Ultrahangos lízisét E. Coli

  • E. coli baktériumokban a leggyakrabban használt baktériumok mikrobiológia és biotechnológia.
  • Ultrahangos sejt károsító megbízható és reprodukálható eredményeket a lízis E. coli.
  • Intenzív még pontosan vezérelhető a kavitáció és a nyíróerők eredményeznek teljes feltárására és a magas extrakciós hozammal (például fehérjéket, DNS-t).

Miért az E. coli ultrahangos sejtzavara az előnyben részesített módszer?

Az ultrahangos homogenizátorok vagy szonda típusú ultrahangos készülékek számos előnyt kínálnak az E. coli lízis számára, mivel az intenzív ultrahang hatékonyan megzavarja a sejtfalakat és a membránokat. A szonda típusú ultrahangos készülékeket széles körben használják E. coli lízisre a következő okok miatt:

  • A sejtfalak hatékony megzavarása: Az E. coli félig merev sejtfala peptidoglikánból áll, amelyet nehéz lehet feltörni a hagyományos lízis módszerekkel. A szonda típusú ultrahangos készülék intenzív ultrahangos hullámokat generál, amelyek kavitációs buborékokat hoznak létre a sejteket körülvevő folyadékban. Amikor ezek a buborékok összeomlanak, nagy sebességű folyadéksugarakat és lökéshullámokat generálnak, amelyek a sejtfalak mechanikai megzavarását eredményezik, hatékonyan felszabadítva a sejttartalmat, például a biomolekulákat.
  • Fokozott penetráció: A szonda / sonotrode által generált ultrahangos hullámok mélyen behatolhatnak a mintába, elérve nagyobb számú E. coli sejtet és egyenletesen kezelve őket. Ez segít biztosítani, hogy a lízis egyenletesebb legyen az egész mintában, ami nagyobb sejtzavar-hatékonyságot eredményez.
  • Csökkentett feldolgozási idő: A szonda típusú ultrahangos készülék által szállított energia erősen koncentrált és lokalizált, ami gyors és hatékony sejtlízishez vezet. Más módszerekhez képest, mint például a gyöngyverés vagy az enzimatikus lízis, az ultrahangos kezelés perceken vagy akár másodperceken belül elérheti az E. coli lízist. Míg sok alternatív technika, mint például a fagyasztás-felolvasztás több fordulós kezelést igényel, az ultrahangos lízis egyetlen folyamatlépésben nyitja meg a sejteket.
  • Hőmérséklet-szabályozás: A legmodernebb ultrahangos készülékek hőmérséklet-érzékelőkkel és intelligens szoftverekkel vannak felszerelve, amelyek lehetővé teszik a maximális folyamathőmérséklet beállítását. Az ultrahangos készülék automatikusan szünetel, amikor eléri a hőmérsékleti határértéket, és elindítja az ultrahangos folyamatot, amikor elér egy beállított hőmérsékleti pontot. A minták jégfürdőben történő hűtése egyszerű módszer a minta hőmérsékletének alacsonyan tartására és a hő okozta lebomlás megelőzésére.
  • Méretezhetőség: A szonda típusú ultrahangos készülékek különböző méretekben kaphatók, a kézi eszközöktől a nagyszabású ipari modellekig. Ez alkalmassá teszi őket kis mennyiségek laboratóriumi feldolgozására vagy nagyobb biofeldolgozási alkalmazásokra, például vakcinagyártásra vagy molekulák bioszintézisére.
  • Sokoldalúság: Az ultrahangos készülékek különböző alkalmazásokhoz használhatók a sejtlízisen túl, mint például a DNS-nyírás, a fehérje extrakció, a szövethomogenizálás, a nanorészecske diszperzió, és az emulgeálás. Ezért a szonda típusú ultrahangos készülékbe történő befektetés sokoldalúságot biztosít a kutatási vagy ipari környezetben.
  • A szonda típusú ultrahangos készülékek, mint például a UP200St megbízható szövethomogenizátorok és sejttörők, ezért széles körben használják a minta előkészítéséhez a genetikában, pl. E.coli lízishez

    Az E.coli sejtekből történő fehérjekivonást hatékonyan végezzük a ultrahangos szonda UP200St

    A szonda típusú ultrahangos készülék számos előnnyel jár az E. coli lízis számára. Az ultrahangos folyamatparaméterek megbízható és pontos ellenőrzése lehetővé teszi a működési paraméterek, például a teljesítmény, az időtartam és a mintakezelés optimalizálását a kívánt eredmények elérése érdekében.
     

    Információkérés




    Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


     

    Ez a bemutató elmagyarázza, hogy milyen típusú szonikátor a legjobb a mintaelőkészítési feladatokhoz, például lízishez, sejtzavarokhoz, fehérjeizoláláshoz, DNS és RNS fragmentációhoz laboratóriumokban, elemzésben és kutatásban. Válassza ki az ideális szonikátor típust az alkalmazáshoz, a minta térfogatához, a minta számához és az áteresztőképességhez. A Hielscher Ultrasonics ideális ultrahangos homogenizátorral rendelkezik az Ön számára!

    Hogyan találjuk meg a tökéletes szonikátort a sejtek megzavarásához és a fehérje extrakcióhoz a tudományban és az elemzésben

    Videó indexképe

    Ultrahangos DNS fragmentáció gyakran használják mintaelőkészítési lépésként a következő generációs szekvenálásban (NGS)

    Az E. coli EDL933 genomi DNS-ének elektroforetikus elemzése 0-15 perces ultrahangos kezelésnek van kitéve. L jelzi a DNS-létrát.
    (tanulmány és kép: ©Basselet et al. 2008)

    Sejtzavar ultrahangos kavitációval

    Az ultrahangos szonda típusú homogenizátorok kb. 20 000 ciklus másodpercenként (20kHz-en), és kavitációt okoznak folyadékokban vagy szuszpenziókban. Akusztikus kavitáció vákuumszerű nyomások és magas hőmérsékletek mikroszkopikus területei, amelyek szétszakítják a sejteket. Bár a hőmérséklet elérheti a több ezer Celsius fokot, a kavitációs térfogatok olyan kicsiek, hogy nem melegítik jelentősen a folyamatot. Az ultrahang által generált akusztikus kavitáció és nyíróerők perforálják vagy megszakítják a baktériumsejtek, például az E.coli sejtmembránját. A Hielscher ultrahangos készülékek lehetővé teszik a folyamatparaméterek, például az ultrahangos intenzitás, amplitúdó, energiabevitel és hőmérséklet pontos szabályozását. Ezáltal az ultrahangos lízis folyamat optimálisan beállítható a sejttípushoz, a sejtkultúrához és a folyamat céljához.
     

    Előnyei Ultrahangos lízis

    • pontos szabályozása lízis (intenzitás, amplitúdó, hőmérséklet)
    • Megbízható, reprodukálható eredmények
    • optimális alkalmazkodás a különleges mintákat
    • hőmérséklet-szabályozás
    • A nagyon kis, hogy nagyon nagy a mintákat (ni, hogy liter)
    • Tisztán mechanikai kezelés
    • felhasználóbarát, biztonságos működés
    • lineáris skála felfelé a laborban termelési
    Az ultrahangos készülék VialTweeter lehetővé teszi egyidejű minta előállítására legfeljebb 10 fiolákban ugyanolyan eljárási körülmények között. (Kattints a kinagyításhoz!)

    VialTweeter ultrahangos lízis

    Információkérés




    Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


    Ultrahangos homogenizátor vs más lízis technikák

    Míg a kémiai és enzimatikus lízis problémás lehet – mivel kémiai lízis is megváltoztathatja a fehérje szerkezetét és bevezetni tisztítási problémák és enzimatikus lízis igényel hosszú inkubációs idők és nem reprodukálható – ultrahangos feltárása egy kifinomult, gyors sejtroncsolási módszer.
    Az ultrahangos lízis csak mechanikai erőkön alapul. Nem adnak hozzá vegyi anyagokat, az szonikálás nyíróerőkkel megszakítja a sejtfalat. A kémiai lízis megváltoztathatja a fehérje szerkezetét és tisztítási problémákat okozhat. Az enzimatikus zavarok hosszú inkubációs időt igényelnek, és nem reprodukálhatók. Az E.coli baktériumsejtek ultrahangos sejtzavarása gyors, egyszerű, megbízható és reprodukálható. Ezért használják a Hielscher ultrasonicatorokat a biológiai és biokémiai laboratóriumokban szerte a világon a minta előkészítéséhez, pre-ananlytics, in vitro diagonstics és sokrétű vizsgálatokhoz.

    Általános ajánlások az ultrahangos lízishez

    Az ultrahangos kezelés a legnépszerűbb eljárás lizálás nagyon kicsi, közepes és nagy mennyiségű sejt szuszpenzió – Pico-liter legfeljebb 100L / óra (ultrahangos áramlási cella). A sejteket lizáljuk, a folyékony nyírás és kavitáció. A DNS is nyírt Az ultrahangos kezelés során, ezért nem szükséges DNáz hozzáadása a sejtszuszpenzióhoz.
     

    Hőmérséklet-szabályozás ultrahangos E.coli lízis során
    Ultrahangos sejtromboló UP100H (100W) sejtzavarhoz és növényi vegyületek kivonásához.By előhűtés a minta és tartása során a mintában szonikálással jégen, minta termikus bomlása a minta könnyen megelőzhető.
    Ideális esetben a mintákat jéghidegen kell tartani a lízis során, de a legtöbb minta esetében elegendő, ha a hőmérséklet nem emelkedik a tenyészet vagy a szövetforrás hőmérséklete fölé. Ezért ajánlott, hogy tartsa a szuszpenziót jégen, és szonikálni több rövid ultrahangos impulzusok 5-10 másodperc és szünetek 10-30 másodperc. A szünetek alatt a hő eloszlathat az alacsony hőmérséklet helyreállítása érdekében. Nagyobb cellamintákhoz különböző hűtőköpenyes áramlási cellás reaktorok állnak rendelkezésre.
    Olvassa el itt részletes tippeket és ajánlásokat a sikeres ultrahangos lízishez!

    Protokollok az E. coli lizátumok ultrahangos előállításához

    A kutatók Hielscher ultrahangos homogenizátorokat használnak az E.coli sejtek megzavarására. Az alábbiakban különböző tesztelt és bevált protokollokat talál az E.coli lízishez Hielscher ultrahangos homogenizátorokkal különböző E. coli-val kapcsolatos alkalmazásokhoz.
     

    Ez a videoklip a Hielscher ultrahangos homogenizátor UP100H, egy ultrahangos készülék, amelyet széles körben használnak a laboratóriumi minták előkészítéséhez.

    Ultrahangos homogenizátor UP100H

    Videó indexképe

    Sejtnövekedés, E. coli sejtkivonatok térhálósítása és előkészítése ultrahanggal

    A SeqA és RNS-polimeráz chip Chip E. coli MG1655 vagy MG1655 ΔseqA on növesztettük 37 ° C-on OD600 (0,1%) 50 ml LB-ben (+ 0,2% glükóz), mielőtt 27 μl formaldehidet (37%) ml tápközegben hozzáadtunk (végkoncentráció 1%). A keresztkötést lassú rázás közben (100 rpm) szobahőmérsékleten 20 percen keresztül végeztük, amit 10 ml 2,5 M glicinnel (végső koncentráció 0,5 M) leállítottunk. Hő-sokk kísérletekben az E. coli MG1655-et 65 ml LB tápközegben 30 ° C-on tenyésztettük OD-be600 körülbelül 0,3. Ezt követően 30 ml tenyészetet átvittünk egy 43 °C-ra előmelegített lombikba, a maradékot pedig 30 °C-on tároltuk. A térhálósítás és a kioltás a fent leírtak szerint történt, azzal a különbséggel, hogy a sejteket 5 percig 30 vagy 43 °C-on tartották, mielőtt szobahőmérsékleten további lassú rázást végeztek volna. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, és kétszer hideg TBS-sel (pH7,5) mostuk. 1 ml lízispufferben (10 mM Tris (pH 8,0), 20% szacharózban, 50 mM NaCl-ban, 10 mM EDTA-ban, 10 mg / ml lizozimban történő reszuszpendálás és 37 ° C-on 30 percig történő inkubálás után, majd 4 ml IP puffer hozzáadásával, a sejteket jégen ultrahanggal ultrahangoztuk 12-szer 30 másodperc és 30 másodperces szünetek a Hielscher ultrahangos processzor UP400St 100% -os teljesítménybeállítással. 9000 g-n 10 percig tartó centrifugálás után a felülúszó 800 μl aliquot részét -20 °C-on tároltuk. (Waldminghaus 2010)
     

    Az enzimek túltermelése és tisztítása ultrahangos szondával

    Ultrasonicator UP100H egy laboratóriumi homogenizáló, amelyet gyakran használnak sejttenyésztő lemezek minta előkészítéséhez.A dekahisztidin (His10) címkével ellátott fehérjék túltermelése miatt az E. coli BL21(DE3) pET19b konstrukciókkal transzformálódott. Egy éjszakán át tartó prekultúrát centrifugálással gyűjtöttünk be, és 1% -ot használtunk egy expressziós kultúra beoltására. A pET19mgtB-t hordozó sejteket 22°C-on tenyésztettük, amíg az optikai sűrűség 600 nm-en (OD600) 0,7 volt. A tenyészetet 17 °C-ra vittük át, és 100 μM IPTG-vel indukáltuk. 16 óra elteltével a tenyészetet centrifugálással 7 500 × g-n 4 °C-on gyűjtöttük be. A sejteket 50 mM-os foszfátpufferes sóoldatban (PBS) szuszpendálták 0,3 M NaCl-val pH 7,4-en, és ultrahanggal megszakították egy S2 mikro-csúcs sonotroddal a Hielscher ultrasonicatorban UP200St 0,5 ciklusban és 75% amplitúdóval.
    A túltermelés decahistidine-címkézett GtfC indukáltuk 37 ° C-on OD600 0,6 100 uM IPTG. A sejteket ezután 4 órán át, a sejteket összegyűjtöttük és lizáltuk a fenti a MgtB.
    A nyers sejtkivonatokat 15 000 × g és 4 ° C hőmérsékleten centrifugálták, hogy leültessék a sejttörmeléket. A tisztított kivonatokat 1 ml-es HisTrap FF nyersolaj oszlopokra töltöttük ÄKTAprime Plus rendszer segítségével. Az enzimeket a gyártó His-címkével ellátott fehérjék gradiens elúciójára vonatkozó protokollja szerint tisztítottuk. Az eluált fehérjeoldatokat kétszer dializáltuk 1000 térfogatrész 50 mM PBS-sel szemben, pH 7,4, 0,3 M NaCl-lal szemben 4°C-on. A tisztítást 12% SDS-PAGE elemezte. A fehérje koncentrációját Bradford-módszerrel határoztuk meg Roti-Quant alkalmazásával. (Rabausch et al. 2013)
     

    Fehérje ultrahangos extrakciója E. coli baktériumokból
    A csalétek a számunkra érdekes fehérje (ebben az esetben, MTV1 Arabidopsis thaliana) van fuzionálva egy GST tag és BL21 Escherichia coli (E. coli) sejtek.

    1. Vegyünk egy pelletet GST-MTV1-ből és GST-ből (ami 50 ml baktériumtenyészetnek felel meg), és szuszpendáljuk újra mindegyiket 2,5 ml jéghideg extrakciós pufferben.
    2. Használjon ultrahangos készüléket UP100H (MS3 mikrotip-sonotroddal felszerelve kis mennyiségekhez kb. 2-5 ml), hogy megzavarja a baktériumsejteket, amíg lizálódnak, amit a csökkent opacitás és a megnövekedett viszkozitás jelez. Ezt jégen kell elvégezni, és ajánlott időközönként szonikálni (pl. 10 másodperces szonikálás, majd 10 másodperces szünet jégen és így tovább). Ügyelni kell arra, hogy ne szonikáljon túl nagy intenzitással. Ha habzást vagy fehér csapadék képződését észlelik, az intenzitást csökkenteni kell.
    3. Vigyük át a lizált baktériumoldatot 1,5 ml-es mikrocentrifugacsövekbe, és centrifugáljuk 4 °C-on, 16 000 × g hőmérsékleten 20 percig.

     

    Az ultrahangos szondák az akusztikus kavitáció erőit használják a sejtek megzavarására és a molekulák és a DNS kivonására E.coli.

    Szonda típusú ultrahangos készülékek, például a UP400St használja az akusztikus kavitáció működési elvét az E.coli hatékony líziséhez.

    A rekombináns fehérje expressziós elemzése és tisztítása szonikálással

    Az E. coli pelletet ultrahanggal ultrahangosították UP100H. Ebből a célból a sejtpelletet hűtött lízispufferben (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) szuszpendálták, és jégen 10 percig hűtötték. Ezután a sejtszuszpenziót 10 rövid, 10 másodperces sorozatokkal ultrahanggal ultrahangoztuk, majd 30 másodperces intervallumot követtünk a hűtéshez. Végül a cellatörmeléket ultracentrifugálással távolították el 4 °C-on 15 percig 14000 fordulat / perc sebességgel. Az rPR expresszió megerősítésére a felülúszót 12%-os poliakrilamid gélen futtattuk, és SDS-PAGE és Western blot módszerrel elemeztük. Az rPR tisztítását Ni2+-NTA gyantával (Invitrogen, USA) végeztük a gyártói útmutató szerint. Ebben a szakaszban natív tisztítási módszert alkalmaztunk. A tisztított fehérje tisztaságát elektroforézissel mértük fel a 12%-os poliakrilamid gélen, majd ezt követően Coomassie kékfestéssel. A tisztított fehérje koncentrációját Micro BCA fehérje vizsgálati készlettel (PIERCE, USA) mértük. (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Ez a videó a 200 wattos ultrahangos cuphorn-t mutatja laboratóriumi minták diszpergálására, homogenizálására, kivonására vagy gáztalanítására.

    Ultrahangos cuphorn (200 watt)

    Videó indexképe

    Ultrahangos homogenizátorok E. coli lízishez

    A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat tervez, gyárt és szállít az E. coli baktériumok és más sejttípusok, szövetek és sejtkultúrák megbízható és hatékony líziséhez.
    Az ultrahangos szondák széles portfóliója, valamint a közvetett szonikációs rendszerek lehetővé teszik számunkra, hogy ideális ultrahangos szövethomogenizátort kínáljunk Önnek a sejtzavarokhoz és az extrakciós alkalmazáshoz.

    Tervezés, gyártás és tanácsadás – Minőség Németországban

    A Hielscher ultrasonicators távolról vezérelhető a böngésző vezérlésén keresztül. Az ultrahangos paraméterek pontosan nyomon követhetők és beállíthatók a folyamat követelményeihez.A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. Intelligens szoftver, intuitív menü, programozható beállítások és automatikus adatprotokollálás csak néhány jellemzője a Hielscher ultrasonicators. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását a kutatási és biotechnológiai létesítményekbe. Még a durva körülmények és az igényes környezetek is könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.

    A Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre, amelyek a legmodernebb technológiával és felhasználóbarátsággal rendelkeznek. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilisek és megfelelnek az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

    Az alábbi táblázat az ultrahangos készülékek hozzávetőleges feldolgozási kapacitását jelzi:

    Kötegelt mennyiség Áramlási sebesség Ajánlott eszközök
    többkútos / mikrotiteres lemezek na UIP400MTP
    CupHorn injekciós üvegekhez vagy főzőpohárhoz na Ultrahangos cuphorn
    ultrahangos mikro-flow reaktor na GDmini2
    legfeljebb 10 injekciós üveg 0,5-1,5 ml na VialTweeter
    00,5-1,5 ml na VialTweeter
    1 - 500 ml 10-200 ml / perc UP100H
    10-2000 ml 20-400 ml / perc Uf200 ः t, UP400St
    0.1-20L 02 - 4 L / perc UIP2000hdT
    10-100 liter 2 - 10 l / perc UIP4000
    na 10 - 100 l / perc UIP16000
    na nagyobb klaszter UIP16000

    Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!

    Kérjen bővebb információt

    Kérjük, használja az alábbi űrlapot, hogy további információkat kérjen az ultrahangos szövethomogenizátorokról és sejttörőkről, lízis alkalmazások és árak. Örömmel megvitatjuk Önnel a folyamatot, és kínálunk Önnek egy ultrahangos homogenizátort, amely megfelel az Ön igényeinek!









    Kérjük, vegye figyelembe Adatvédelmi irányelvek.


    A videó bemutatja az ultrahangos mintaelőkészítő rendszert UIP400MTP, amely lehetővé teszi bármely szabványos többkútlemez megbízható minta előkészítését nagy intenzitású ultrahanggal. Az UIP400MTP tipikus alkalmazásai közé tartozik a sejtlízis, a DNS, az RNS és a kromatin nyírása, valamint a fehérje extrakció.

    Ultrasonicator UIP400MTP több kútlemezes ultrahangos kezeléshez

    Videó indexképe

    További protokollok ultrahangos E. coli lízishez

    Allicinnel módosított fehérjék E. coli-ban ultrahangos VialTweeter használatával

    VialTweeter az ultrahangos processzor UP200STMeghatározása A szulfhidril tartalmának 5,5'-ditio-bisz (2-nitro-benzoesav) (DTNB) Assay
    Egy E. coli MG1655 éjszakai kultúrát használtunk a MOPS minimális táptalaj (1:100) beoltására. A tenyészetet aerob módon termesztették, amíg el nem érték a 0,4-es A600-at. A tenyészetet három 15 ml-es tenyészetre osztottuk stresszkezelés céljából. A kezeletlen kultúra negatív kontrollként szolgált. 0,79 mM allicint (128 μg ml-1) vagy 1 mM diamidot adtunk a fennmaradó két tenyészet egyikéhez. A tenyészeteket 15 percig inkubáltuk. Minden tenyészetből 5 ml-t centrifugálással gyűjtöttünk be (8,525 × g, 4°C, 10 perc). A sejteket kétszer átmostuk 1 ml PBS-sel (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, használat előtt anaerob módon tároltuk) és centrifugáltuk (13 000 × g, 4°C, 10 perc). A sejteket újra szuszpendálták lízispufferben (PBS 6 mM guanidinium-HCl-lel, pH 7,4), mielőtt 4 ° C-on ultrahanggal (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Németország) (3 × 1 perc). A sejttörmeléket centrifugálással pelletáltuk (13 000 × g, 4 °C, 15 perc). A felülúszót egy mágneses keverőrúddal ellátott 3,5 ml-es QS-makróküvettába (10 mm) helyeztük át, és 1 ml lízispufferrel kevertük össze. A minták kihalását 412 nm-en figyeltük meg egy Jasco V-650 spektrofotométerrel, amely PSC-718 hőmérséklet-szabályozott cellatartóval volt felszerelve szobahőmérsékleten. 100 μl 3 mM ditiobisz(2-nitrobenzoesav) oldatot adtunk hozzá. A kihalást addig figyelték, amíg el nem érte a telítettséget. A tiolkoncentráció kiszámítását a ε kioltási együttható segítségével végeztük412 = 13 700 M-1 Cm-1 a tio-2-nitro-benzoesav (TNB). Cellular tiol koncentrációk alapján számítottuk térfogatú E. coli sejtek 6,7 × 10-15 liter és A600 = 0,5 cellasűrűség (1 × 10-nek felel meg8 sejtek ml-1 kultúra). (Müller et al. 2016)
     

    In vivo glutation meghatározás ultrahangos cellatörővel

    Az E.coli MG1655-öt MOPS minimális táptalajban termesztettük 200 ml össztérfogatban, amíg el nem érték a 0,5-ös A600-at. A tenyészetet stresszkezelés céljából 50 ml-es tenyészetekre osztottuk. 15 perc 0,79 mM allicinnel, 1 mM diamiddal vagy dimetil-szulfoxiddal (kontroll) végzett inkubálás után a sejteket 4000 g-on 4 °C-on 10 percig gyűjtöttük. A sejteket kétszer átmostuk KPE pufferrel, mielőtt a pelleteket 700 μl KPE pufferben reszuszpendáltuk. A deproteinációhoz 300l 10% (tömeg / v) szulfoszalicilsavat adtunk hozzá a sejtek ultrahangos kezeléssel történő megszakítása előtt (3 x 1 perc; VialTweeter ultraszonizáló). A felülúszókat összegyűjtöttük, centrifugálás után (30 perc, 13,000g, 4 ° C). Sulfosalicylic sav koncentrációt csökkent 1% hozzáadásával 3 térfogatrész KPE pufferben. Mérését az összes glutation és GSSG végeztük a fent leírtak szerint. Cellular glutation koncentrációk alapján számítottuk térfogatú E. coli sejtek 6,7×10-15 liter és a cellasűrűség A600 0,5 (egyenértékű 1×108 sejtek ml-1 kultúra). GSH koncentrációt számítjuk ki, kivonva 2 [GSSG] a teljes glutation. (Müller et al. 2016)

    Az emberi mAspAT expressziója E. coli-ban ultrahangos homogenizátorral

    Ultrahangos sejtfeltáróval UP400St (400W) kitermeléséhez intracelluláris anyag (például fehérjék, organellumok, DNS, RNS stb)Az egyetlen telepet E. coli BL21 (DE3) az expressziós vektort hordozó 30 ml Luria-Bertani (LB) tápközegben, amely 100 ng / ml ampicillin, majd tenyésztjük 37ºC amíg az optikai sűrűség (OD600) Elérte a 0,6. A sejteket centrifugálással nyerjük ki 4000 g-n 10 percig, és újra szuszpendáljuk 3L friss LB tápközegben, amely 100 ug / ml ampicillint.
    Ezt követően fehérjeexpressziót indukáltunk 1 mM izopropil-β-ᴅ-1-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) 20 órán keresztül 16 ° C-on. A sejteket centrifugálással 8000 × g-on 15 percig gyűjtöttük, és A pufferrel (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) mostuk. Körülbelül 45 g (nedves tömegű) sejteket nyertünk 3 literes tenyészetből. Centrifugálás után a sejtpelleteket 40 ml (1 L tenyészethez) jéghideg extrakciós pufferben szuszpendáltuk A, és jéghideg hőmérsékleten ultrahanggal lizáltuk a Hielscher ultrahangos cellatörővel UP400St. A sejtlízist 12 000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig, hogy elválasszuk az oldható (felülúszó) és a kicsapódott (pellet) frakciókat. (Jiang et al. 2015)
     



    Tudni érdemes

    E. coli

    Az Escherichia coli (Escherichia coli) Gram-negatív, fakultatívan anaerob, rúd alakú, coliform baktérium az Escherichia nemzetségben, amely gyakran megtalálható a melegvérű organizmusok alsó vékonybélében (endotermek). Számos E. coli törzs (vagy altípus) létezik, amelyek különböző tulajdonságokkal rendelkeznek. A legtöbb E. coli törzs emberre ártalmatlan, pl. B és K-12 törzsek, amelyeket általában laboratóriumi kutatási alkalmazásokhoz használnak. Egyes törzsek azonban károsak és súlyos betegséget okozhatnak.
    E. coli fontos szerepet játszik a modern biológiai mérnöki és ipari mikrobiológia, mivel a baktériumok könnyen manipulálni. Gyakori laboratóriumi alkalmazásokhoz, amelyek során gyakran E. coli használatát, például hogy hozzon létre a rekombináns dezoxiribonukleinsav (DNS), valamint, hogy egy modell organizmusban.
    E. coli egy nagyon sokoldalú host a heterológ fehérjék termelésére, és sokrétű fehérje expressziós rendszerek állnak rendelkezésre, hogy készítsen a rekombináns proteinek E. coliban. Plazmidok alkalmazásával, amelyek lehetővé teszik a magas szintű expresszióját fehérje, géneket építhetünk be a baktériumok, amely lehetővé teszi ilyen fehérjék nagy mennyiségben az ipari fermentációs folyamatokban.
    Az E.coli-t sejtgyárakként használják inzulin előállítására. További alkalmazások közé tartozik a módosított E. coli sejtek felhasználása vakcinák és immobilizált enzimek kifejlesztésére és előállítására, bioüzemanyagok előállítására, valamint bioremediációra.
    A K-12 törzs a mutáns formáját E. coli, hogy a túlzott enzimet expresszáló alkalikus foszfatáz (ALP). Ez a mutáció előfordul miatt egy hibás az a gén, amely folyamatosan enzimet kódolja. Ha egy gén egy olyan terméket eredményez nélkül gátlását ez az úgynevezett konstitutív aktivitást. Ez a specifikus mutáns formája használják izolálására és tisztítására a ALP enzimhez.
    Az E. coli baktériumokat széles körben használják sejtgyárként is. A mesterséges mikrobák (pl. baktériumok) és növényi sejtek úgynevezett sejtgyárakként használhatók. Ezek a genetikailag módosított sejtek molekulákat, vegyi anyagokat, polimereket, fehérjéket és egyéb anyagokat termelnek, amelyeket például a gyógyszeriparban, az élelmiszeriparban és a vegyiparban használnak. Annak érdekében, hogy felszabadítsa az ilyen biomérnöki sejtek belsejében termelt molekulákat, az ultrahangos lízis gyakori módszer a sejtfalak megzavarására és a célanyagoknak a környező folyadékba történő átvitelére. Tudjon meg többet a biomérnöki sejtek líziséről!

    Ultrahangos DNS nyírása

    Az ultrahangos nyíróerők általánosan használt módszer a molekulák, organellák és fehérjék felszabadítására a sejt belsejéből, valamint a DNS-szálak darabokra bontására. Az akusztikus kavitáció megtöri a sejtfalakat és a membránokat, hogy kivonja a DNS-t a sejtekből, és körülbelül 600 töredéket hozzon létre – 800 bp hosszúságú, ideális elemzésre.
    Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni ultrahangos homogenizers DNS fragmentáció!

    Irodalom / Referenciák


    Nagy teljesítményű ultrahangos! A Hielscher termékcsalád lefedi a teljes spektrumot a kompakt laboratóriumi ultrahangos készüléktől a pad-top egységeken át a teljes ipari ultrahangos rendszerekig.

    Hielscher Ultrahang gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok Labor nak nek ipari méretben.


    Örömmel megvitassuk a folyamatot.

    Lépjünk kapcsolatba.