Az E. coli ultrahangos lízise

Az E. coli baktériumok a mikrobiológiában és a biotechnológiában leggyakrabban használt baktériumok.
Az ultrahangos sejtfeltáró készülékek megbízható és reprodukálható eredményeket biztosítanak az E. coli líziséhez.
Az intenzív, mégis pontosan szabályozható kavitáció és nyíróerők teljes sejtfeltárást és nagy extrakciós hozamokat eredményeznek (pl. fehérjék, DNS).

Miért az ultrahangos sejtfeltárás az előnyben részesített módszer az E. coli esetében?

Az ultrahangos homogenizátorok vagy a szondás ultrahangos készülékek számos előnyt kínálnak az E. coli líziséhez, mivel az intenzív ultrahang hatékonyan feltárja a sejtfalakat és a membránokat. A szondás ultrahangos készülékeket az alábbi okokból használják széles körben az E. coli líziséhez:

A sejtfalak hatékony feltárása: Az E. coli peptidoglikánból álló, félmerev sejtfala hagyományos lízismódszerekkel nehezen bontható fel. A szondás ultrahangos készülék intenzív ultrahanghullámokat hoz létre, amelyek kavitációs buborékokat képeznek a sejteket körülvevő folyadékban. Amikor ezek a buborékok összeomlanak, nagy sebességű folyadéksugarakat és lökéshullámokat keltenek, amelyek mechanikusan feltárják a sejtfalakat, hatékonyan felszabadítva a sejttartalmat, például a biomolekulákat.

Fokozott behatolás: A szonda / szonotróda által keltett ultrahanghullámok mélyen behatolhatnak a mintába, több E. coli sejtet érhetnek el, és egyenletesen kezelhetik őket. Ez segít biztosítani, hogy a lízis az egész mintában egyenletesebb legyen, ami nagyobb sejtfeltárási hatékonyságot eredményez.

Rövidebb feldolgozási idő: A szondás ultrahangos készülék által közvetített energia erősen koncentrált és lokalizált, ami gyors és hatékony sejtlízist eredményez. Más módszerekhez, például a gyöngyös sejtfeltáráshoz vagy az enzimes lízishez képest az ultrahangos kezelés percek vagy akár másodpercek alatt is megvalósíthatja az E. coli lízisét. Míg számos alternatív eljárás, például a fagyasztás–felolvasztás több kezelési ciklust igényel, az ultrahangos lízis egyetlen folyamatlépésben nyitja fel a sejteket.

Hőmérséklet-szabályozás: A legkorszerűbb ultrahangos készülékek hőmérséklet-érzékelőkkel és intelligens szoftverrel rendelkeznek, amely lehetővé teszi a maximális folyamathőmérséklet beállítását. Az ultrahangos készülék automatikusan szünetelteti a működést a hőmérsékleti határérték elérésekor, és egy beállított hőmérsékleti érték elérésekor elindítja az ultrahangos kezelést. A minták jeges fürdőben történő hűtése egyszerű módszer a mintahőmérséklet alacsonyan tartására és a hő okozta mintakárosodás megelőzésére.

Méretnövelhetőség: A szondás ultrahangos készülékek különböző méretekben kaphatók, a kézi készülékektől a nagyüzemi ipari modellekig. Ez alkalmassá teszi őket kis térfogatok laboratóriumi feldolgozására vagy a feldolgozás nagyobb léptékű biotechnológiai alkalmazásokra történő kiterjesztésére, például vakcinagyártásra vagy molekulák bioszintézisére.

Sokoldalúság: Az ultrahangos készülékek a sejtlízisen túl számos alkalmazásra használhatók, például a DNS nyíróerőkkel történő fragmentálására, fehérjeextrakcióra, szövethomogenizálásra, nanorészecskék diszpergálására és emulgeálásra. Ezért egy szondás ultrahangos készülék beszerzése sokoldalú felhasználást biztosít kutatási vagy ipari környezetben.

A szondás ultrahangos készülékek, például az UP200St, megbízható szövethomogenizátorok és sejtfeltáró készülékek, ezért széles körben használják őket a genetikai minta-előkészítésben, például az E.coli líziséhez

Az E.coli sejtekből történő fehérjeextrakció hatékonyan végezhető az UP200St ultrahangos szondával

A szondás ultrahangos készülék számos előnyt kínál az E. coli líziséhez. Az ultrahangos folyamatparaméterek megbízható és pontos szabályozása lehetővé teszi az üzemi paraméterek, például a teljesítmény, az időtartam és a mintakezelés optimalizálását a kívánt eredmények eléréséhez.

Ez az útmutató bemutatja, melyik ultrahangos készüléktípus a legalkalmasabb az Ön minta-előkészítési feladataihoz, például lízishez, sejtfeltáráshoz, fehérjeizoláláshoz, valamint DNS- és RNS-fragmentáláshoz laboratóriumi, analitikai és kutatási munkák során. Válassza ki az alkalmazásának, a mintatérfogatnak, a mintaszámnak és a feldolgozási teljesítménynek megfelelő ultrahangos készüléktípust. A Hielscher Ultrasonics kínálatában megtalálja az Ön számára ideális ultrahangos homogenizátort!

Az ultrahangos DNS-fragmentálást gyakran használják minta-előkészítési lépésként az újgenerációs szekvenálásban (NGS)

Az E. coli EDL933 genomikus DNS-ének elektroforetikus elemzése 0 – 15 min ultrahangos kezelés után. Az L a DNS-létrát jelöli.
(tanulmány és kép: ©Basselet et al. 2008)

Sejtfeltárás ultrahangos kavitációval

A szondás ultrahangos homogenizátorok másodpercenként kb. 20 000 ciklussal működnek (20kHz frekvencián), és kavitációt okoznak folyadékokban vagy szuszpenziókban. Az akusztikus kavitáció vákuumszerű nyomású és magas hőmérsékletű mikroszkopikus térrészeket hoz létre, amelyek szétszakítják a sejteket. Bár a hőmérséklet elérheti a több ezer Celsius-fokot, a kavitációs térrészek olyan kicsik, hogy nem melegítik fel jelentősen a feldolgozott anyagot. Az ultrahang által keltett akusztikus kavitáció és nyíróerők átlyukasztják vagy felszakítják a baktériumsejtek, például az E.coli sejtmembránját. A Hielscher ultrahangos készülékei lehetővé teszik a folyamatparaméterek, például az ultrahang-intenzitás, az amplitúdó, az energiabevitel és a hőmérséklet pontos szabályozását. Így az ultrahangos lízis folyamata optimálisan igazítható a sejttípushoz, a sejttenyészethez és a folyamat céljához.

Az ultrahangos lízis előnyei

a lízis pontos szabályozása (intenzitás, amplitúdó, hőmérséklet)
megbízható, reprodukálható eredmények
optimális igazítás az adott mintákhoz
hőmérséklet-szabályozás
nagyon kis és nagyon nagy mintákhoz egyaránt (µL-től literig)
tisztán mechanikai kezelés
felhasználóbarát, biztonságos működés
lineáris méretnövelés a laboratóriumtól a gyártásig

A VialTweeter ultrahangos készülék legfeljebb 10 fiola egyidejű minta-előkészítését teszi lehetővé azonos folyamatkörülmények között. (Kattintson a nagyításhoz!)

VialTweeter ultrahangos lízishez

Ultrahangos homogenizátor és más lízistechnikák összehasonlítása

Míg a kémiai és enzimes lízis problémás lehet – mivel a kémiai lízis megváltoztathatja a fehérjeszerkezeteket és tisztítási problémákat okozhat, az enzimes lízis pedig hosszú inkubációs időt igényel és nem reprodukálható –, az ultrahangos feltárás kifinomult, gyors sejtfeltárási módszer.
Az ultrahangos lízis kizárólag mechanikai erőkön alapul. Nem adnak hozzá vegyszereket; az ultrahangos kezelés nyíróerőkkel bontja fel a sejtfalat. A kémiai lízis megváltoztathatja a fehérjék szerkezetét és tisztítási problémákat okozhat. Az enzimes feltárás hosszú inkubációs időt igényel és nem reprodukálható. Az E.coli baktériumsejtek ultrahangos sejtfeltárása gyors, egyszerű, megbízható és reprodukálható. Ezért használják a Hielscher ultrahangos készülékeit világszerte biológiai és biokémiai laboratóriumokban minta-előkészítésre, preanalitikai munkára, in vitro diagnosztikára és számos vizsgálatra.

Általános ajánlások az ultrahangos lízishez

Az ultrahangos kezelés a legnépszerűbb technika nagyon kis, közepes és nagy mennyiségű sejtszuszpenzió líziséhez – a pikoliterektől egészen 100L/hr értékig (ultrahangos átfolyó cella használatával). A sejteket a folyadékban fellépő nyíróerők és a kavitáció lizálják. Az ultrahangos kezelés során a DNS is nyíróerők hatására fragmentálódik, ezért nem szükséges DNázt adni a sejtszuszpenzióhoz.

Hőmérséklet-szabályozás az E.coli ultrahangos lízise során
A minta előhűtésével és az ultrahangos kezelés során jégen tartásával könnyen megelőzhető a minta hő okozta károsodása.
Ideális esetben a mintákat a lízis során jéghidegen kell tartani, de a legtöbb minta esetében elegendő, ha a hőmérséklet nem emelkedik a kiindulási tenyészet vagy szövet hőmérséklete fölé. Ezért ajánlott a szuszpenziót jégen tartani, és több rövid, 5–10 sec időtartamú ultrahangos impulzussal kezelni, 10–30 sec szünetekkel. A szünetek alatt a hő elvezetődhet, így ismét alacsony hőmérséklet alakulhat ki. Nagyobb sejtmintákhoz különféle, hűtőköpennyel ellátott átfolyó cellás reaktorok állnak rendelkezésre.
Itt részletes tippeket és ajánlásokat olvashat a sikeres ultrahangos lízishez!

Protokollok E. coli lizátumok ultrahangos előállításához

A kutatók Hielscher ultrahangos homogenizátorokat használnak az E.coli sejtfeltárásához. Az alábbiakban különböző, tesztelt és bevált protokollokat találhat az E.coli Hielscher ultrahangos homogenizátorokkal végzett líziséhez, különféle E. coli-hoz kapcsolódó alkalmazásokban.

E. coli sejtek tenyésztése, keresztkötése és sejtkivonatainak előállítása ultrahanggal

A SeqA és az RNS-polimeráz ChIP-Chip vizsgálatához az E. coli MG1655 vagy MG1655 ΔseqA sejteket 37°C-on tenyésztették, amíg az OD₆₀₀ értéke elérte a körülbelül 0,15-öt, 50 ml LB-ben (+ 0,2% glükóz), majd a tápközeg minden ml-éhez 27 μl formaldehidet (37%) adtak (végső koncentráció: 1%). A keresztkötést lassú rázatás mellett (100 rpm), szobahőmérsékleten, 20 min időtartamig végezték, majd a reakciót 10 ml 2,5 M glicinnel állították le (végső koncentráció: 0,5 M). A hősokk-kísérletekhez az E. coli MG1655 sejteket 65 ml LB tápközegben, 30°C-on tenyésztették, amíg az OD₆₀₀ értéke elérte a körülbelül 0,3-at. Ezután 30 ml tenyészetet egy 43°C-ra előmelegített lombikba vittek át, a maradékot pedig 30°C-on tartották. A keresztkötést és a reakció leállítását a fent leírtak szerint végezték, azzal a különbséggel, hogy a sejteket 5 min időtartamig 30 vagy 43°C-on tartották, mielőtt szobahőmérsékleten további lassú rázatásnak vetették alá őket. A sejteket centrifugálással gyűjtötték össze, és kétszer mosták hideg TBS-sel (pH7.5). A sejteket 1 ml lízispufferben (10 mM Tris (pH 8,0), 20% szacharóz, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozim) újraszuszpendálták, majd 37°C-on, 30 min időtartamig inkubálták, és 4 ml IP-puffert adtak hozzájuk. Ezután a sejteket jégen, 12 alkalommal 30 sec időtartamig, 30 sec szünetekkel kezelték ultrahanggal, a Hielscher UP400St ultrahangos processzorral, 100%-os teljesítménybeállítás mellett. A 9000 g mellett, 10 min időtartamig végzett centrifugálás után a felülúszó 800 μl-es alikvotjait -20°C-on tárolták. (Waldminghaus 2010)

Enzimek túltermeltetése és tisztítása ultrahangos szondával

A dekahisztidin- (His10-) címkézett fehérjék túltermeltetéséhez az E. coli BL21(DE3) sejteket pET19b konstrukciókkal transzformálták. Egy éjszakán át tenyésztett előtenyészetet centrifugálással gyűjtöttek össze, és 1%-át egy expressziós tenyészet beoltására használták. A pET19mgtB-t hordozó sejteket 22°C-on tenyésztették, amíg a 600 nm-en mért optikai denzitás (OD600) elérte a 0,7-et. A tenyészetet 17°C-ra helyezték át, és az expressziót 100 μM IPTG-vel indukálták. 16 h elteltével a tenyészet sejtjeit 7 500 × g mellett, 4°C-on végzett centrifugálással gyűjtötték össze. A sejteket 50 mM foszfátpufferelt sóoldatban (PBS), 0,3 M NaCl jelenlétében, pH 7,4 mellett újraszuszpendálták, és ultrahangos kezeléssel tárták fel, a Hielscher UP200St ultrahangos készülékhez csatlakoztatott S2 mikrohegyű szonotróda használatával, 0,5 ciklusbeállítással és 75%-os amplitúdóval.
A dekahisztidin-címkézett GtfC túltermeltetését 37°C-on indukálták, amikor az OD₆₀₀ értéke 0,6 volt, 100 μM IPTG-vel. A sejteket ezután 4 h időtartamig inkubálták, összegyűjtötték, és a fent, az MgtB esetében leírtak szerint lizálták.
A nyers sejtkivonatokat 15 000 × g mellett, 4°C-on centrifugálták a sejttörmelék ülepítéséhez. A derített kivonatokat egy ÄKTAprime Plus rendszerrel 1-ml térfogatú HisTrap FF Crude oszlopokra vitték fel. Az enzimeket a gyártó His-címkézett fehérjék gradienselúciójára vonatkozó protokollja szerint tisztították. Az eluált fehérjeoldatokat kétszer dializálták 1 000-szeres térfogatú 50 mM PBS-sel szemben, pH 7,4 mellett, 0,3 M NaCl jelenlétében, 4°C-on. A tisztítást 12%-os SDS-PAGE segítségével elemezték. A fehérjekoncentrációt Bradford-módszerrel, Roti-Quant használatával határozták meg. (Rabausch et al. 2013)

Fehérjék ultrahangos extrakciója E. coli baktériumokból
A vizsgált csali fehérjét (ebben az esetben az Arabidopsis thaliana MTV1 fehérjéjét) GST-címkével fuzionálják, és BL21 Escherichia coli (E. coli) sejtekben expresszáltatják.

Vegyen egy-egy GST-MTV1- és GST-pelletet (50 ml baktériumtenyészetnek megfelelő mennyiséget), és mindegyiket szuszpendálja újra 2,5 mL jéghideg extrakciós pufferben.
Használjon UP100H ultrahangos készüléket (a kis, kb. 2–5mL térfogatokhoz MS3 mikrohegyű szonotródával felszerelve) a baktériumsejtek feltárására, amíg azok lizálódnak; ezt az opacitás csökkenése és a viszkozitás növekedése jelzi. Ezt jégen kell végezni, és ajánlott szakaszos ultrahangos kezelést alkalmazni (pl. 10 sec ultrahangos kezelés, majd 10 sec szünet jégen, és így tovább). Ügyelni kell arra, hogy az ultrahangos kezelés intenzitása ne legyen túl nagy. Ha habzás vagy fehér csapadék képződése észlelhető, csökkenteni kell az intenzitást.
Vigye át a lizált baktériumok oldatát 1,5 mL-es mikrocentrifuga-csövekbe, és centrifugálja 4°C-on, 16 000 x g mellett, 20 min időtartamig.

Az ultrahangos szondák az akusztikus kavitáció erőit használják a sejtek feltárására, valamint molekulák és DNS E.coli-ból történő extrakciójára.

A szondás ultrahangos készülékek, például az UP400St, az akusztikus kavitáció működési elvét alkalmazzák az E.coli hatékony líziséhez.

Rekombináns fehérje expressziójának elemzése és tisztítása ultrahangos kezeléssel

Az E. coli pelletet a Hielscher UP100H ultrahangos készülékkel kezelték. Ehhez a sejtpelletet hűtött lízispufferben (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) újraszuszpendálták, és 10 min időtartamig jégen hűtötték. Ezután a sejtszuszpenziót 10 rövid, egyenként 10 s időtartamú ultrahangos impulzussal kezelték, amelyeket 30 s hűtési szünetek követtek. Végül a sejttörmeléket 4°C-on, 15 min időtartamig, 14 000 rpm mellett végzett ultracentrifugálással távolították el. Az rPR expressziójának igazolására a felülúszót 12%-os poliakrilamid gélen futtatták, és SDS-PAGE, valamint Western blot segítségével elemezték. Az rPR tisztítását Ni2+-NTA gyantával (Invitrogen, USA), a gyártói útmutató szerint végezték. Ebben a szakaszban natív tisztítási módszert alkalmaztak. A tisztított fehérje tisztaságát 12%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel és az azt követő Coomassie-kék festéssel értékelték. A tisztított fehérje koncentrációját Micro BCA fehérjevizsgálati készlettel (PIERCE, USA) mérték. (Azarnezhad et al. 2016)

Ez a videó a laboratóriumi minták diszpergálására, homogenizálására, extrakciójára vagy gáztalanítására szolgáló 200 wattos ultrahangos cuphorn készüléket mutatja be.

Ultrahangos homogenizátorok az E. coli líziséhez

A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat tervez, gyárt és szállít az E. coli baktériumok és más sejttípusok, szövetek és sejttenyészetek megbízható és hatékony líziséhez.
Az ultrahangos szondák és a közvetett ultrahangos kezelőrendszerek széles választéka lehetővé teszi, hogy az Ön sejtfeltárási és extrakciós alkalmazásához ideális ultrahangos szövethomogenizátort kínáljuk.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékei a legmagasabb minőségi és tervezési követelményszintjükről ismertek. Az intelligens szoftver, az intuitív menü, a programozható beállítások és az automatikus adatnaplózás csak néhány a Hielscher ultrahangos készülékeinek jellemzői közül. A robusztus felépítés és az egyszerű kezelés lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását kutatási és biotechnológiai létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékei még mostoha körülmények és nagy követelményeket támasztó környezetek mellett is könnyen helytállnak.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, és különös hangsúlyt fektet a legkorszerűbb technológiát és felhasználóbarát kezelést biztosító, nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre. Természetesen a Hielscher ultrahangos készülékei CE-megfelelőséggel rendelkeznek, és teljesítik az UL, CSA és RoHs követelményeit.

Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról:

Szakaszosan kezelt térfogat	Térfogatáram	Ajánlott készülékek
többlyukú / mikrotiterlemezek	n.a.	UIP400MTP
CupHorn fiolákhoz vagy főzőpohárhoz	n.a.	Ultrahangos CupHorn
ultrahangos mikro-átfolyóreaktor	n.a.	GDmini2
legfeljebb 10 fiola, egyenként 0,5–1,5mL térfogattal	n.a.	VialTweeter
0,5–1,5mL	n.a.	VialTweeter
1–500mL	10–200mL/min	UP100H
10–2000mL	20–400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1–20L	0,2–4L/min	UIP2000hdT
10–100L	2–10L/min	UIP4000
n.a.	10–100L/min	UIP16000
n.a.	nagyobb	csoportba rendezett UIP16000

Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezzen tőlünk!

A videó az UIP400MTP ultrahangos minta-előkészítő rendszert mutatja be, amely nagy intenzitású ultrahanggal bármely szabványos többlyukú lemezen megbízható minta-előkészítést tesz lehetővé. Az UIP400MTP tipikus alkalmazásai közé tartozik a sejtlízis, a DNS, az RNS és a kromatin nyírásos fragmentálása, valamint a fehérjeextrakció.

További protokollok az E. coli ultrahangos líziséhez

Allicinnel módosított fehérjék vizsgálata E. coli-ban ultrahangos VialTweeter használatával

A szulfhidrilcsoport-tartalom meghatározása 5,5′-ditiobisz(2-nitrobenzoesav) (DTNB) vizsgálattal
Egy éjszakán át tenyésztett E. coli MG1655 tenyészetet használtak MOPS minimál tápközeg beoltására (1:100). A tenyészetet aerob körülmények között növesztették, amíg az A600 értéke elérte a 0,4-et. A tenyészetet három 15-ml-es tenyészetre osztották a stresszkezeléshez. Egy kezeletlen tenyészet negatív kontrollként szolgált. A fennmaradó két tenyészet egyikéhez 0,79 mM allicint (128 μg ml-1), a másikhoz 1 mM diamidot adtak. A tenyészeteket 15 min időtartamig inkubálták. Mindegyik tenyészet 5 ml térfogatú részéből gyűjtötték össze a sejteket centrifugálással (8 525 × g, 4°C, 10 min). A sejteket kétszer mosták 1 ml PBS-sel (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, felhasználás előtt anaerob körülmények között tárolva), majd centrifugálták (13 000 × g, 4°C, 10 min). A sejteket lízispufferben (PBS 6 mM guanidinium HCl-dal, pH 7,4) újraszuszpendálták, majd 4°C-on ultrahangos kezeléssel feltárták (VialTweeter ultrahangos készülék, Hielscher GmbH, Németország) (3 × 1 min). A sejttörmeléket centrifugálással ülepítették (13 000 × g, 4 °C, 15 min). A felülúszót mágneses keverőrudat tartalmazó 3,5-ml-es QS-macro küvettába (10 mm) vitték át, és 1 ml lízispufferrel keverték össze. A minták abszorbanciáját 412 nm-en követték szobahőmérsékleten, PSC-718 hőmérséklet-szabályozott küvettatartóval felszerelt Jasco V-650 spektrofotométerrel. 100μl 3 mM ditiobisz(2-nitrobenzoesav)-oldatot adtak hozzá. Az abszorbanciát a telítési érték eléréséig követték. A tiolkoncentrációt a következő extinkciós együtthatóval számították ki: ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 a tio-2-nitrobenzoesavra (TNB) vonatkozóan. A sejten belüli tiolkoncentrációkat az E. coli sejtek 6,7 × 10^-15 literes térfogata és A600 = 0,5 sejtsűrűség alapján számították ki (ami 1 × 10⁸ sejt ml^-1 tenyészetnek felel meg). (Müller et al. 2016)

In vivo glutationmeghatározás ultrahangos sejtfeltáró készülékkel

Az E.coli MG1655 sejteket MOPS minimál tápközegben, összesen 200ml térfogatban tenyésztették, amíg az A600 értéke elérte a 0,5-öt. A tenyészetet 50-ml-es tenyészetekre osztották a stresszkezeléshez. 0,79 mM allicinnel, 1 mM diamiddal vagy dimetil-szulfoxiddal (kontroll) végzett 15 min inkubálás után a sejteket 4 000g mellett, 4°C-on, 10 min időtartamig végzett centrifugálással gyűjtötték össze. A sejteket kétszer mosták KPE-pufferrel, majd a pelleteket 700µl KPE-pufferben újraszuszpendálták. A fehérjementesítéshez 300l 10%-os (w/v) szulfoszalicilsavat adtak hozzá, majd a sejteket ultrahangos kezeléssel feltárták (3 x 1 min; VialTweeter ultrahangos készülék). A felülúszókat centrifugálás után gyűjtötték össze (30 min, 13 000g, 4°C). A szulfoszalicilsav koncentrációját 3 térfogatnyi KPE-puffer hozzáadásával 1%-ra csökkentették. Az összes glutation és a GSSG mérését a fent leírtak szerint végezték. A sejten belüli glutationkoncentrációkat az E. coli sejtek 6,7×10^-15 literes térfogata és A600 0,5 sejtsűrűség alapján számították ki (ami 1×10⁸ sejt ml^-1 tenyészetnek felel meg). A GSH-koncentrációkat úgy számították ki, hogy az összes glutation mennyiségéből kivonták a 2[GSSG] értékét. (Müller et al. 2016)

Humán mAspAT expressziója E. coli-ban ultrahangos homogenizátor használatával

Az expressziós vektort hordozó E. coli BL21 (DE3) egyetlen telepét 30 mL, 100μg/mL ampicillint tartalmazó Luria-Bertani (LB) tápközegbe helyezték, majd 37ºC-on tenyésztették, amíg az optikai denzitás (OD₆₀₀) elérte a 0,6-ot. A sejteket 4 000 × g mellett, 10 min időtartamig végzett centrifugálással gyűjtötték össze, majd 3L friss, 100μg/mL ampicillint tartalmazó LB tápközegben újraszuszpendálták.
Ezután a fehérjeexpressziót 1 mM izopropil-β-ᴅ-1-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukálták 20 h időtartamig, 16ºC-on. A sejteket 8 000 × g mellett, 15 min időtartamig végzett centrifugálással gyűjtötték össze, és A pufferrel (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) mosták. 3 L tenyészetből körülbelül 45g (nedves tömegű) sejtet nyertek. Centrifugálás után a sejtpelleteket 40 mL (1 L tenyészetre számítva) jéghideg A extrakciós pufferben újraszuszpendálták, és jéghideg hőmérsékleten, a Hielscher UP400St ultrahangos sejtfeltáró készülékkel végzett ultrahangos kezeléssel lizálták. A sejtlizátumot 12 000 rpm mellett, 15 min időtartamig centrifugálták az oldható (felülúszó) és a kicsapódott (pellet) frakciók elválasztására. (Jiang et al. 2015)

Kapcsolódó témák

Hasznos tudnivalók

E.coli

Az Escherichia coli (E. coli) az Escherichia nemzetségbe tartozó, Gram-negatív, fakultatív anaerob, pálcika alakú, koliform baktérium, amely gyakran megtalálható a melegvérű szervezetek (endotermák) bélrendszerének alsó szakaszában. Számos, eltérő tulajdonságokkal rendelkező E. coli törzs (vagy altípus) létezik. A legtöbb E. coli törzs ártalmatlan az emberre, például a B és K-12 törzsek, amelyeket gyakran használnak laboratóriumi kutatási alkalmazásokhoz. Egyes törzsek azonban károsak, és súlyos betegséget okozhatnak.
Az E. coli fontos szerepet játszik a modern biomérnöki tevékenységben és az ipari mikrobiológiában, mivel a baktérium könnyen manipulálható. Az E. coli-t gyakran használó, elterjedt laboratóriumi alkalmazások közé tartozik például a rekombináns dezoxiribonukleinsav (DNS) létrehozása vagy a modellszervezetként történő felhasználás.
Az E. coli igen sokoldalú gazdaszervezet heterológ fehérjék előállítására, és számos fehérjeexpressziós rendszer áll rendelkezésre rekombináns fehérjék E. coli-ban történő termeltetéséhez. A magas szintű fehérjeexpressziót lehetővé tevő plazmidok használatával gének juttathatók a baktériumokba, ami lehetővé teszi az ilyen fehérjék nagy mennyiségű előállítását ipari fermentációs folyamatokban.
Az E.coli-t sejtgyárként használják inzulin előállítására. További alkalmazások közé tartozik a módosított E. coli sejtek használata vakcinák és immobilizált enzimek fejlesztésére és előállítására, bioüzemanyagok előállítására, valamint bioremediációra.
A K-12 törzs az E. coli olyan mutáns formája, amely túlzott mértékben expresszálja az alkalikus foszfatáz (ALP) enzimet. Ez a mutáció az enzimet folyamatosan kódoló gén hibája miatt következik be. Ha egy gén mindenféle gátlás nélkül termel egy terméket, azt konstitutív aktivitásnak nevezik. Ezt a specifikus mutáns formát az ALP enzim izolálására és tisztítására használják.
Az E. coli baktériumokat sejtgyárként is széles körben használják. A mesterségesen módosított mikrobák (pl. baktériumok) és növényi sejtek úgynevezett sejtgyárként használhatók. Ezek a genetikailag módosított sejtek molekulákat, vegyi anyagokat, polimereket, fehérjéket és egyéb anyagokat termelnek, amelyeket például a gyógyszeriparban, az élelmiszeriparban és a vegyiparban használnak. Az ilyen biomérnöki úton módosított sejtek belsejében termelt molekulák felszabadítására az ultrahangos lízis elterjedt módszer: feltárja a sejtfalakat, és a célanyagokat a környező folyadékba juttatja. Olvasson többet a biomérnöki úton módosított sejtek líziséről!

A DNS ultrahangos fragmentálása nyíróerőkkel

Az ultrahangos nyíróerők alkalmazása elterjedt módszer a molekulák, sejtorganellumok és fehérjék sejtbelsőből történő felszabadítására, valamint a DNS-szálak feldarabolására. Az akusztikus kavitáció felbontja a sejtfalakat és a membránokat, hogy a sejtekből DNS-t nyerjen ki, és körülbelül 600 – 800 bp hosszúságú fragmentumokat hozzon létre, ami ideális az elemzéshez.
Kattintson ide, és tudjon meg többet a DNS-fragmentáláshoz használható ultrahangos homogenizátorokról!

Szakirodalom / Hivatkozások

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Nagy teljesítményű ultrahangtechnika! A Hielscher termékválasztéka a teljes spektrumot lefedi a kompakt laboratóriumi ultrahangos készülékektől az asztali készülékeken át a teljes ipari léptékű ultrahangos rendszerekig.

A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt a laboratóriumi mérettől az ipari méretig.