A SARS-CoV-2 koronavírus ultrahangos kezeléssel történő inaktiválásának protokollja

A Hielscher VialTweeter egyedülálló, több minta ultrahangos előkészítésére szolgáló berendezés, amelyet a SARS-COV-2 koronavírus inaktiválására használnak. A VialTweeter akár 10 mintafiola egyidejű előkészítését teszi lehetővé, így ideális berendezés nagy mennyiségű minta feldolgozásához.

A SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválása a VialTweeter segítségével

A fixálószer eltávolítása után a sejtek egyrétegű tenyészeteit háromszor mosták foszfátpufferes sóoldattal (PBS), majd a sejteket kaparással 1mL MEM/5% FBS közegbe juttatták, és ultrahangos kezelésnek vetették alá (3 × 10 másodperc bekapcsolva, 10 másodperc kikapcsolva, 100%-os teljesítménnyel és amplitúdóval) a Hielscher ultrahangos processzorának UP200St VialTweeter feltéttel felszerelt változatával. A felülúszókat 3000 × g mellett, 10 perces centrifugálással tisztították. 

Az alábbiakban olvasható Welch és munkatársai (2020) teljes protokollja a SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválására:

Sejtek és vírus

A Vero E6 sejteket (Vero C1008; ATCC CRL-1586) 10% (v/v) magzati borjúszérummal (FCS) kiegészített, módosított Eagle-féle minimális esszenciális tápközegben (MEM) tenyésztették. A felhasznált vírus a SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020 törzse volt, amelyet a PHE az Egyesült Királyság első betegcsoportjából izolált 29/01/2020 dátummal. A vírust az 1. passzázsban szerezték be, és a 2. vagy 3. passzázsban használták fel az inaktiválási vizsgálatokhoz.
A SARS-CoV-2 inaktiválásához használt reagensek és vegyi anyagok, valamint a reagens citotoxicitásának eltávolítása tekintetében lásd Welch et al. (2020) tudományos jelentését.

Vírusinaktiválás detergensekkel – A SARS-CoV-2 koronavírus inaktiválásának protokollja Welch és munkatársai, 2020 alapján

A SARS-CoV-2 inaktiválása


Kereskedelmi termékek esetében a víruskészítményeket (szövettenyésztési folyadék, a titerek tartománya: 1 × 10⁶ és 1 × 10⁸ PFU/ml között) három párhuzamos mintában kezelték a reagensekkel, a gyártók használati utasításában ajánlott koncentrációkkal és behatási időkkel, amennyiben ilyen utasítás rendelkezésre állt, vagy a vizsgálólaboratóriumok által kifejezetten kért koncentrációkkal és időkkel. Ha a gyártó koncentrációtartományt adott meg, a termék és a minta legkisebb arányát vizsgálták (vagyis a vizsgált termék legkisebb ajánlott koncentrációját). A mintaszállító csövek reagenseit egy térfogatrész szövettenyésztési folyadék és tíz térfogatrész reagens arányával vizsgálták, kivéve, ha a gyártó meghatározta a mintafolyadék és a reagens térfogatarányát. A detergenseket, fixálószereket és oldószereket a megadott koncentrációkban, a megadott ideig vizsgálták. Minden inaktiválási lépést szobahőmérsékleten (18 – 25°C) végeztek. Alternatív mintatípusok vizsgálatához a vírust 1:9 arányban adták a megadott mintamátrixhoz, majd a fent leírtak szerint kezelték a vizsgálati reagensekkel. Minden kísérlet három párhuzamos, álkezelt kontrollmintát is tartalmazott, amelyekben a vizsgálati reagens helyett azonos térfogatú PBS-t használtak. Közvetlenül az előírt behatási idő után 1mL kezelt mintát dolgoztak fel a megfelelően kiválasztott szűrési mátrix segítségével. Az inaktiválási vizsgálatokhoz szükséges reagenseltávolítást nagyobb centrifugaoszlopos kivitelben végezték Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) oszlopokkal, vagy üres, 10mL kapacitású Pierce centrifugaoszlopokat (Thermo Fisher) töltöttek meg SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR vagy Sephadex LH-20 anyaggal úgy, hogy 4mL tömörített gyöngyöt/gyantát kapjanak. Az Amicon szűrőkkel végzett tisztításhoz 2 × 500μl mintát tisztítottak két centrifugális szűrővel a korábban leírt módszer szerint, majd egyesítették őket. A formaldehid, illetve a formaldehid és glutaraldehid eltávolításához egy szűrőt használtak 1× 500μl mintatérfogattal; a feldolgozás után a mintát 500μl PBS-ben újraszuszpendálták, és 400ul MEM/5% FBS közeghez adták. monolayers, 12,5 cm² flasks of Vero E6 cells (2,5 × 10⁶ cells/flask in 2,5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0,001 and incubated at 37°C/5% CO₂ 24 órán át. A felülúszót eltávolították, és a sejteket 5mL formaldehiddel vagy formaldehid és glutáraldehid keverékével fixálták szobahőmérsékleten 15 vagy 60 percig. A fixálószert eltávolították, és a sejtek lekaparása előtt az egyrétegű sejttenyészeteket háromszor átmosták PBS-sel. A sejteket ezután 1mL MEM/5% FBS tápközegbe kaparták, és VialTweeter feltéttel ellátott UP200St készülékkel (Hielscher Ultrasound Technology) ultrahangkezelték (3 × 10 másodperc bekapcsolási idő, 10 másodperc szünet, 100% teljesítmény és amplitúdó mellett). A felülúszókat 3000 × g mellett 10 percig végzett centrifugálással tisztították.


A SARS-CoV-2 koronavírus ultrahangos VialTweeter segítségével történő inaktiválásához használt reagens részletei Welch és munkatársai 2020-as protokollja szerint

A teljes protokoll, beleértve a Hielscher VialTweeter használatát is, itt található:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Korszerű ultrahangos dezintegrátorok és sejtfeltáró berendezések

A több minta kezelésére alkalmas VialTweeter ultrahangos berendezés csupán egyike a biológiai, biokémiai és klinikai laboratóriumokban végzett minta-előkészítéshez kínált számos ultrahangos megoldásnak. A Hielscher Ultrasonics ideális ultrahangos dezintegrátort kínál az Ön alkalmazásához, például sejtlízishez, sejtekből történő extrakcióhoz, szövethomogenizáláshoz, lizátum szolubilizálásához, oldáshoz, minták gáztalanításához stb.
Mondja el, hány mintát kell feldolgoznia óránként és naponta, közvetlen vagy közvetett ultrahangos kezelést részesít-e előnyben, és mi az ultrahangos mintakezelés célja. A napi munkájához legmegfelelőbb ultrahangos berendezést fogjuk ajánlani!
A Hielscher Ultrasonics digitális ultrahangos processzorai intelligens szoftverrel, automatikus adatrögzítéssel, a hőmérséklet-szabályozás, az ultrahangos kezelés időtartama és a ciklus-/impulzusüzemmód egyszerű előbeállítási lehetőségeivel, valamint mintamegvilágítással és böngészőn keresztüli távvezérléssel rendelkeznek. Arra törekszünk, hogy ultrahangos készülékeink a lehető legintelligensebbek legyenek, hogy az Ön kutatása és mindennapi munkája a lehető legkényelmesebb és legsikeresebb legyen.
Kattintson ide további alkalmazásokért, köztük a VialTweeter segítségével végzett ultrahangos minta-előkészítés protokolljaiért!