Hielscher ultrahang technológia

Ultrahangos lízisét E. Coli

  • E. coli baktériumokban a leggyakrabban használt baktériumok mikrobiológia és biotechnológia.
  • Ultrahangos sejt károsító megbízható és reprodukálható eredményeket a lízis E. coli.
  • Intenzív még pontosan vezérelhető a kavitáció és a nyíróerők eredményeznek teljes feltárására és a magas extrakciós hozammal (például fehérjéket, DNS-t).

Sejt feltárása Kavitáció

Escherichia coli baktérium megbízhatóan lizáljuk ultrahangos szöveti homogenizátorok.Ultrahangos szonda-típusú homogenizátorok működnek kb. 20.000 ciklus másodpercenként (a 20 kHz), és okozhat kavitáció folyadékokban vagy supsensions. Akusztikai kavitáció mikroszkopikus területeket a vákuum-szerű nyomáson és magas hőmérsékleten, hogy a szakadás sejtek egymástól. Bár a hőmérséklet elérheti a több ezer Celsius fok, kavitációs kötetek olyan kicsik, hogy ne melegítse a folyamat jelentősen. Az ultrahang keltett akusztikus kavitáció és a nyíróerők perforált vagy megtörni a sejtmembránon az E. coli – függően az eszköz beállítási az ultraszonikus homogenizálóval.

Előnyei Ultrahangos lízis

  • pontos szabályozása lízis (intenzitás, amplitúdó, hőmérséklet)
  • optimális alkalmazkodás a különleges mintákat
  • hőmérséklet-szabályozás
  • A nagyon kis, hogy nagyon nagy a mintákat (ni, hogy liter)
  • tiszta mechanikai kezelés
  • lineáris skála felfelé a laborban termelési
Az ultrahangos készülék VialTweeter lehetővé teszi egyidejű minta előállítására legfeljebb 10 fiolákban ugyanolyan eljárási körülmények között. (Kattints a kinagyításhoz!)

VialTweeter ultrahangos lízis

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


Míg kémiai és enzymtic lízis problémás lehet – mivel kémiai lízis is megváltoztathatja a fehérje szerkezetét és bevezetni tisztítási problémák és enzimatikus lízis igényel hosszú inkubációs idők és nem reprodukálható – ultrahangos feltárása egy kifinomult, gyors sejtroncsolási módszer.
Az ultrahangos lezis csak mechanikai erőkön alapul. Nem vegyi anyagokat adnak hozzá, szonikálás megtöri a sejtfal nyíró erők. Kémiai lezis megváltoztathatja fehérje szerkezetét, és vezessenek be tisztítási problémákat. Az enzimatikus zavar hosszú lappangási időt igényel, és nem reprodukálható. Ultrahangos sejt zavar e.coli baktériumsejtek gyors, egyszerű, megbízható és reprodukálható. Ezért Hielscher ultrasonicators használják a biológiai és biokémiai laboratóriumokban szerte a világon a minta előkészítése, pre-ananlytics, in vitro diagonstics és sokrétű vizsgálatok.

Általános ajánlások

UP400St ultraszonizáló áramlási reaktorbanAz ultrahangos kezelés a legnépszerűbb eljárás lizálás nagyon kicsi, közepes és nagy mennyiségű sejt szuszpenzió – Pico-liter legfeljebb 100L / óra (ultrahangos áramlási cella). A sejteket lizáljuk, a folyékony nyírás és kavitáció. A DNS is nyírt Az ultrahangos kezelés során, ezért nem szükséges DNáz hozzáadása a sejtszuszpenzióhoz.
Hőmérséklet-szabályozás:
By előhűtés a minta és tartása során a mintában szonikálással jégen, minta termikus bomlása a minta könnyen megelőzhető.
Ideális esetben a mintákat a lízis során jéghideg állapotban kell tartani, de a legtöbb minta esetében elegendő, ha a hőmérséklet nem emelkedik a tenyészet vagy a szövetforrás hőmérséklete fölé. Ezért ajánlott, hogy a felfüggesztés a jég és a ultrahangozza több rövid Ultrasonics impulzusok a 5-10 sec és szünetelteti a 10-30 sec. A szünetben, a hőt is eloszt annak érdekében, hogy újra létre alacsony hőmérsékleten. A nagyobb sejtminták, különböző áramlási sejt reaktorok hűtődzseki állnak rendelkezésre.

Protokollok A előállítása E. Coli lizátumok

Expressziós analízis és tisztítása rekombináns fehérje

Az E. coli sejtüledéket ultrahanggal kezeljük ultrahangos rendszerben UP100H (Hielscher). Ehhez a sejtpelletet újra felszuszpendáltuk hűtött lízispufferben (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) és jégen lehűtöttük 10 percig. Ezt követően a sejtszuszpenziót ultrahangos kezelésnek vetettük alá 10 rövid, 10 másodperces lökésszel, majd hűtés után 30 s-os intervallummal. Végül a sejtréteget ultracentrifugálással eltávolítottuk 4 ° C-on 15 percen át 14000 fordulat / perc sebességgel. Az rPR expresszió megerősítéséhez a felülúszót 12% poliakrilamid gélen futtattuk és SDS-PAGE és Western blottal analizáltuk. Az rPR tisztítását Ni felhasználásával végeztük2 +-NTA gyantát (Invitrogen, USA) a gyártó előírásai szerint útmutató. Ebben a szakaszban, a natív tisztítási módszert alkalmaztunk. A tisztaság a tisztított protein alkalmazásával értékeltük elektroforézissel a 12% -os poliakrilamid gélen, és az azt követő Coomassie-blue festéssel. A tisztított fehérje koncentrációját mértük Micro BCA fehérje esszé kit (Pierce, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrahangos sejtfeltáróval UP100H (100W) a lízis, sejtfeltárás és DNS nyírás.

Ultrahangos homogenizátor UP100H 100W

Cell Growth, keresztkötő és előállítása az E. coli sejtkivonatok

A SeqA és RNS-polimeráz chip Chip E. coli MG1655 vagy MG1655 ΔseqA on növesztettük 37 ° C-on OD600 (0,1%) 50 ml LB-ben (+ 0,2% glükóz), mielőtt 27 μl formaldehidet (37%) ml tápközegben hozzáadtunk (végkoncentráció 1%). A keresztkötést lassú rázás közben (100 rpm) szobahőmérsékleten 20 percen keresztül végeztük, amit 10 ml 2,5 M glicinnel (végső koncentráció 0,5 M) leállítottunk. Hő-sokk kísérletekben az E. coli MG1655-et 65 ml LB tápközegben 30 ° C-on tenyésztettük OD-be600 körülbelül 0,3. Ezután 30 ml tenyészetet előmelegített lombikba helyeztünk 43 ° C-on, a maradékot 30 ° C-on tartottuk. A keresztkötés és a kioltás a fent leírt módon történt, kivéve, hogy a sejteket 30 ° C vagy 43 ° C-on tartottuk 5 percig, mielőtt további lassú rázatás történt szobahőmérsékleten. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és kétszer hideg TBS-sel (pH = 7,5) mostuk. Miután újra szuszpendáltuk 1 ml lízispufferben (10 mM Tris (pH 8,0), 20% szacharóz, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) és inkubáltuk 37 ° C-on 30 percig, majd 4 ml IP pufferoldatot, a sejteket 12x30 másodpercig és 30 másodperces szünetekben ultrahanggal ultrahangosítottuk UP400St ultrahangos processzor (Hielscher Ultrasonics GmbH) 100% -os teljesítmény. Centrifugálás után 10 percen át 9000 g, 800 ul-es részleteit a felülúszót -20 ° C-on. (Waldminghaus 2010)

Túltermelés és tisztítása enzimek.

A túltermelés decahistidine (His10) -tagged fehérjék, E. coli BL21 (DE3) törzset transzformáltunk pET19b konstrukciók. Egy éjszakán át előtenyészetet centrifugálással összegyűjtöttük, és 1% beoltására használtuk Az expressziós tenyészetet. Hordozó sejteket pET19mgtB növesztettük 22 ° C-on, amíg az optikai sűrűség 600 nm-en (OD600) 0,7. A tenyészetet átvisszük 17 ° C és a által indukált 100 uM IPTG. 16 óra eltelte után, a tenyészetet centrifugálással nyerjük ki 7500 x g sebességgel 4 ° C-on. A sejteket újra felszuszpendáltuk 50 mM foszfát-pufferolt sóoldatban (PBS) 0,3 M NaCl pH = 7,4, és ultrahangos kezeléssel szétzúzzuk egy S2 mikro-tip sonotrode a UP200St ultraszonizáló (Hielscher, Teltow, Németország) egy ciklus 0,5 és amplitúdójú 75%.
A túltermelés decahistidine-címkézett GtfC indukáltuk 37 ° C-on OD600 0,6 100 uM IPTG. A sejteket ezután 4 órán át, a sejteket összegyűjtöttük és lizáltuk a fenti a MgtB.
A nyers sejtextraktumot centrifugáltuk 15000 x g-vel 4 ° C-on az üledék a sejttörmeléket. A derített extraktumokat felvittük 1-ml HisTrap FF Nyers oszlopok alkalmazásával ÄKTAprime Plus rendszer (GE Healthcare). Az enzimeket tisztítottuk, a gyártó protokollja a gradienselúciós His-jelölt fehérjék. Az eluált fehérjét addig dializáljuk, szemben kétszer 1000 térfogatnyi 50 mM PBS-ben, pH = 7,4, 0,3 M NaCl, 4 ° C-on. A tisztítást analizáltuk 12% -os SDS-PAGE. A fehérje koncentrációját határoztuk meg Bradford módszerrel Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Németország). (Rabausch et al. 2013)

Kivonása fehérje E. coli baktériumok
A csalétek a számunkra érdekes fehérje (ebben az esetben, MTV1 Arabidopsis thaliana) van fuzionálva egy GST tag és BL21 Escherichia coli (E. coli) sejtek.
1. Vegyünk egy pelletet a GST-MTV1 és GST (megfelel 50 ml baktérium kultúra), és újraszuszpendáljuk az egyes 2,5 ml jéghideg extrakciós pufferben.
2. Használjon ultraszonizálót UP100H (Felszerelt MS3 mikrotip-szonotróda kis mennyiségek (2-5mL)), hogy megzavarják a bakteriális sejteket, amíg azokat lizáltuk, amely jelzi csökken átlátszatlanság és a megnövekedett viszkozitás. Ezt kell elvégezni jégen, és ajánlott, hogy sonicate időközönként (például 10 mp szonikációs majd 10 másodpercig jégen, és így tovább). Ügyelni kell arra, hogy ne sonicate túl nagy intenzitással. Ha a habképződést és a fehér csapadékot észlel, az intenzitást kell csökkenteni.
3. Transzfer a lizált baktérium oldat 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövekbe és centrifugában, 4 ° C-on, 16000 x g, 20 perc.

Allicin módosított fehérjék E. coli-ban

A VialTweeter egy kényelmes ultraszonizálót kis minta homogenizálásaMeghatározása A szulfhidril tartalmának 5,5'-ditio-bisz (2-nitro-benzoesav) (DTNB) Assay
Egy E. coli MG1655 egyéjszakás tenyészettel oltunk MOPS minimál táptalajon (1: 100). A tenyészetet aerob amíg egy A600 0,4 eléréséig. A tenyészetet szét három 15 ml-es tenyészetekben a stressz kezelésére. Kezeletlen kultúra szolgált negatív kontrollként. 0,79 mM allicin (128 ng ml-1) Vagy 1 mM diamid adtunk egyik megmaradt két kultúra egyes. A tenyészeteket 15 percig inkubáljuk. 5 ml mindegyik tenyészetből centrifugálással kinyerjük (8525 × g, 4 ° C, 10 perc). A sejteket kétszer mossuk 1 ml PBS-ben (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2MSZH4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, anaerobikusan tárolva a felhasználás előtt) és centrifugáljuk (13 000 g, 4 ° C, 10 perc). A sejteket újraszuszpendáltuk lízispufferben (PBS 6 mM guanidinium-hidrogén-kloriddal (pH = 7,4) 4 ° C-on történő ultrahangosodás előtt (VialTweeter ultraszonizáló, Hielscher GmbH, Németország) (3 x 1 perc). A sejttörmeléket centrifugálással (13,000 x g, 4 ° C, 15 perc). A felülúszót átvittük egy 3,5 ml-es QS-makro küvettába (10 mm), amely mágneses keverővel, és összekeverjük 1 ml lízis-pufferben. Kihalás a minták követtük 412 nm-en egy Jasco V-650 spektrofotométerrel felszerelt a PBB-718 hőmérséklet-szabályozott cellatartóba (Jasco) szobahőmérsékleten. 100 jil 3 mM ditio-bisz (2-nitro-benzoesav) oldatot adunk hozzá. Extinction követtük a telítettség eléréséig. Számítása tiol koncentráció alkalmazásával végeztük extinkciós együttható ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 a tio-2-nitro-benzoesav (TNB). Cellular tiol koncentrációk alapján számítottuk térfogatú E. coli sejtek 6,7 × 10-15 liter, és a sejtsűrűség A600 = 0,5 (egyenértékű 1 × 108 sejtek ml-1 kultúra). (Müller et al. 2016)

In vivo glutation meghatározása

E. coli MG1655 törzset növesztettünk MOPS minimál közegben össztérfogatban 200ml, amíg egy A600 0,5 értéket értünk el. A tenyészetet 50 ml-es tenyészetekre osztottuk fel a stressz kezelésére. 15 percig 0,79 mmól allicinnel, 1 mmólos diamiddal vagy dimetil-szulfoxiddal (kontroll) végzett inkubálás után a sejteket 4000 ° C-on 4 ° C-on 10 percig betakarítottuk. A sejteket kétszer KPE-pufferrel mostuk, mielőtt a pelletet újra felszuszpendáltuk 700 μl KPE pufferben. A deproteináláshoz 300 ul 10% (tömeg / térfogat) szulfoszalicilsavat adtunk a sejtek ultrahangosodása előtt (3 x 1 perc; VialTweeter ultraszonizáló). A felülúszókat összegyűjtöttük, centrifugálás után (30 perc, 13,000g, 4 ° C). Sulfosalicylic sav koncentrációt csökkent 1% hozzáadásával 3 térfogatrész KPE pufferben. Mérését az összes glutation és GSSG végeztük a fent leírtak szerint. Cellular glutation koncentrációk alapján számítottuk térfogatú E. coli sejtek 6,7×10-15 liter, és a sejtsűrűség A600 0.5 (egyenértékű 1×108 sejtek ml-1 kultúra). GSH koncentrációt számítjuk ki, kivonva 2 [GSSG] a teljes glutation. (Müller et al. 2016)

Ultrahangos disruptor sejt lízis és kitermelése biológiai anyag (Kattintson a képre!)

Érzékelő ultrahangosító UP400St

Kifejezés az emberi mAspAT E. coliban

Ultrahangos sejtfeltáróval UP400St (400W) kitermeléséhez intracelluláris anyag (például fehérjék, organellumok, DNS, RNS stb)Az egyetlen telepet E. coli BL21 (DE3) az expressziós vektort hordozó 30 ml Luria-Bertani (LB) tápközegben, amely 100 ng / ml ampicillin, majd tenyésztjük 37ºC amíg az optikai sűrűség (OD600) Elérte a 0,6. A sejteket centrifugálással nyerjük ki 4000 g-n 10 percig, és újra szuszpendáljuk 3L friss LB tápközegben, amely 100 ug / ml ampicillint.
Ezt követően, fehérje expresszió indukáltuk 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) 20 órán át 16ºC. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 8000 × g-vel 15 percig, majd mostuk A pufferrel (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH = 7,4). Megközelítette 45g (nedves tömeg) sejtet kaptunk 3 liter tenyészet. Centrifugálás után a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 40 ml (1 liter tenyészet) jéghideg extrakciós pufferben, és lizáltuk ultrahanggal jéghideg hőmérséklet alkalmazásával UP400St eszköz (Dr. Hielscher GmbH, Németország). A sejt-lízist centrifugáltuk 12000 rpm-en 15 percen keresztül, hogy külön oldható (felülúszó) és a kicsapódott (pellet) frakciók. (Jiang et al. 2015)

Az alábbi táblázat az ultrahangos készülékek hozzávetőleges feldolgozási kapacitását jelzi:

Kötegelt mennyiség Áramlási sebesség Ajánlott eszközök
00,5-1,5 ml na VialTweeter
1 - 500 ml 10-200 ml / perc UP100H
10-2000 ml 20-400 ml / perc Uf200 ः t, UP400St
0.1-20L 02 - 4 L / perc UIP2000hdT
10-100 liter 2 - 10 l / perc UIP4000
na 10 - 100 l / perc UIP16000
na nagyobb klaszter UIP16000

Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!

Kérjük, használja az alábbi űrlapot, ha szeretné, hogy további információt kérni ultrahangos homogenizáció. Mi lesz boldog, hogy Önnek egy ultrahangos rendszer megfelel a követelményeknek.









Kérjük, vegye figyelembe Adatvédelmi irányelvek.


Irodalom / References



Tudni érdemes

E. coli

Az Escherichia coli (Escherichia coli) Gram-negatív, fakultatívan anaerob, rúd alakú, coliform baktérium az Escherichia nemzetségben, amely gyakran megtalálható a melegvérű organizmusok alsó vékonybélében (endotermek). Számos E. coli törzs (vagy altípus) létezik, amelyek különböző tulajdonságokkal rendelkeznek. A legtöbb E. coli törzs emberre ártalmatlan, pl. B és K-12 törzsek, amelyeket általában laboratóriumi kutatási alkalmazásokhoz használnak. Egyes törzsek azonban károsak és súlyos betegséget okozhatnak.
E. coli fontos szerepet játszik a modern biológiai mérnöki és ipari mikrobiológia, mivel a baktériumok könnyen manipulálni. Gyakori laboratóriumi alkalmazásokhoz, amelyek során gyakran E. coli használatát, például hogy hozzon létre a rekombináns dezoxiribonukleinsav (DNS), valamint, hogy egy modell organizmusban.
E. coli egy nagyon sokoldalú host a heterológ fehérjék termelésére, és sokrétű fehérje expressziós rendszerek állnak rendelkezésre, hogy készítsen a rekombináns proteinek E. coliban. Plazmidok alkalmazásával, amelyek lehetővé teszik a magas szintű expresszióját fehérje, géneket építhetünk be a baktériumok, amely lehetővé teszi ilyen fehérjék nagy mennyiségben az ipari fermentációs folyamatokban.
E.coli használják, mint a sejtgyárak inzulint termelni. További alkalmazások közé tartozik a használata módosított E. coli sejteket, hogy fejlesszék és vakcinák előállítására és immobilizált enzimet, a bioüzemanyag előállításához, valamint a biológiai tisztítási.
A K-12 törzs a mutáns formáját E. coli, hogy a túlzott enzimet expresszáló alkalikus foszfatáz (ALP). Ez a mutáció előfordul miatt egy hibás az a gén, amely folyamatosan enzimet kódolja. Ha egy gén egy olyan terméket eredményez nélkül gátlását ez az úgynevezett konstitutív aktivitást. Ez a specifikus mutáns formája használják izolálására és tisztítására a ALP enzimhez.

Ultrahangos DNS nyírása

Ultrahangos nyíróerők egy gyakran alkalmazott módszer, hogy elváljon a sejt és a szünet DNS szálak darabokra. Akusztikai kavitáció megtöri a sejtfalak és membránok a DNA kivonása érdekében a sejtekről, és fragmenseket körülbelül 600 – 800 bp hosszúságú, ideális elemzésre.
Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni ultrahangos homogenizers DNS fragmentáció!