Ultrahangos DNS-nyírás

A DNS- és RNS-nyírás során a hosszú DNS-molekulák kisebb darabokra töredeznek, ami kulcsfontosságú lépés a minták előkészítésében a következő generációs szekvenálási (NGS) könyvtár építéséhez. Az ultrahangos DNS-nyírás akusztikus kavitációs erőket alkalmaz, hogy a DNS-t vagy RNS-t 100 bp és 5 kb közötti töredékekre bontsa. Ez a módszer lehetővé teszi a fragmensméret pontos szabályozását, megkönnyítve a kívánt DNS-hossz testreszabását az optimális szekvenálási eredmények érdekében.

DNS nyírás ultrahangos kezeléssel

A Hielscher Ultrasonics különböző ultrahang alapú megoldásokat kínál DNS, RNS és kromatin nyíráshoz. Válasszon egy szonda típusú ultrahangos készülékek (pl. UP100H) közvetlen ultrahangos kezeléshez mikrotip segítségével, vagy használja a VialTweeeter vagy az ultrahangos cuphorn a különböző minták közvetett DNS-előkészítéséhez egyszerre. A Hielscher ideális eszközt kínál az Ön igényeinek megfelelően: ha 1 vagy legfeljebb 10 mintája van, a térfogatok mikrolitertől literig terjednek – A Hielscher szonikátorok megfelelnek az Ön követelményeinek, hogy DNS-, RNS- és kromatinfragmenseket készítsenek a megfelelő hosszúságban. A reprodukálhatóság, az egyszerű kezelés és a pontos vezérlés megbízható könyvtárat tesz lehetővé a következő generációs szekvenáláshoz.
Az enzimatikus DNS-fragmentációval ellentétben az ultrahangos nyírás tiszta mechanikai nyíróerőket alkalmaz vegyi anyagok hozzáadása nélkül. A folyamatparaméterek pontos beállításával az ultrahangos nyírás nagy molekulatömegű DNS-fragmenseket (plazmid és genomi DNS) eredményez.
A tisztított nukleinsavak felerősíthetők a fragmentációs lépés előtt vagy után.
Szonikációs paraméterek (teljesítmény, impulzusciklus? sorozatok, idő és hőmérséklet) biztonságosan vezérelhetők szoftverbeállításokkal.

Az ultrahangos DNS-nyírás protokolljai

Kromatin immunprecipitációs vizsgálathoz

Röviden, a sejteket 60 mm átmérőjű edényekbe (csészénként 400 000) lemezelték, és RhoA siRNS-sel transzfektálták (a leírtak szerint); 72 óra elteltével formaldehiddel (végső koncentráció, 1%) inkubáltuk őket 10 percig 37 °C-on, hogy a fehérjéket keresztkötésnek vessék alá a DNS-sel. A térhálósító reakciót egytized térfogatrész 1,25 mol/l glicin hozzáadásával állítottuk le, így 125 mmol/l végső koncentrációt kaptunk. A sejteket kétszer átmostuk jéghideg PBS-sel, radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferben [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxikolát, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)] 1 mmol/l fenilmetil-szulfonil-fluoridot, 1 Ag/ml aprotinint és 1 Ag/ml pepsztatin A-t tartalmazó reszuszpendáltunk, majd 30 percig jégen tartottuk. Ezután a sejt lizátumokat jégen ultrahanggal ultrahangoztuk egy Hielscher UP200S ultrahangos szonikátor (3 x 40 s, amplitúdó 40%, 1. ciklus; Hielscher Ultrasonics GmbH), amíg a térhálósított kromatinokat meg nem nyírták, hogy DNS-fragmenseket kapjanak 200 és 1000 bp között. A teljes lizátum egytizedét használták a különböző mintákban jelen lévő DNS mennyiségének mennyiségi meghatározására, és “teljes bemeneti DNS”. A felülúszókat lazacspermium DNS/fehérje agaróz-50% szuszpenzióval inkubáltuk a nem specifikus háttér csökkentése érdekében. Az immunprecipitációt ezután egy éjszakán át 4°C-on 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vagy antitest nélkül (negatív kontroll) végeztük. Ezeket a felülúszókat 5 mol/l NaCl-lal egészítették ki, és egy éjszakán át 65 °C-on melegítették, hogy visszafordítsák a fehérje-DNS keresztkötéseket. Az immunkomplexeket tovább kezeltük DNSáz- és RNázmentes proteináz K-val, és a DNS-t fenol/kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. A PCR-t specifikus primerekkel végeztük, amelyek megfelelnek a humán iNOS gén promóter régióján belüli szekvenciának (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier és mások, 2008)

EGFP-expressziós vizsgálatok

Az expressziós vizsgálatokhoz a L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Németország) rekombináns törzset az EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) génnel, integrált ssu kromoszómával tenyésztettük különböző táptalajokban, és kiegészítettük 100 mg l-lel^-1 Nourseothricin (Jénai Biotudomány, Németország). A tenyésztés során 1 ml mintát vettünk, centrifugáltuk (2000 × g, 20 °C, 10 perc) és 0,9%-os NaCl-oldattal mostuk. A pelletet pufferben (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) szuszpendálták, és ultrahangos processzorral szonifikációval szétestették UP400S (energia alkalmazása ∼ 400 Ws). A sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el (6000 × g, 4°C, 5 perc), és nátrium-dodecil-szulfát – poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemeztük redukáló körülmények között Laemmli (1970) módszere szerint, 12,5%-os poliakralamid gélekkel. Az EGFP-expressziót agitált kultúrában vizsgálták. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immunprecipitáció

A kromatin immunprecipitációs vizsgálatot ChIP-IT alkalmazásával végeztük^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Németország) 25% -os teljesítményen 5 impulzus 20 másodpercenként jégen körülbelül 200–600 bp töredékekké. A nyírt kromatint ezután centrifugálták, és a felülúszót összegyűjtötték. Immunprecipitációk esetén 60 μl kromatint inkubáltunk 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) vagy NF-κB p50 (Abcam) antitestekkel vagy nyúl IgG-vel (Zymed Laboratories), negatív kontrollként, egy éjszakán át 4°C-on, enyhe forgatással. A mágneses gyöngyökhöz kötött immunkomplexeket mágneses állvány segítségével gyűjtöttük össze, alaposan átmostuk, és a fehérje/DNS keresztkötéseket megfordítottuk, és DNS-t eluáltunk a valós idejű PCR-elemzéshez. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNS előkészítés chip array elemzéshez

A sejtlizátumok és az extrahált DNS-ek elrendezése
A PBS-ben a kívánt végső koncentrációra szuszpendált baktériumpelleteket ultrahangos zavaró UP100H (Hielscher GmbH, Németország) MS1 mikrohegygel felszerelve (1 mm átmérőjű). A működési frekvencia 30 kHz volt, a tényleges kimeneti teljesítmény pedig 100 W. A művelet során a mintákat jeges vízfürdőben hűtöttük, összekevertük és centrifugáltuk. A mintákat áramlási citometriás vizsgálatokhoz használtuk, míg a későbbi kezeléshez a mintákat hőkezelésnek vetettük alá (95 ° C, 5 perc). A nyers sejtlizátumokat fenol:kloroform:izoamil-alkohol keverékével dolgoztuk fel (25:24:1). Ebből a keverékből azonos térfogatot adtunk a lizátummintához, az oldatot 15 másodpercig erőteljesen örvényeztük, majd 15 000 × g-on 2 percig centrifugáltuk szobahőmérsékleten (RT) 22 °C körül. A genomi DNS-t tartalmazó felső vizes fázist gondosan elválasztottuk, és egy új, steril Eppendorf-csőbe gyűjtöttük.
Ezt követően mintákat ultrahanggal kezeltünk a DNS fragmentálására. Az ultrahangos lépést a fent leírt körülmények között valósítottuk meg. A genomi DNS-re gyakorolt fragmentációs hatások értékeléséhez a mintákat agarózgél-elektroforézissel elemeztük.
(…) A korábban 2,5 percig ultrahangos mintákat hőkezelés és centrifugálás után extrakciós lépésnek vetettük alá. A felszabaduló DNS-t kétszer extraháltuk fenol: kloroform: izoamil-alkohol keverékkel, majd 0-15 percig második ultrahangos kezelésnek vetettük alá. Agarózgél elektroforézist alkalmaztunk az extrakció utáni ultrahangos fragmentációnak kitett DNS méreteloszlásának meghatározására (ábra a jobb felső sarokban). Az erősen fragmentált DNS nyilvánvaló volt a DNS-kenet jelenlétéből, nem pedig a nagy molekulatömegű sávokból, amelyeket 2,5 percig vagy hosszabb ideig ultrahanggal kezelt mintákból távolítottak el. A hosszabb szonikálás fokozatosan csökkentette a töredékek hosszát körülbelül 150-600 bp-re, és az ultrahangos kezelés 15 percig tovább rontotta ezeket a töredékeket, amint azt leginkább a kenet felső része mutatja. Így az átlagos DNS-fragmens mérete fokozatosan csökkent az ultrahangos idővel, és az 5 perces kezelés lehetővé tette a chiptömb vizsgálatokhoz legmegfelelőbb DNS-fragmensek méretének megszerzését. Végül megállapították a DNS-analit előkészítési eljárást, amely magában foglalja az ultrahangos kezelés első 2 percét, a DNS-extrakciót (2×), majd az azt követő 5 perces szonikálást. (Basselet et al. 2008)

Kromatin immunprecipitáció (ChIP)

A HEK293 sejteket a fent leírtak szerint tenyésztettük, és szobahőmérsékleten 2 mM diszukcinimidil-glutaráttal rögzítettük 45 percig. Ezt követően a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. A kromatint szobahőmérsékleten 10 percig térhálósították 1% (v/v) formaldehiddel, és kétszer jéghideg PBS-sel mosták. A térhálósító reakciót glicinnel történő inkubálással állítottuk le 0,125 M végső koncentrációban 5 percig szobahőmérsékleten. Tripszinnel történő inkubálás után a sejteket lekapartuk a sejttenyésztő edényből, és kétszer átmostuk PBS-sel. A sejtpelletet újra szuszpendáltuk lízispufferben (5 mM csövek, pH 8,0, 85 mM KCl és 0,5% (v/v) Nonidet P-40), jégen inkubáltuk 10 percig, és homogenizáltuk Dounce homogenizátorral. Ezt követően az atommagokat centrifugálással (3500 x g, 5 perc, 4 °C) pelletáltuk, majd atommagpufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA és 1% (w/v) SDS) szuszpendáltuk. A magokat szonikálással megzavarták három 20-s impulzussal egy UP50H szonikátor (Hielscher Ultraschall Technologie) 0,5-ös ciklusban és 30% amplitúdóval, ami 200-1000 bp ömlesztett méretű genomi DNS-fragmenseket eredményez. A ChIP esetében 50 g DNS-t 4-szeresére hígítottunk immunprecipitációs pufferben (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 és 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Hisztonmódosítás-analízis kromatin immunprecipitációval (ChIP)

Röviden, 6 x 10⁶ A sejteket kétszer átmostuk PBS-sel, és a tenyészlemezen 15 percig térhálósítottuk szobahőmérsékleten, 0,5% formaldehid jelenlétében. A térhálósító reakciót 0,125 M glicin hozzáadásával állítottuk le. Minden további lépést 48°C-on hajtottak végre. Minden puffert előhűtöttünk, és proteázgátlókat tartalmaztunk (Complete Mini, Roche). A sejteket kétszer átmosták PBS-sel, majd kaparták. Az összegyűjtött pelleteket feloldottuk 1 ml lízispufferben (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8), és hideg etanolfürdőben ultrahanggal kezeltük 10 cikluson keresztül 100% amplitúdóval UP50H szonikátor (Hielscher, Teltow, Németország). A kromatin fragmentációt 1% agaróz gélben vizualizáltuk. A kapott töredékek a 200–500 pb tartományban voltak. Az oldható kromatint úgy állítottuk elő, hogy az ultrahangos mintákat 14 000 g-on 10 percig 48 ° C-on centrifugáljuk. Az oldható frakciót hígító pufferben (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1:10 arányban hígítottuk, majd aliquot részre hígítottuk és felhasználásig 80 °C-on tároltuk. (Rodriguez et al. 2008)