BL21 sejtek lízise ultrahangos kezeléssel

A BL21 sejtek az E. coli egyik törzséhez tartoznak, amelyet a rendkívül hatékony fehérjeexpresszióra való képessége miatt széles körben használnak kutatólaboratóriumokban, a biotechnológiában és az ipari termelésben. Az ultrahangos sejtfeltárás, lízis és fehérjekivonás a célfehérjék BL21 sejtek belsejéből történő izolálásának és kinyerésének általánosan alkalmazott módszere. Az ultrahangos kezelés teljesen feltárja a sejtet, és felszabadítja az összes benne rekedt fehérjét, így a fehérjék 100%-át hozzáférhetővé teszi.

BL21 sejtek fehérjeexpresszióhoz

A BL21 kémiailag kompetens E. coli baktériumtörzs, amely T7 RNS-polimeráz–IPTG indukciós rendszer alkalmazásával transzformációra és magas szintű fehérjeexpresszióra alkalmas. A BL21 sejtek bármely T7 promóter szabályozása alatt álló gén nagy hatékonyságú fehérjeexpresszióját lehetővé teszik. Az E. coli BL21(DE3) törzs T7 RNS-polimerázon alapuló fehérjetermelő törzs, amelyet T7 promóteren alapuló expressziós vektorokkal kombinálnak, és laboratóriumokban, valamint az iparban széles körben alkalmaznak rekombináns fehérjék előállítására. A BL21(DE3) esetében a rekombináns fehérjét kódoló gén expresszióját a kromoszómán kódolt T7 RNS-polimeráz (T7 RNAP) írja át, amely nyolcszor gyorsabban végez átírást, mint a hagyományos E. coli RNAP. Ez a BL21(DE3) törzset rendkívül hatékonnyá, és az egyik legkedveltebb fehérjeexpressziós sejtrendszerré teszi.

Protokoll BL21 sejtek ultrahangos líziséhez és a belőlük történő fehérjekivonáshoz

A BL21 sejtek lízisét többnyire ultrahangos kezeléssel végzik, lízispufferként nátrium-lauroil-szarkozinátot (más néven szarkozilt) alkalmazva. Az ultrahangos sejtfeltárás és fehérjekivonás előnyei a megbízhatóságban, a reprodukálhatóságban, valamint az ultrahangos készülékek egyszerű, biztonságos és gyors működtetésében rejlenek. Az alábbi protokoll lépésről lépésre ismerteti a BL21 sejtek ultrahangos lízisét:

• A chaperonfehérjék eltávolítása érdekében a BL21 baktériumpelleteket 50 ml jéghideg nátrium–Tris–EDTA (STE) pufferben szuszpendálták újra (összetétele: 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 mM PMSF hozzáadásával).
• Ezután 500 ul lizozimot (10 mg/ ml) adnak hozzá, és a sejteket 15 min ideig jégen inkubálják.
• Ezt követően 500 ul DTT-t és 7 ml szarkozilt (STE pufferben készített 10% (w/v) oldat) adnak hozzá.
• Elengedhetetlen, hogy minden tisztítási puffer jéghideg maradjon, és a mintákat végig jégen tartsák. Lehetőség szerint minden tisztítási lépést hűtött helyiségben kell elvégezni.



• Az ultrahangos lízishez és fehérjekivonáshoz a mintákat a VialTweeter MultiSample Ultrasonicator készülékben 4 x 30 sec ideig, 100%-os amplitúdóval kezelik ultrahanggal, az egyes ultrahangos kezelések között 2 min szünetet tartva. Alternatívaként mikrovéggel ellátott, szondás ultrahangos homogenizátor is használható, például az UP200Ht S26d2 mikrovéggel (3 x 30 sec, az ultrahangos ciklusok között 2 min. szünet, 80%-os amplitúdó).
• A további tisztítási lépésekhez a mintákat jégen kell tartani, vagy alternatívaként -80°C-on tárolni a további feldolgozásig.

Ultrahangos lízis pontos hőmérséklet-szabályozás mellett

A pontos és megbízható hőmérséklet-szabályozás döntő fontosságú a biológiai minták kezelésekor. A magas hőmérséklet hő által kiváltott fehérjebomlást indít el a mintákban.
Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az ultrahangos kezelés is hőt termel. A minták hőmérséklete azonban jól szabályozható a VialTweeter használatakor. Különböző lehetőségeket mutatunk be a minták hőmérsékletének figyelésére és szabályozására, miközben a VialTweeter és a VialPress segítségével előkészíti őket az elemzéshez.

1. A minta hőmérsékletének figyelése: A VialTweeter meghajtását biztosító UP200St ultrahangos processzor intelligens szoftverrel és csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel rendelkezik. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az UP200St készülékhez, és helyezze az érzékelő hegyét az egyik mintacsőbe. A digitális színes érintőkijelzőn, az UP200St menüjében meghatározott hőmérséklet-tartományt állíthat be a minta ultrahangos kezeléséhez. Az ultrahangos készülék a maximális hőmérséklet elérésekor automatikusan leáll, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete le nem csökken a beállított hőmérséklet ∆ alsó értékére. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megakadályozza a hő által kiváltott bomlást.
2. A VialTweeter blokk előhűthető. Helyezze a VialTweeter blokkot (csak a szonotródát, az átalakító nélkül!) hűtőszekrénybe vagy fagyasztóba a titánblokk előhűtéséhez, ami segít késleltetni a minta hőmérsékletének emelkedését. Lehetőség szerint maga a minta is előhűthető.
3. Az ultrahangos kezelés során használjon szárazjeget a hűtéshez. Használjon szárazjéggel megtöltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweeter készüléket a jégre, hogy a hő gyorsan elvezetődhessen.

Ügyfeleink világszerte használják a VialTweeter és a VialPress készülékeket a napi minta-előkészítési munkájukhoz biológiai, biokémiai, orvosi és klinikai laboratóriumokban. Az UP200St processzor intelligens szoftvere és hőmérséklet-szabályozása révén a hőmérséklet megbízhatóan szabályozható, és elkerülhető a minták hő által kiváltott bomlása. A VialTweeter és a VialPress segítségével végzett ultrahangos minta-előkészítés rendkívül megbízható és reprodukálható eredményeket biztosít!
 

Találja meg a lízisalkalmazásához optimális ultrahangos sejtfeltárót

A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos sejtfeltárók és homogenizátorok gyártójaként hosszú évek tapasztalatával rendelkezik a laboratóriumi, asztali és ipari léptékű rendszerek területén. A baktérium-sejttenyészet mérete, a kutatási vagy termelési cél, valamint az óránként vagy naponta feldolgozandó sejtek térfogata alapvető tényezők az alkalmazásához megfelelő ultrahangos sejtfeltáró kiválasztásában.
A Hielscher Ultrasonics különféle megoldásokat kínál több minta egyidejű ultrahangos kezelésére (akár 10 fiola a VialTweeter segítségével), valamint nagyszámú minta kezelésére (azaz mikrotiterlemezek / ELISA-lemezek a UIP400MTP segítségével), továbbá a klasszikus, szondás laboratóriumi ultrahangos készülékektől, amelyek 50 és 400 watt közötti különböző teljesítményszintekkel rendelkeznek, egészen a teljesen ipari ultrahangos processzorokig, amelyek készülékenként akár 16 000 watt teljesítményt nyújtanak a nagyüzemi termelésben végzett kereskedelmi célú sejtfeltáráshoz és fehérjekivonáshoz. Minden Hielscher ultrahangos készüléket teljes terhelés melletti 24/7/365 üzemre terveztek. Ultrahangos készülékeink alapvető jellemzője a strapabíróság és a megbízhatóság.
Minden digitális ultrahangos homogenizátor intelligens szoftverrel, színes érintőkijelzővel és automatikus adatnaplózással rendelkezik, amelyek az ultrahangos készüléket kényelmes munkaeszközzé teszik a laboratóriumokban és a termelőlétesítményekben.
Mondja el nekünk, milyen sejteket, mekkora térfogatban, milyen gyakorisággal és milyen céllal kell feldolgoznia a biológiai mintáiban. A folyamat követelményeinek leginkább megfelelő ultrahangos sejtfeltárót fogjuk ajánlani Önnek.

Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról, a kompakt kézi homogenizátoroktól és a többmintás ultrahangos készülékektől egészen a kereskedelmi alkalmazásokhoz használható ipari ultrahangos processzorokig:

Szakirodalom / Hivatkozások

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.