A BL21 sejtek sejtlízise ultrahangos kezeléssel
A BL21 sejtek az E. coli törzse, amelyet széles körben használnak kutatólaboratóriumokban, biotechnológiában és ipari termelésben, mivel képesek a fehérjék nagy hatékonyságú expresszálására. Az ultrahangos sejtzavar, a lízis és a fehérje extrakció a közös módszer a célzott fehérjék izolálására és összegyűjtésére a BL21 sejtek sejtbelsejéből. Az ultrahangos kezelés teljesen megzavarja a sejtet, és felszabadítja az összes csapdába esett fehérjét, így a fehérje 100% -a elérhető.
BL21 sejtek fehérjeexpresszióhoz
A BL21 sejt egy kémiailag kompetens E. coli baktériumtörzs, amely alkalmas transzformációra és magas szintű fehérjeexpresszióra T7 RNS polimeráz-IPTG indukciós rendszer alkalmazásával. A BL21 sejtek lehetővé teszik bármely olyan gén nagy hatékonyságú fehérjeexpresszióját, amely egy T7 promoter irányítása alatt áll. Az E. coli BL21(DE3) törzse egy T7 RNS polimeráz alapú fehérje termelési törzs, amelyet T7 promoter alapú expressziós vektorokkal kombinálnak, és széles körben alkalmazzák laboratóriumokban és iparban rekombináns fehérjék előállítására. A BL21(DE3) esetében a rekombináns fehérjét kódoló gén expresszióját a kromoszómálisan kódolt T7 RNS polimeráz (T7 RNAP) írja át, amely nyolcszor gyorsabban ír át, mint a hagyományos E. coli RNAP. Ez teszi a BL21(DE3) törzset rendkívül hatékonnyá, és az egyik legkedveltebb fehérjeexpressziós sejtrendszerré teszi.
Protokoll ultrahangos lízishez és fehérje extrakcióhoz BL21 sejtekből
A BL21 sejtek sejtlízisét többnyire ultrahangos kezeléssel végezzük nátrium-lauroil-szarkozináttal (más néven sarkosyl) kombinálva lízispufferként. Az ultrahangos sejtek megszakításának és a fehérje extrakciónak az előnyei az ultrahangos készülékek megbízhatóságában, reprodukálhatóságában, valamint egyszerű, biztonságos és gyors működésében rejlenek. Az alábbi protokoll lépésről lépésre ad útmutatást az ultrahangos BL21 sejtlízishez:
- A chaperon fehérjék eltávolítása érdekében a BL21 baktériumpelleteket 50 ml jéghideg nátrium-tris-EDTA (STE) pufferben szuszpendáltuk (amely 10 mM Tris-HCL-ből, pH 8,0-ból, 1 mM EDTA-ból, 150 mM NaCl-ból áll, kiegészítve 100 mM PMSF-fel).
- 500 l lizozimot (10 mg/ml) adunk hozzá, és a sejteket jégen 15 percig inkubáljuk.
- Ezután 500 ul DTT-t és 7 ml sarkozilt (10% (w/v) STE pufferben kiegészítve) adunk hozzá.
- Alapvető fontosságú, hogy minden tisztítási puffer jéghideg legyen, és a mintákat folyamatosan jégen tartsuk. Ha lehetséges, minden tisztítási lépést a hűtőkamrában kell elvégezni.
- Az ultrahangos lízishez és a fehérje extrakcióhoz a mintákat ultrahanggal kezelik a VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 másodpercig 100% amplitúdóval, 2 perces intervallummal az egyes szonikációk között. Alternatív megoldásként egy szonda típusú ultrahangos homogenizátor mikro-hegygel, pl. UP200Ht S26d2 (3 x 30 mp, 2 perc szünet az ultrahangos ciklusok között, 80% amplitúdó) használható.
- A további tisztítási lépésekhez a mintákat jégen kell tartani, vagy -80 °C-on kell tárolni a további feldolgozásig.
Ultrahangos cella-zavaró UP200St S26d2 mikrocsüccsel lízishez és fehérjeextrakcióhoz
Ultrahangos lízis precíz hőmérséklet-szabályozás alatt
A pontos és megbízható hőmérséklet-szabályozás döntő fontosságú a biológiai minták kezelésekor. A magas hőmérséklet termikusan indukált fehérjelebomlást indít el a mintákban.
Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az szonikálás hőt hoz létre. A minták hőmérséklete azonban jól szabályozható a VialTweeter használatakor. Különböző lehetőségeket kínálunk a minták hőmérsékletének felügyeletére és szabályozására, miközben előkészítjük őket a VialTweeter és a VialPress segítségével az elemzéshez.
- A minta hőmérsékletének ellenőrzése: Az UP200St ultrahangos processzor, amely a VialTweeter-t hajtja, intelligens szoftverrel és dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel van felszerelve. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az UP200St-hez, és helyezze be a hőmérséklet-érzékelő csúcsát az egyik mintacsőbe. Digitális színes érintőképernyőn keresztül beállíthatja a UP200St menüjében egy meghatározott hőmérsékleti tartományt a minta szonikálásához. Az ultrahangos készülék automatikusan leáll, amikor eléri a maximális hőmérsékletet, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete a beállított hőmérséklet alacsonyabb értékére ∆. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megakadályozza a hő okozta degradációt.
- A VialTweeter blokk előhűthető. Helyezze a VialTweeter blokkot (csak a szonotródát jelátalakító nélkül!) a hűtőszekrénybe vagy a fagyasztóba, hogy előhűtse a titánblokkot, és segít elhalasztani a minta hőmérsékletének emelkedését. Ha lehetséges, maga a minta is előhűthető.
- Használjon szárazjeget lehűlni az ultrahangos kezelés során. Használjon szárazjéggel töltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweetert a jégre, hogy a hő gyorsan eloszlasson.
Az ügyfelek világszerte használják a VialTweetert és a VialPress-t a napi minta-előkészítési munkájukhoz biológiai, biokémiai, orvosi és klinikai laboratóriumokban. Az UP200St processzor intelligens szoftvere és hőmérséklet-szabályozása, a hőmérséklet megbízhatóan szabályozható és elkerülhető a hő okozta mintalebomlás. Az ultrahangos mintaelőkészítés a VialTweeter és a VialPress segítségével rendkívül megbízható és reprodukálható eredményeket biztosít!
Keresse meg az optimális ultrahangos diszruptort a lízis alkalmazásához
A Hielscher Ultrasonics régóta tapasztalt gyártója nagy teljesítményű ultrahangos cellabontóknak és homogenizátoroknak laboratóriumok, asztali és ipari mérlegrendszerek számára. A baktériumsejtkultúra mérete, a kutatási vagy gyártási cél, valamint az óránként vagy naponta feldolgozandó sejt mennyisége alapvető tényezők ahhoz, hogy megtalálják a megfelelő ultrahangos sejtrombolót az Ön alkalmazásához.
A Hielscher Ultrasonics különböző megoldásokat kínál több minta egyidejű ultrahangos kezelésére (legfeljebb 10 injekciós üveg a VialTweeterrel) és tömegminták (azaz mikrotiter lemezek / ELISA lemezek a UIP400MTP), valamint a klasszikus szonda típusú laboratóriumi ultrasonicator különböző teljesítményszintekkel 50-400 watt a teljesen ipari ultrahangos processzorok, akár 16 000watt egységenként kereskedelmi sejtzavarok és fehérjekivonás nagy termelésben. Minden Hielscher ultrasonicators épül a 24/7/365 művelet teljes terhelés alatt. A robusztusság és a megbízhatóság ultrahangos készülékeink alapvető jellemzői.
Minden digitális ultrahangos homogenizátor intelligens szoftverrel, színes érintőképernyővel és automatikus adatprotokollal van felszerelve, amelyek az ultrahangos készüléket kényelmes munkaeszközzé teszik a laboratóriumi és termelési létesítményekben.
Tudassa velünk, hogy milyen sejtek, milyen térfogattal, milyen gyakorisággal és milyen céllal kell feldolgoznia biológiai mintáit. Javasoljuk Önnek a legmegfelelőbb ultrahangos cella-diszruptort a folyamat követelményeinek.
Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását a kompakt kézi homogenizátoroktól és a MultiSample ultrahangos készülékektől az ipari ultrahangos processzorokig kereskedelmi alkalmazásokhoz:
| Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
|---|---|---|
| 96 lyukú / mikrotiter lemezek | n.a. | UIP400MTP |
| 10 injekciós üveg à 0,5-1,5 ml | n.a. | VialTweeter az UP200St-nél |
| 00,01–250 ml | 5–100 ml/perc | UP50H |
| 00,01 és 500 ml között | 10–200 ml/perc | UP100H |
| 10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1-től 20L-ig | 0.2-től 4 liter/percig | UIP2000hdT |
| 10–100 liter | 2–10 l/perc | UIP4000hdt |
| n.a. | 10–100 l/perc | UIP16000 |
| n.a. | Nagyobb | klaszter UIP16000 |
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!
UIP400MTP lemezes szonikátor nagy áteresztőképességű cellazavaráshoz 96 lyukú lemezeken
ultrahangos készülék UP200Ht 2 mm-es S26d2 mikrohegygel kis minták ultrahangos kezelésére
Tudjon meg többet arról, hogyan használhatja ultrahangos szövethomogenizátorát a pufferoldatok hatékony és megbízható előállításához!
Tények, amelyeket érdemes tudni
Escherichia coli baktériumok
Az Escherichia coli baktériumtípus, azaz nem spóraképző, Gram-negatív, és egyenes rúd formája jellemzi. Az E.coli baktériumok jelen vannak az emberek és állatok környezetében, ételeiben és beleiben. Az E. coli általában peritrichous flagella használatával mozgékony, de vannak nem mozgékony típusok is. Az E.coli úgynevezett fakultatívan anaerob kemoorganotróf organizmusok, ami azt jelenti, hogy légzőszervi és fermentatív anyagcserére egyaránt képesek. A legtöbb E.coli típus jóindulatú és hasznos funkciókat lát el a szervezetben, pl. gátolja a káros baktériumfajok növekedését, vitaminokat szintetizál stb.
Az úgynevezett B típusú Escherichia coli baktériumsejt az E.coli törzsek speciális kategóriája, amelyet széles körben használnak a kutatásokban olyan mechanizmusok vizsgálatára, mint a bakteriofág érzékenység vagy a korlátozás-módosító rendszerek. Továbbá az E.coli baktériumokat megbízható igáslóként értékelik a fehérjeexpresszió terén a biotechnológiai és élettudományi laboratóriumokban. Például az E.coli-t olyan vegyületek szintetizálására használják, mint a fehérjék és az oligoszacharidok ipari méretekben. Az olyan sajátosságok miatt, mint a proteázhiány, az alacsony acetáttermelés magas glükózszint mellett és a fokozott permeabilitás, az E. coli B sejtek a leggyakrabban használt gazdasejtek genetikailag módosított fehérjék előállításához.
Rekombináns fehérje
A rekombináns fehérjék (rProt) jelentős jelentőségre tesznek szert számos ágazatban, beleértve a vegyipart, a gyógyszeripart, a kozmetikát, a humán- és állatgyógyászatot, a mezőgazdaságot, az élelmiszeripart, valamint a hulladékkezelő ipart.
A rekombináns fehérje előállításához expressziós rendszer használata szükséges. A rekombináns DNS előállítására szolgáló expresszáló sejtrendszerekként mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtek használhatók. Míg a baktériumsejteket a legszélesebb körben használják fehérjeexpresszióra olyan tényezők miatt, mint az alacsony költség, a könnyű méretezhetőség és az egyszerű közegfeltételek, az emlős, élesztő, algák, rovarok és sejtmentes rendszerek bevált alternatívák. A fehérje típusa, funkcionális aktivitása, valamint az expresszált fehérje szükséges hozama befolyásolja a fehérjeexpresszióhoz használt sejtrendszer kiválasztását.
A rekombináns fehérje expresszálásához egy adott sejtet transzfektálni kell egy DNS-vektorral, amely tartalmazza a rekombináns DNS templátját. A sablonnal transzfektált sejteket ezután tenyésztik. A sejtmechanizmus következtében a sejtek átírják és lefordítják az érdeklődésre számot tartó fehérjét, ezáltal előállítják a célzott fehérjét.
Mivel az expresszált fehérjék csapdába esnek a sejtmátrixban, a sejtet lizálni kell (meg kell zavarni és meg kell törni) a fehérjék felszabadításához. Egy következő tisztítási lépésben a fehérjét elválasztjuk és tisztítjuk.
A kezelésben használt első rekombináns fehérje a rekombináns humán inzulin volt 1982-ben. Ma már több mint 170 féle rekombináns fehérjét állítanak elő világszerte orvosi kezelésekhez. A gyógyászatban általánosan használt rekombináns fehérjék például a rekombináns hormonok, interferonok, interleukinok, növekedési faktorok, tumornekrózis faktorok, véralvadási faktorok, trombolitikus gyógyszerek és olyan súlyos betegségek kezelésére szolgáló enzimek, mint a cukorbetegség, törpeség, miokardiális infarktus, pangásos szívelégtelenség, agyi apoplexia, sclerosis multiplex, neutropenia, thrombocytopenia, vérszegénység, hepatitis, rheumatoid arthritis, asztma, Crohn-betegség és rákterápiák. (vö. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Irodalom / Hivatkozások
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter szonikátor 10 minta egyidejű ultrahangos kezelésére, pl. a BL21 sejtek megzavarására
Nagy teljesítményű ultrahangos! A Hielscher termékválasztéka lefedi a teljes spektrumot a kompakt laboratóriumi ultrahangos készüléktől a pad-top egységeken át a teljes ipari ultrahangos rendszerekig.