Protokoll a SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválásához szonikálással

A Hielscher VialTweeter egy egyedülálló ultrahangos többmintás előkészítő egység, amelyet a SARS-COV-2 koronavírus inaktiválására használnak. A VialTweeter lehetővé teszi akár 10 mintatartó fiola egyidejű elkészítését, és ezáltal ideális egység a tömeges mintafeldolgozáshoz.

A SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválása a VialTweeterrel

A fixáló eltávolítása után az egyrétegű rétegeket háromszor mossuk foszfátpufferes sóoldattal (PBS), mielőtt a cellákat 1 ml MEM / 5% FBS-be kaparnánk, és ultrahanggal kezeljük (3 × 10 másodperc be, 10 másodperc ki 100% -os teljesítmény és amplitúdó) a Hielscher ultrahangos processzor segítségével UP200St VialTweeterrel melléklet. A felülúszókat 3000 × g-n 10 percig tartó centrifugálással derítettük. 

Olvassa el a teljes protokollt itt a SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválásához Welch et al. (2020) által:

Sejtek és vírus

Vero E6 sejtek (Vero C1008; ATCC CRL-1586) módosított Eagle minimális esszenciális táptalajban (MEM) tenyésztették, kiegészítve 10% (v / v) magzati borjúszérummal (FCS). A felhasznált vírus a SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020 törzs volt, amelyet PHE izolált az Egyesült Királyság első betegcsoportjából 2020.01.29-én. Ezt a vírust az 1. átjárónál kapták el, és inaktiválási vizsgálatokhoz használták a 2. vagy 3. átjárónál.
A SARS-CoV-2 inaktiválásához használt reagensek és vegyi anyagok, valamint a reagens citotoxicitásának eltávolítása tekintetében lásd Welch et al. (2020) tudományos jelentését.

Vírus inaktiválása mosószerekkel – SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválási protokoll, Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktiválás

Kereskedelmi termékek, víruskészítmények (szövettenyésztő folyadék, titerek, 1 × 10 közötti titerek)⁶ 1 × 10-ig⁸ PFU/ml) reagensekkel háromszor kezelték a gyártó használati utasításában ajánlott koncentrációkban és érintkezési időkben, amennyiben rendelkezésre állnak, vagy a vizsgáló laboratóriumok által kifejezetten kért koncentrációkban és időkben. Amennyiben a gyártó koncentrációtartományt adott meg, a termék és a minta legalacsonyabb arányát (azaz a vizsgált termék legalacsonyabb ajánlott koncentrációját) vizsgálták. A mintaszállító csöves reagenseket egy térfogatrész szövettenyész folyadék és tíz térfogatrész reagens arányával vizsgáltuk, kivéve, ha a gyártó a mintafolyadék és a reagens térfogatarányát határozta meg. A mosószereket, fixálószereket és oldószereket a jelzett koncentrációban teszteltük a megadott időpontokban. Minden inaktiválási lépést szobahőmérsékleten (18 – 25 °C) hajtottak végre. Az alternatív mintatípusok vizsgálatához a vírust 1:9 arányban a jelzett mintamátrixba szúrtuk, majd a fentiek szerint vizsgálati reagensekkel kezeltük. Minden kísérlet három kontroll álkezelt mintát tartalmazott, azonos térfogatú PBS-sel a vizsgálati reagens helyett. Közvetlenül a szükséges behatási idő után 1 ml kezelt mintát dolgoztunk fel a megfelelően kiválasztott szűrési mátrix segítségével. Az inaktiválási vizsgálathoz szükséges reagens eltávolítást nagyobb centrifugaoszlop formátumban végeztük Pierce 4 ml-es mosószer-eltávolító spin oszlopokkal (Thermo Fisher), vagy üres Pierce 10 ml kapacitású centrifugaoszlopokkal (Thermo Fisher) töltve SM2 Bio-gyöngyökkel, Sephacryl S-400HR-rel vagy Sephadex LH-20-szal, hogy 4 ml töltött gyöngyöket / gyantát kapjunk. Az Amicon szűrőkkel történő tisztításhoz 2 × 500 μl-es mintát két centrifugálszűrővel tisztítottunk a korábban leírt módszerrel, majd egyesítettük. A formaldehidhez és a glutáraldehid eltávolításával használt formaldehidhez egy szűrőt használtunk 1× 500 μl mintatérfogattal, 500 μl PBS-ben történő feldolgozás után reszuszpendáltuk, és hozzáadtuk 400ul MEM / 5% FBS-hez. A fertőzött inaktiválásához egyrétegű, 12,5 cm² Vero E6 sejtes lombikok (2,5 × 10⁶ sejt/lombik 2,5 ml MEM/5% FBS) 0,001 MOI hőmérsékleten fertőződött meg, és 37 °C/5% CO-n inkubálták₂ 24 órán keresztül. A felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket 5 ml formaldehiddel vagy formaldehiddel és glutáraldehiddel szobahőmérsékleten 15 vagy 60 percig rögzítettük. A fixálószert eltávolítottuk, és az egyrétegű rétegeket háromszor PBS-sel mossuk, mielőtt a cellákat 1 ml MEM / 5% FBS-be kaparnánk, és ultrahanggal kezeljük (3 × 10 másodperc be, 10 másodperc ki 100% -os teljesítmény és amplitúdó mellett) UP200St VialTweeter rögzítéssel (Hielscher ultrahang technológia). A felülúszókat 3000 × g-n 10 percig tartó centrifugálással derítettük.

A SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválásához használt reagens részletei az ultrahangos VialTweeterrel a protokoll szerint Welch et al. 2020

A teljes protokoll, beleértve a Hielscher VialTweeter használatát is, itt található:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Kifinomult ultrahangos diszmembrátorok és sejtzavarók

A többmintás ultrahangos VialTweeter csak egy a sok ultrahangos megoldás a minta előkészítésére biológiai, biokémiai és klinikai laboratóriumokban. A Hielscher Ultrasonics ideális ultrahangos dismembratort kínál az Ön alkalmazásához, pl. sejtlízis, sejtkivonás, szövethomogenizálás, lizátum oldódás, oldás, minta gáztalanítás stb.
Tudassa velünk, hogy hány mintát kell feldolgoznia óránként és naponta, ha inkább közvetlen vagy közvetett szonikációt szeretne, és mi az ultrahangos mintakezelés célja. Javasoljuk Önnek a legmegfelelőbb ultrahangos készüléket a napi rutinjához!
A Hielscher Ultrasonics digitális ultrahangos processzorai intelligens szoftverrel, automatikus adatrögzítéssel, egyszerű előbeállítási lehetőségekkel rendelkeznek a hőmérséklet-szabályozáshoz, az ultrahangos időtartamhoz, a ciklus / impulzus üzemmódhoz, valamint a minta megvilágításához és a böngésző távirányítójához. Arra törekszünk, hogy ultrahangos készülékeinket a lehető legokosabbá tegyük, hogy kutatási és munkarutinja a lehető legkényelmesebb és sikeresebb legyen.
Kattintson ide, ha további alkalmazásokat szeretne találni, beleértve az ultrahangos mintaelőkészítés protokolljait a VialTweeterrel!