Ultrahangos fehérje kivonása a szövetből és a sejtkultúrákból
- Fehérje extrahálása lényeges minta előkészítése lépés proteomika.
- Fehérjék kivonhatók a növényi és állati szövetek, élesztők és mikroorganizmusok.
- Az ultrahangos kezelés egy megbízható, hatékony protein extrakciós módszer adja a magas fehérje mennyiségét rövid extrakciós idő.
Fehérje-kitermelés a szövetek és sejtek
A fehérjék szövetekből és tenyésztett sejtekből történő kivonása alapvető mintaelőkészítési lépés, amelyet számos biokémiai és analitikai technika során végeznek, mint például az ELISA, a PAGE, a Western blot megmunkálás, a tömegspektrometria vagy a fehérjetisztítás. Az ultrahangos sejtzavar, a lízis és az extrakció pontosan szabályozható, nem termikus technika a fehérjék magas hozamának biztosítására.
Fehérje extrakció sejtekből a ultrahangos szonda UP200St
- gyors
- magas hozamok
- nagyon hatékony
- Pontos felett paraméterek
- reprodukálható eredményeket
- lineáris skálázhatóság
Általános utasítások ultrahangos lízishez és fehérje extrakcióhoz
- Hőmérséklet-szabályozás: Ahhoz, hogy magas fehérje kitermelést nélkül hődenaturációs, extrakció során a hőmérséklet szabályozni kell. Hielscher a state-of-art ultrahangos homogenizers – Más néven ultrahangos szétesés vagy ultrahang – pontosan szabályozható. Jönnek a dugaszolható hőmérséklet érzékelővel. A beállítási lehetőségek az ultrahangos homogenizáló, a maximális hőmérséklet állítható be. Ha ez a hőmérséklet max elérésekor a ultraszonizáló automatikusan leáll, amíg a minta lehűlt.
- Puffer: Az üdülőt, egy alkalmas pufferben, és a megfelelő térfogatú puffert változik szövetről szövetre, és kell lennie rájöttek-ki próba-és hiba tesztelés.
- Izolálási / tisztítási: Fehérjelizátumokat lehet feleslegben tartalmaznak biomolekulák, mint például DNS-t, vagy szénhidrátok, amely eltávolítható protein kicsapással (dezoxikolát-triklór-ecetsav) vagy puffer csere.
Chittapalo és Noomhorm (2009) tanulmányukban arról számoltak be, hogy a fehérjehozam szonikálással nőtt, és hogy az ultrahangos szövethomogenizációs és lízisfolyamat jelentősen javíthatja a meglévő extrakciós folyamatokat – amely lehetővé teszi az új kereskedelmi kitermelési lehetőségeket.
Ultrahangos cuphorn több minta egyidejű, nagy hatékonyságú mintaelőkészítésére azonos feltételek mellett, fehérjeizolálás és DNS-fragmentáció céljából.
Fehérje extrahálása állati szövetből
Egész méretű szövetek (pl. Vese, szív, tüdő, izom stb.) Előkészítéséhez a szövetet apró darabokra kell apróra vágni tiszta eszközökkel, jégen, lehetőleg a lehető leggyorsabban meg kell akadályozni a proteázok lebomlását (pl. lizáló puffer, például RIPA vagy hipotóniás lízispuffer, amely proteáz- és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmaz). A lefejtés után a mintát folyékony nitrogénbe merítjük a befagyasztáshoz. A mintát későbbi felhasználáskor -80 ° C-on tárolhatjuk, vagy azonnal homogenizálhatjuk jégen. Közvetlenül az ultrahangos extrahálás előtt gyorsan jéghideg lízispuffer (proteáz inhibitorokkal DTT, leupeptin és aprotinin) gyorsan hozzáadódik a mintacsőbe (kb. 10 mg szövet kb. 600 μl puffer ajánlott). Kb. A mintacsövönként 20-60 mg szövetet ajánlunk.
Az ultrahangos homogenizálást, lízist és extrakciót ultrahangos homogenizátorral, például a UP100H vagy UP200Ht, mikro-csúcs sonotrode-val felszerelve. Az ultrahangos időtartam 60-90 mp. ultrahangos ciklus üzemmódban 15 másodperc. szonikálás és 10 másodperc. nyugalmi idő. A mintát folyamatosan jégben kell tartani.
Miután ultrahangos homogenizálás / kitermelés, a lizátumot centrifugáljuk 27000 kb. 20 perc. Ezután a felülúszót összegyűjtjük, úgy, hogy a fehérje-koncentráció lehet meghatározni egy protein vizsgálattal, például Pierce fehérje vizsgálattal BCA.
Fehérje extrahálása vérből szérumot
A szérum és a foszfátpuffer homogén keverékéhez a mintát először az ultrahangos sejtlízis előtt örvényezzük. Az ultrahangos lízishez a mintát ultrahangos laboratóriumi homogenizátorral, például a UP100H 8 ciklusban 20% -os amplitúdóval, minden 5 másodperces ciklusban be és 15 másodpercig. A fehérje extrakciót ciklusokban (pulzálási mód) ultrahangos kezeléssel végezzük, és a mintát jégre helyezzük, hogy elkerüljük a minta túlmelegedését és termikus lebomlását. Mivel a szérum nagy mennyiségű nagy molekulatömegű fehérjét tartalmaz (például albumint, α1-antitripszint, transzferrint, haptoglobulint, immunglobulin G-t és immunglobulin A-t), amelyek zavarják az alacsony molekulatömegű fehérjék elválasztását az IEF során, ajánlatos azokat a szérumból kimeríteni egy kimerülő oszlop segítségével.
Fehérje extrahálása növényi szövetből
Friss, lágy növényi szövetek, például a moha stb, lehet könnyen megszakadhat egyszerűen helyezve a felaprított mintaanyaghoz lízispufferrel ultrahangos kezelés. Kemény, ligenous növényi szövetek, mint például a magvak, fenyő tűk stb, meg kell darálni száraz. Néhány kemény, fás növényi anyagok kell fagyasztani, és folyékony nitrogénben, mielőtt extraháljuk ultrahangos kezeléssel. A növényi sejttenyészet szuszpenziók, ultrahangos kezelést 30 és 150 másodperc egy lízispufferben többnyire elegendő. Szívósabb anyag, mint a tökmag igényel intenzívebb szonikáció az alábbiakban leírtak szerint.
Protokoll ultrahangos extrakcióval albumin tökmag
Az albumin finomra őrölt tökmagporból történő ultrahangos fehérjekivonásához oldószerként 10 g zsírtalanított tökmagport és 100 ml ionmentes vizet adunk hozzá egy 250 ml-es üvegpohárba. A fehérje extrakció két lépésből áll: Először is, a mintát ultrahanggal kezeljük szonda típusú ultrahangos készülék UP400St (400W, 24kHz) felszerelt sonotrode S24d7. Az ultrahangos homogenizálás során az üvegpoharat hideg vízfürdőbe helyezzük. A dugaszolható hőmérséklet-érzékelő és az ultrasonicator hőmérséklet-szabályozási beállításai UP400St biztosítják, hogy a minta hőmérséklete mindig 30 ° C alatt maradjon. Az ultrahangos kezelés során a pontos hőmérséklet-szabályozással elkerülhető az albumin denaturációja. Másodszor, az extrakciót keverővel végeztük 200 fordulat / perc sebességgel és 30 ° C-on. Ezután a főzőpoharat termosztatikus rázógépbe helyezik. A globulint desztillált vízzel végzett dialízissel távolítják el. A globulin eltávolítása után a fehérjekivonatból mintát lehet venni az albuminprofil meghatározása céljából, majd az albumin koagulációhoz 0,1 M HCl felhasználásával pI = 3,0 értékre állíthatjuk be. A szilárd fázist 5000 g-os centrifugálással választják szét, 20 °C-on, majd ionmentes vízben oldják fel. Az albumin koagulációt kétszer végezzük, hogy növeljük a fehérje arányát az albumin koncentrátumban.
Ultrahangos alkalikus fehérjét extrakciós előállítására fehérje koncentrátumot rizskorpa azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelést eredményez magasabb fehérje hozam lényegesen rövidebb extrakciós időt – összehasonlítva a szokásos extrakciós módszerekkel.
A minta előkészítése protokoll funkcionális iNOS enzim
A teljesen működőképes iNOS enzim előállításához (pl. gyógyszerszűréshez) a következő protokoll ajánlott: A sejtszuszpenziót jégre kell helyezni, és ultrahanggal kell kezelni UP100H 10μm amplitúdóval ciklus üzemmódban 5 másodperces szonikálás és 25 másodperc. pihenés jégen. Az eljárást kb. 3-szor meg kell ismételni. Az szonikációs ciklusok közötti pihenőidő csökkenti a hőmérséklet-emelkedést, és ezáltal csökkenti a denaturáció kockázatát.
Ultrahangos Protein Szolubilizációs
Ultrahangos kezelés felgyorsítja a protein oldási folyamat, ami általában több órán át. Annak érdekében, hogy ne hevítsük túl a mintát, és megakadályozzák a fehérje degradációját, és módosításokat tartalmazó oldatokban karbamidot, az ultrahangos robban nem tarthat tovább, mint néhány másodperc.
Ultrahangos UP200Ht 2 mm-es mikrotip S26d2 kis minták ultrahangos kezelésére.
Ultrahangos berendezés Protein Extraction
Hielscher Ultrasonics kínálnak széles körű ultrahangos Homogénizálógépek felbomlása sejtek, szövetek, baktériumok, mikroorganizmusok, élesztő, és a spórákat.
A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékek erőteljesek és könnyen kezelhetők. 24/7 működésre készültek, robusztus és hatékony laboratóriumi és asztali eszközökként tervezték őket. Minden eszköz esetében pontosan szabályozható az energia leadása és az amplitúdó. A tartozékok széles választéka további beállítási lehetőségeket nyit meg. A digitális ultrahangos készülékek, mint például a VialTweeter, UP200Ht, UP200St, és UP400St beépített hőmérséklet-szabályozóval és beépített SD-kártyával rendelkeznek az automatikus adatrögzítéshez.
Több minta közvetett, keresztszennyeződés-mentes és egyidejű szonikálásához kínáljuk a VialTweeter vagy az ultrahangos CupHorn.
Az alábbi táblázat áttekintést nyújt ultrahangos készülékeinkről a minta előkészítéséhez, a sejtek megszakításához és az extrakcióhoz. Kattintson az eszköz típusára, hogy további információkat kapjon az egyes ultrahangos homogenizátorokról. Jól képzett és sokéves tapasztalattal rendelkező technikai személyzetünk örömmel segít kiválasztani a legmegfelelőbb ultrahangos készüléket a minta előkészítéséhez!
| Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
|---|---|---|
| legfeljebb 10 injekciós üveg vagy tubus | na | VialTweeter |
| többwell / mikrotiter lemezek | na | UIP400MTP |
| több cső / edény | na | Cuphorn |
| 1 - 500 ml | 10-200 ml / perc | UP100H |
| 10 és 1000 ml között | 20–200 ml/perc | Uf200 ः t, UP200St |
| 10-2000 ml | 20-400 ml / perc | UP400St |
Az alkalmazástól függően, anyag, és a minta térfogata, akkor javasoljuk, hogy a legmegfelelőbb beállítás a minta-prep. Lépjen velünk kapcsolatba még ma!
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!
A Hielscher digitális ultrahangos készülékek böngésző távirányítóval és automatikus adatprotokollal rendelkeznek egy integrált SD-kártyán.
VialTweeter A közvetett ultrahanggal.
Tudni érdemes
proteomikai
Proteomikai a kutatási terület, amely azt vizsgálja, fehérjék és a proteomot. A fehérjék fullfil széles skálájával életfunkciók belül szervezetekre. A proteoma a teljes készlet által expresszált fehérjék egy genom, sejt, szövet vagy organizmus egy bizonyos időben. A proteomikai változik az idővel és a különböző követelmények, vagy hangsúlyozza, hogy a sejt vagy szervezet megy keresztül. Pontosabban, ez a készlet expresszált fehérjék egy adott típusú sejt vagy szervezet, egy adott időpontban, meghatározott feltételek mellett. A kifejezés a keverék a fehérjék és genom. Proteomikai a tanulmány a proteomot.
Fehérje
A fehérjék nagy biomolekulák, úgynevezett makromolekulák – amelyek egy vagy több hosszú aminosavmaradék-láncból állnak. A fehérjék minden növényi és állati eredetű szervezetben jelen vannak, és ezek döntő jelentőségűek a biológiai funkciók nagy részében. Mivel a fehérjék sok biológiai információt tartalmaznak, azokat analitikai célokra extrahálják, például proteomikai kutatásra. A fehérjék legfontosabb funkciója az anyagcsere-reakciók, a DNS-replikáció, az ingerre adott válasz és a molekulák egyik helyről a másikra való átvitelének katalizációja. A fehérjék elsősorban aminosavszekvenciájukban különböznek egymástól, amelyet génjeik nukleotidszekvenciája diktál, és amely általában fehérjeszé válik egy specifikus háromdimenziós szerkezetbe, amely meghatározza aktivitását. A fehérjék – mellett peptidek – egyik kulcseleme az élelmiszer. Ezért proteomikában egy hatékony eszköz az élelmiszer-tudomány a folyamatok optimalizálása, az élelmiszer-biztonsági és táplálkozási értékelésére.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction az analitek elválasztására és prekoncetrálására szolgáló preanalitikai eljárás. Az ultrahangos kezeléssel kombinálva a felhőpont kivonása fokozható, így a folyamat hatékonyabb, gyorsabb, és környezetbarátabb. Az ultrahangos kezelés, felhőpont extrakció lényegesen hatékonyabb módszer az analit előkészítése. További információ ultrahanggal segített felhőpont kivonás!gélelektroforézis
Gél-elektroforézis a fő módszer elválasztására és elemzésére makromolekulák, mint például a DNS, RNS és fehérjék, valamint ezek fragmensei, alapján méretük és töltésük. Ezt alkalmazzák a klinikai kémiai elválasztásához fehérjék töltés és / vagy a mérete (IEF agaróz, lényegében mérete független) és a biokémia, molekuláris biológia és proteomika elválasztására egy kevert populációja a DNS és RNS-fragmentumok hossza, hogy megbecsüljük a méret a DNS és RNS-fragmensek vagy elválasztásához fehérjék töltés.
Sejttenyészetek
Sejttenyészetet a vezérelt növekvő folyamat által amelyben a sejtek tenyésztése szabályozott körülmények között. A sejttenyésztés körülményei változhatnak minden egyes sejttípus esetében. Általában a környezet egy sejttenyészet áll egy megfelelő edénybe (például Petri-csésze) a szubsztrát vagy közeg, amely szolgáltatja az alapvető tápanyagok (aminosavak, szénhidrátok, vitaminok, ásványi anyagok), a növekedési faktorok, hormonok, és gázok (CO2The2), És szabályozza a fizikai-kémiai környezetben (pH-puffert, az ozmotikus nyomás, hőmérséklet). A legtöbb sejt kell egy felület vagy mesterséges szubsztráton, míg más sejttenyészetek lehet termeszteni szabadon lebeg a tápközegben (szuszpenziós tenyészetben, sejtszuszpenzió).
Mass tenyészetek állati sejtvonalak felhasználhatók az ipari termelés a virális vakcinák és egyéb biotechnológiai úton előállított készítmények. Emberi őssejtek tenyésztjük bővíteni a sejtek száma és differenciálódnak a sejtek különféle szomatikus sejttípusok átültetés céljából.
szövetminták
A kifejezés szövetet ismertet egy cellás közbenső, ahol a sejt anyag szervezeti szinten a sejtek közötti, valamint a teljes szerv. A szövetben, hasonló sejtek, az azonos származású, hogy együtt végezzen egy adott funkciót, összeszerelése. A funkcionális csoportosítása több szövetben, a összetett struktúrák a szervek vannak kialakítva.
A szövetet mintában a kutatás biológia, szövettan / kórszövettani, parazitológiai, biokémia, immunhisztokémia, valamint ápolása és a DNA kivonása. Ez lehet megkülönböztetni között állati (egysége: emlős szövet), és növényi szövetben. Az állati szövetek vannak csoportosítva négy alapvető típusú kötőszöveti, izom, ideg, és a hámszövet. Növényi szövet van felosztva, a következő három szöveti rendszerek: az epidermisz, a talaj szövetet, és a vaszkuláris szövet.
A szövetmintákat állíthatunk elő állati vagy növényi részek, például csont, izom, levelek, stb
Testnedvek
Vér, szérum, plazma, gerincvelői folyadék, nyál és szinoviális folyadékban testfolyadékok, ami lehetőséget teremt a kiváló forrása a diagnosztikailag releváns információt. Ezért, egy kifinomult előkészítése testfolyadék minták elemzés fontos. Az első nehézség van társítva a széles dinamikatartomány komponensek jelen testfolyadékokban.
Meghatározása fehérjekoncentráció
Bradford vizsgálati eljárás, Lowry vizsgálati eljárás és bicinchoninsav- (BCA) vizsgálattal közös vizsgálatokban, hogy meghatározzuk a fehérjék koncentrációja. Szarvasmarha szérum albumin (BSA) az egyik leggyakrabban használt protein szabvány.
lízispufferben
A lízis puffert kell választható megfelelően a sejtanyag vagy szövet (szövettenyészet, növényi, baktériumok, gombák, stb), és hogy a sejtek egy szerkezet és a szerkezet típusától. A széles lízis Pufferek a kivonási fehérjék, membránok, és organellumok anyagokkal formulázzák: egy vagy több detergens. A detergenst általában útján kiválasztott próba-és hiba vizsgálatok vagy – ha van – szerinti egy meglévő fehérje-extrakciós protokoll. A detergens kompatibilisnek kell lennie a szöveti forrás és a fehérjék. Általában, a legenyhébb mosószer, hogy működik egy adott szövet / fehérje, úgy választjuk meg, annak érdekében, hogy fenntartsák a maximális funkcionalitás a kivonat. Továbbá, abban az esetben az extrakciós membránok és az organellumok, egy enyhe detergenst tartja a membrán ép. Általánosan használt detergensek lízis puffereket többnyire nemionos vagy ikerionos, például CHAPS, dezoxikolát, Triton ™ X-100, NP-40 és Tween 20-at.
Például, szövetek, mint például agy, máj, bél, vese, lép stb lehet egyszerűen pufferolt RIPA – Azonban proteáz inhibitorok és DTT (például a gélelektroforézis) kell tartalmaznia.
A lízis puffer vázizom szövetek (jéghideg): 20 mM Tris (pH = 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCI 2, 1% Triton X-100, 10% (tömeg / térfogat) glicerin, 1 mM EDTA-t , 1 mM ditiotreitol kiegészített proteáz és foszfatáz inhibitor koktél
Táblázat közös pufferek és azok pH-tartományban. Általában ezek a pufferek általában használnak 20-50 mM koncentrációkban.
| ütköző | pH-tartományban |
|---|---|
| Citromsav – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| nátrium-citrát – Citromsav | 3,0 – 6,2 |
| Nátrium-acetát – ecetsav | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylic-nátriumsó – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Nátrium-dihidrogén-foszfát – dinátrium-hidrogén-foszfát | 5,8 – 8,0 |
| imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Mops – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidroklorid – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Trisz – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPESPUFFERT – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| tricinben – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| nátrium-tetra – bórsav | 7,6 – 9,2 |
| bicin – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
A legtöbb pufferek mutatnak a pH-függése a hőmérséklettel. Ez különösen igaz a Tris puffert. A pKa változik 8,06 25 ° C 8,85 0 ° C-on.
(PH és pKa egy puffer: pH méri a hidrogénionok koncentrációját a vizes oldatban. PKa (= sav disszociációs állandó) egy rokon, de több, külön intézkedést, hogy segít megjósolni, hogy egy olyan molekula fog működni egy adott PH érték.)
TRIzol címere
TRIzol egy kémiai oldat extrahálására használt RNS / DNS / fehérje során a guanidin-tiocianát-fenol-kloroformos extrakcióval. A használata ultrahanggal támogatott TRIzol extrakciós eredményez magas DNS, RNS és fehérje hozama ugyanabból a mintából, és kiemelkedik ezáltal más extrakciós módszerekkel.
Irodalom / References
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.