Ultrahangos DNS-nyírás

A DNS- és RNS-nyírás során a hosszú DNS-molekulák kisebb darabokra töredeznek, ami kulcsfontosságú lépés a minták előkészítésében a következő generációs szekvenálási (NGS) könyvtár építéséhez. Az ultrahangos DNS-nyírás akusztikus kavitációs erőket alkalmaz, hogy a DNS-t vagy RNS-t 100 bp és 5 kb közötti töredékekre bontsa. Ez a módszer lehetővé teszi a fragmensméret pontos szabályozását, megkönnyítve a kívánt DNS-hossz testreszabását az optimális szekvenálási eredmények érdekében.

DNS nyírás ultrahangos kezeléssel

A Hielscher Ultrasonics különböző ultrahang alapú megoldásokat kínál DNS, RNS és kromatin nyíráshoz. Válasszon egy szonda típusú ultrahangos készülékek (pl. UP100H) közvetlen ultrahangos kezeléshez mikrotip segítségével, vagy használja a VialTweeeter vagy az ultrahangos cuphorn a különböző minták közvetett DNS-előkészítéséhez egyszerre. A Hielscher ideális eszközt kínál az Ön igényeinek megfelelően: ha 1 vagy legfeljebb 10 mintája van, a térfogatok mikrolitertől literig terjednek – A Hielscher szonikátorok megfelelnek az Ön követelményeinek, hogy DNS-, RNS- és kromatinfragmenseket készítsenek a megfelelő hosszúságban. A reprodukálhatóság, az egyszerű kezelés és a pontos vezérlés megbízható könyvtárat tesz lehetővé a következő generációs szekvenáláshoz.
Az enzimatikus DNS-fragmentációval ellentétben az ultrahangos nyírás tiszta mechanikai nyíróerőket alkalmaz vegyi anyagok hozzáadása nélkül. A folyamatparaméterek pontos beállításával az ultrahangos nyírás nagy molekulatömegű DNS-fragmenseket (plazmid és genomi DNS) eredményez.
A tisztított nukleinsavak felerősíthetők a fragmentációs lépés előtt vagy után.
Szonikációs paraméterek (teljesítmény, impulzusciklus / sorozatok, idő és hőmérséklet) biztonságosan vezérelhetők szoftverbeállításokkal.

Az ultrahangos DNS-nyírás protokolljai

Kromatin immunprecipitációs vizsgálathoz

Röviden, a sejteket 60 mm átmérőjű edényekbe (csészénként 400 000) lemezelték, és RhoA siRNS-sel transzfektálták (a leírtak szerint); 72 óra elteltével formaldehiddel (végső koncentráció, 1%) inkubáltuk őket 10 percig 37 °C-on, hogy a fehérjéket keresztkötésnek vessék alá a DNS-sel. A térhálósító reakciót egytized térfogatrész 1,25 mol/l glicin hozzáadásával állítottuk le, így 125 mmol/l végső koncentrációt kaptunk. A sejteket kétszer átmostuk jéghideg PBS-sel, radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferben [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxikolát, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)] 1 mmol/l fenilmetil-szulfonil-fluoridot, 1 Ag/ml aprotinint és 1 Ag/ml pepsztatin A-t tartalmazó reszuszpendáltunk, majd 30 percig jégen tartottuk. Ezután a sejt lizátumokat jégen ultrahanggal ultrahangoztuk egy Hielscher UP200S ultrahangos szonikátor (3 x 40 s, amplitúdó 40%, 1. ciklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), amíg a térhálósított kromatinokat meg nem nyírták, hogy DNS-fragmenseket kapjanak 200 és 1000 bp között. A teljes lizátum egytizedét használták a különböző mintákban jelen lévő DNS mennyiségének mennyiségi meghatározására, és “teljes bemeneti DNS”. A felülúszókat lazacspermium DNS/fehérje agaróz-50% szuszpenzióval inkubáltuk a nem specifikus háttér csökkentése érdekében. Az immunprecipitációt ezután egy éjszakán át 4°C-on 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vagy antitest nélkül (negatív kontroll) végeztük. Ezeket a felülúszókat 5 mol/l NaCl-lal egészítették ki, és egy éjszakán át 65 °C-on melegítették, hogy visszafordítsák a fehérje-DNS keresztkötéseket. Az immunkomplexeket tovább kezeltük DNSáz- és RNázmentes proteináz K-val, és a DNS-t fenol/kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. A PCR-t specifikus primerekkel végeztük, amelyek megfelelnek a humán iNOS gén promóter régióján belüli szekvenciának (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier és mások, 2008)

EGFP-expressziós vizsgálatok

Az expressziós vizsgálatokhoz a L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Németország) rekombináns törzset az EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) génnel, integrált ssu kromoszómával tenyésztettük különböző táptalajokban, és kiegészítettük 100 mg l-lel^-1 Nourseothricin (Jénai Biotudomány, Németország). A tenyésztés során 1 ml mintát vettünk, centrifugáltuk (2000 × g, 20 °C, 10 perc) és 0,9%-os NaCl-oldattal mostuk. A pelletet pufferben (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) szuszpendálták, és ultrahangos processzorral szonifikációval szétestették UP400S (energia alkalmazása ∼ 400 Ws). A sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el (6000 × g, 4°C, 5 perc), és nátrium-dodecil-szulfát – poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemeztük redukáló körülmények között Laemmli (1970) módszere szerint, 12,5%-os poliakralamid gélekkel. Az EGFP-expressziót agitált kultúrában vizsgálták. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immunprecipitáció

A kromatin immunprecipitációs vizsgálatot ChIP-IT alkalmazásával végeztük^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) a gyártó utasításai szerint, néhány módosítással. Röviden, a differenciált humán potocitákat 1% -os formaldehiddel térhálósították 10 percig szobahőmérsékleten. A sejteket jéghideg PBS-sel mostuk, és a fixációs reakciót 0,125 M glicin hozzáadásával állítottuk le 5 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ismét jéghideg PBS-sel mosták és kaparták az edényből. A sejteket centrifugálással pelletáltuk, majd a lízispufferben újra szuszpendáltuk. Centrifugálás után a pelletált magokat újra szuszpendáltuk a nyírópufferben, jégen inkubáltuk 30 percig, és a kromatint szonikálással nyírtuk, pl. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Németország) 25% -os teljesítményen 5 impulzus 20 másodpercenként jégen körülbelül 200–600 bp töredékekké. A nyírt kromatint ezután centrifugálták, és a felülúszót összegyűjtötték. Immunprecipitációk esetén 60 μl kromatint inkubáltunk 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) vagy NF-κB p50 (Abcam) antitestekkel vagy nyúl IgG-vel (Zymed Laboratories), negatív kontrollként, egy éjszakán át 4°C-on, enyhe forgatással. A mágneses gyöngyökhöz kötött immunkomplexeket mágneses állvány segítségével gyűjtöttük össze, alaposan átmostuk, és a fehérje/DNS keresztkötéseket megfordítottuk, és DNS-t eluáltunk a valós idejű PCR-elemzéshez. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNS előkészítés chip array elemzéshez

A sejtlizátumok és az extrahált DNS-ek elrendezése
A PBS-ben a kívánt végső koncentrációra szuszpendált baktériumpelleteket ultrahangos zavaró UP100H (Hielscher GmbH, Németország) MS1 mikrohegygel felszerelve (1 mm átmérőjű). A működési frekvencia 30 kHz volt, a tényleges kimeneti teljesítmény pedig 100 W. A művelet során a mintákat jeges vízfürdőben hűtöttük, összekevertük és centrifugáltuk. A mintákat áramlási citometriás vizsgálatokhoz használtuk, míg a későbbi kezeléshez a mintákat hőkezelésnek vetettük alá (95 ° C, 5 perc). A nyers sejtlizátumokat fenol:kloroform:izoamil-alkohol keverékével dolgoztuk fel (25:24:1). Ebből a keverékből azonos térfogatot adtunk a lizátummintához, az oldatot 15 másodpercig erőteljesen örvényeztük, majd 15 000 × g-on 2 percig centrifugáltuk szobahőmérsékleten (RT) 22 °C körül. A genomi DNS-t tartalmazó felső vizes fázist gondosan elválasztottuk, és egy új, steril Eppendorf-csőbe gyűjtöttük.
Ezt követően mintákat ultrahanggal kezeltünk a DNS fragmentálására. Az ultrahangos lépést a fent leírt körülmények között valósítottuk meg. A genomi DNS-re gyakorolt fragmentációs hatások értékeléséhez a mintákat agarózgél-elektroforézissel elemeztük.
(…) A korábban 2,5 percig ultrahangos mintákat hőkezelés és centrifugálás után extrakciós lépésnek vetettük alá. A felszabaduló DNS-t kétszer extraháltuk fenol: kloroform: izoamil-alkohol keverékkel, majd 0-15 percig második ultrahangos kezelésnek vetettük alá. Agarózgél elektroforézist alkalmaztunk az extrakció utáni ultrahangos fragmentációnak kitett DNS méreteloszlásának meghatározására (ábra a jobb felső sarokban). Az erősen fragmentált DNS nyilvánvaló volt a DNS-kenet jelenlétéből, nem pedig a nagy molekulatömegű sávokból, amelyeket 2,5 percig vagy hosszabb ideig ultrahanggal kezelt mintákból távolítottak el. A hosszabb szonikálás fokozatosan csökkentette a töredékek hosszát körülbelül 150-600 bp-re, és az ultrahangos kezelés 15 percig tovább rontotta ezeket a töredékeket, amint azt leginkább a kenet felső része mutatja. Így az átlagos DNS-fragmens mérete fokozatosan csökkent az ultrahangos idővel, és az 5 perces kezelés lehetővé tette a chiptömb vizsgálatokhoz legmegfelelőbb DNS-fragmensek méretének megszerzését. Végül megállapították a DNS-analit előkészítési eljárást, amely magában foglalja az ultrahangos kezelés első 2 percét, a DNS-extrakciót (2×), majd az azt követő 5 perces szonikálást. (Basselet et al. 2008)

Kromatin immunprecipitáció (ChIP)

A HEK293 sejteket a fent leírtak szerint tenyésztettük, és szobahőmérsékleten 2 mM diszukcinimidil-glutaráttal rögzítettük 45 percig. Ezt követően a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. A kromatint szobahőmérsékleten 10 percig térhálósították 1% (v/v) formaldehiddel, és kétszer jéghideg PBS-sel mosták. A térhálósító reakciót glicinnel történő inkubálással állítottuk le 0,125 M végső koncentrációban 5 percig szobahőmérsékleten. Tripszinnel történő inkubálás után a sejteket lekapartuk a sejttenyésztő edényből, és kétszer átmostuk PBS-sel. A sejtpelletet újra szuszpendáltuk lízispufferben (5 mM csövek, pH 8,0, 85 mM KCl és 0,5% (v/v) Nonidet P-40), jégen inkubáltuk 10 percig, és homogenizáltuk Dounce homogenizátorral. Ezt követően az atommagokat centrifugálással (3500 x g, 5 perc, 4 °C) pelletáltuk, majd atommagpufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA és 1% (w/v) SDS) szuszpendáltuk. A magokat szonikálással megzavarták három 20-s impulzussal egy UP50H szonikátor (Hielscher Ultraschall Technologie) 0,5-ös ciklusban és 30% amplitúdóval, ami 200-1000 bp ömlesztett méretű genomi DNS-fragmenseket eredményez. A ChIP esetében 50 g DNS-t 4-szeresére hígítottunk immunprecipitációs pufferben (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 és 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Hisztonmódosítás-analízis kromatin immunprecipitációval (ChIP)

Röviden, 6 x 10⁶ A sejteket kétszer átmostuk PBS-sel, és a tenyészlemezen 15 percig térhálósítottuk szobahőmérsékleten, 0,5% formaldehid jelenlétében. A térhálósító reakciót 0,125 M glicin hozzáadásával állítottuk le. Minden további lépést 48°C-on hajtottak végre. Minden puffert előhűtöttünk, és proteázgátlókat tartalmaztunk (Complete Mini, Roche). A sejteket kétszer átmosták PBS-sel, majd kaparták. Az összegyűjtött pelleteket feloldottuk 1 ml lízispufferben (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8), és hideg etanolfürdőben ultrahanggal kezeltük 10 cikluson keresztül 100% amplitúdóval UP50H szonikátor (Hielscher, Teltow, Németország). A kromatin fragmentációt 1% agaróz gélben vizualizáltuk. A kapott töredékek a 200–500 pb tartományban voltak. Az oldható kromatint úgy állítottuk elő, hogy az ultrahangos mintákat 14 000 g-on 10 percig 48 ° C-on centrifugáljuk. Az oldható frakciót hígító pufferben (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1:10 arányban hígítottuk, majd aliquot részre hígítottuk és felhasználásig 80 °C-on tároltuk. (Rodriguez et al. 2008)