 2008)