Ultrahangos fehérjeextrakció szövetekből és sejttenyészetekből
- A fehérjeextrakció a proteomika alapvető minta-előkészítési lépése.
- Fehérjék növényi és állati szövetekből, élesztőkből és mikroorganizmusokból nyerhetők ki.
- Az ultrahangos kezelés megbízható, hatékony fehérjeextrakciós módszer, amely rövid extrakciós idő alatt nagy fehérjehozamot biztosít.
Fehérjeextrakció szövetekből és sejtekből
A szövetekből és tenyésztett sejtekből végzett fehérjeextrakció alapvető minta-előkészítési lépés, amelyet számos biokémiai és analitikai eljárás, például ELISA, PAGE, Western-blot, tömegspektrometria vagy fehérjetisztítás során végeznek. Az ultrahangos sejtfeltárás, lízis és extrakció pontosan szabályozható, nem termikus technika a nagy fehérjehozam biztosítására.
Fehérjeextrakció sejtekből az UP200St ultrahangos szondával
- Gyors
- Nagy hozam
- Rendkívül hatékony
- A paraméterek pontos szabályozása
- Reprodukálható eredmények
- Lineáris méretnövelhetőség
Általános útmutató az ultrahangos lízishez és fehérjeextrakcióhoz
- Hőmérséklet-szabályozás: A nagy fehérjehozam termikus denaturáció nélküli biztosításához az extrakció során szabályozni kell a hőmérsékletet. A Hielscher korszerű ultrahangos homogenizátorai – amelyeket ultrahangos dezintegrátornak vagy ultrahangos kezelőkészüléknek is neveznek – pontosan szabályozhatók. Csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel rendelkeznek. Az ultrahangos homogenizátor beállításai között megadható a maximális hőmérséklet. E maximális hőmérséklet elérésekor az ultrahangos készülék automatikusan leáll, amíg a minta le nem hűl.
- Puffer: A megfelelő puffer és puffertérfogat szövetenként eltérő, és próbálgatásos vizsgálatokkal kell meghatározni.
- Izolálás / tisztítás: A fehérjelizátumok feleslegben tartalmazhatnak biomolekulákat, például DNS-t vagy szénhidrátokat, amelyek fehérjekicsapással (dezoxikolát–triklórecetsav) vagy puffercserével távolíthatók el.
Chittapalo és Noomhorm (2009) tanulmányukban arról számoltak be, hogy az ultrahangos kezelés alkalmazásával nőtt a fehérjehozam, és hogy az ultrahangos szövethomogenizálás és lízis folyamata jelentősen javíthatja a meglévő extrakciós eljárásokat – új kereskedelmi extrakciós lehetőségeket teremtve.
Ultrahangos CupHorn több minta azonos körülmények közötti, egyidejű, rendkívül hatékony előkészítéséhez, fehérjeizolálás és DNS-fragmentálás céljából.
Fehérjeextrakció állati szövetből
Teljes szövetdarabok (pl. vese, szív, tüdő, izom stb.) előkészítéséhez a szövetet tiszta eszközökkel, lehetőleg jégen, a lehető leggyorsabban nagyon apró darabokra kell vágni a proteázok okozta lebomlás megelőzése érdekében (pl. lízispuffer, például RIPA vagy proteáz- és foszfatázgátló koktélt tartalmazó hipotóniás lízispuffer). A feldarabolás után a mintát folyékony nitrogénbe merítik a gyorsfagyasztáshoz. A minta későbbi felhasználásra -80°C-on tárolható, vagy azonnali homogenizáláshoz jégen tartható. Közvetlenül az ultrahangos extrakció előtt gyorsan jéghideg lízispuffert (DTT, leupeptin és aprotinin proteázgátlókkal) adnak a mintacsőbe (~10 mg szövetenként kb. ~600 μL puffer ajánlott). Mintacsövenként kb. 20–60mg szövet ajánlott.
Az ultrahangos homogenizálást, lízist és extrakciót mikrohegyű szonotródával felszerelt ultrahangos homogenizátorral, például UP100H vagy UP200Ht készülékkel végzik. Az ultrahangos kezelés időtartama 60–90 másodperc, olyan ultrahangos ciklusüzemmódban, amelyben 15 másodperc kezelés és 10 másodperc pihenőidő váltakozik. A mintát végig jégben kell tartani.
Az ultrahangos homogenizálás / extrakció után a lizátumot 27 000g mellett kb. 20 percig centrifugálják. Ezután összegyűjtik a felülúszót, hogy a fehérjekoncentráció fehérjemeghatározási vizsgálattal, például a Pierce BCA fehérjemeghatározási teszttel meghatározható legyen.
Fehérjeextrakció vérszérumból
A szérum és a foszfátpuffer homogén keverékének előállításához a mintát az ultrahangos sejtlízis előtt először vortexkeverővel keverik. Az ultrahangos lízishez a mintát ultrahangos laboratóriumi homogenizátorral, például UP100H készülékkel kezelik 8 cikluson át, 20% amplitúdóval; minden ciklusban 5 másodperc bekapcsolt és 15 másodperc kikapcsolt szakasz váltakozik. A fehérjeextrakciót ciklikus ultrahangos kezeléssel (pulzáló üzemmódban), a mintát jégre helyezve végzik, hogy elkerüljék a minta túlmelegedését és termikus lebomlását. Mivel a szérum nagy mennyiségben tartalmaz nagy molekulatömegű fehérjéket (például albumint, α1-antitripszint, transzferrint, haptoglobulint, immunglobulin G-t és immunglobulin A-t), amelyek az IEF során zavarják a kis molekulatömegű fehérjék elválasztását, ajánlott ezeket eltávolító oszlop segítségével kivonni a szérumból.
Fehérjeextrakció növényi szövetből
A friss, puha növényi szövetek, például a moha stb., könnyen feltárhatók úgy, hogy a felaprított mintaanyagot egyszerűen lízispufferbe helyezik az ultrahangos kezeléshez. A szívós, fás növényi szöveteket, például a magvakat, a fenyőtűket stb., szárazon kell megőrölni. Egyes kemény, fás növényi anyagokat az ultrahangos extrakció előtt folyékony nitrogénben kell lefagyasztani és megőrölni. Növényi sejttenyészet-szuszpenziók esetében többnyire elegendő a lízispufferben végzett, 30 és 150 másodperc közötti ultrahangos kezelés. A szívósabb anyagok, például a tökmag, intenzívebb ultrahangos kezelést igényelnek, az alábbiakban leírtak szerint.
Protokoll az albumin tökmagból történő ultrahangos extrakciójához
Az albumin finomra őrölt tökmagporból történő ultrahangos fehérjeextrakciójához 10 g zsírtalanított tökmagport és oldószerként 100 mL ionmentesített vizet adnak egy 250mL-es üveg főzőpohárba. A fehérjeextrakció két lépésből áll: először a mintát ultrahangos kezelésnek vetik alá egy S24d7 szonotródával felszerelt UP400St szondás ultrahangos készülékkel (400W, 24kHz). Az ultrahangos homogenizálás során az üveg főzőpoharat hideg vízfürdőbe helyezik. Az UP400St ultrahangos készülék csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelője és hőmérséklet-szabályozási beállításai biztosítják, hogy a minta hőmérséklete mindig 30°C alatt maradjon. Az ultrahangos kezelés során alkalmazott pontos hőmérséklet-szabályozás révén elkerülhető az albumin denaturációja. Második lépésként az extrakciót keverővel, 200 rpm fordulatszámon és 30°C-on végezték. Ezután a főzőpoharat termosztatikus rázókészülékbe helyezik át. A globulint desztillált vízzel végzett dialízissel távolítják el. A globulin eltávolítása után a fehérjekivonatból minta vehető az albuminprofil meghatározásához, majd az albumin koagulációjához 0,1 M HCl alkalmazásával pI=3,0 értékre állítják be. A szilárd fázist 5000g mellett, 20°C-on végzett centrifugálással választják el, és ionmentesített vízben újra feloldják. Az albumin koagulációját kétszer végzik el az albuminkoncentrátum fehérjearányának növelése érdekében.
A rizskorpából fehérjekoncentrátum előállítására alkalmazott ultrahangos lúgos fehérjeextrakció azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelés nagyobb fehérjehozamot eredményez jelentősen rövidebb extrakciós idő alatt – a hagyományos extrakciós módszerekhez képest.
Minta-előkészítési protokoll működőképes iNOS enzimhez
Teljesen működőképes iNOS enzim előállításához (pl. gyógyszerszűrés céljára) a következő protokoll ajánlott: a sejtszuszpenziót jégre kell helyezni, és UP100H készülékkel, 10µm amplitúdóval kell ultrahangos kezelésnek alávetni olyan ciklusüzemmódban, amelyben 5 másodperc ultrahangos kezelés és 25 másodperc jégen töltött pihenőidő váltakozik. Az eljárást kb. 3 alkalommal meg kell ismételni. Az ultrahangos kezelési ciklusok közötti pihenőidő mérsékli a hőmérséklet-emelkedést, és ezáltal csökkenti a denaturáció kockázatát.
Ultrahangos fehérjeszolubilizálás
Az ultrahangos kezelés felgyorsíthatja a fehérjék szolubilizálásának folyamatát, amely általában több órát igényel. A minta túlmelegedésének, valamint a fehérjék lebomlásának és módosulásának megelőzése érdekében a karbamidot tartalmazó oldatokban az ultrahangos impulzusok nem tarthatnak néhány másodpercnél tovább.
UP200Ht ultrahangos készülék 2mm-es S26d2 mikroheggyel kis minták ultrahangos kezeléséhez.
Ultrahangos berendezések fehérjeextrakcióhoz
A Hielscher Ultrasonics ultrahangos homogenizátorok széles választékát kínálja sejtek, szövetek, baktériumok, mikroorganizmusok, élesztők és spórák feltárásához.
A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékei nagy teljesítményűek és könnyen kezelhetők. A napi 24 órás, heti 7 napos működésre gyártott készülékeket robusztus és hatékony laboratóriumi és asztali berendezésekként tervezték. Minden készülék esetében pontosan szabályozható az energiakibocsátás és az amplitúdó. A tartozékok széles választéka további összeállítási lehetőségeket kínál. A digitális ultrahangos készülékek, például a VialTweeter, az UP200Ht, az UP200St és az UP400St integrált hőmérséklet-szabályozással és az automatikus adatrögzítéshez beépített SD-kártyával rendelkeznek.
Több minta közvetett, keresztszennyeződéstől mentes és egyidejű ultrahangos kezeléséhez a VialTweeter vagy az ultrahangos CupHorn készüléket kínáljuk.
Az alábbi táblázat áttekintést nyújt a minta-előkészítéshez, sejtfeltáráshoz és extrakcióhoz kínált ultrahangos készülékeinkről. Kattintson a készüléktípusra az egyes ultrahangos homogenizátorokkal kapcsolatos további információkért. Jól képzett, sokéves tapasztalattal rendelkező műszaki munkatársaink örömmel segítenek kiválasztani a minta-előkészítéséhez legmegfelelőbb ultrahangos készüléket!
| Szakaszosan kezelt mintatérfogat | Térfogatáram | Ajánlott készülékek |
|---|---|---|
| akár 10 fiola vagy cső | n.a. | VialTweeter |
| többlyukú / mikrotiterlemezek | n.a. | UIP400MTP |
| több cső / edény | n.a. | CupHorn |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–1000mL | 20–200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP400St |
Az alkalmazásától, az anyagtól és a mintatérfogattól függően ajánljuk a minta-előkészítéséhez legmegfelelőbb összeállítást. Lépjen kapcsolatba velünk még ma!
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezzen tőlünk!
A Hielscher digitális ultrahangos készülékei böngészőn keresztüli távvezérléssel és integrált SD-kártyára történő automatikus adatnaplózással rendelkeznek.
VialTweeter közvetett ultrahangos kezeléshez.
Hasznos tudnivalók
Proteomika
A proteomika a fehérjéket és a proteomot vizsgáló kutatási terület. A fehérjék számos létfontosságú funkciót látnak el az élőlényekben. A proteom egy genom, sejt, szövet vagy szervezet által egy adott időpontban kifejezett fehérjék teljes összessége. A proteom időben változik, valamint a sejtet vagy szervezetet érő különböző követelmények vagy stresszhatások függvényében is módosul. Pontosabban egy adott sejt- vagy szervezettípusban, adott időpontban, meghatározott körülmények között kifejezett fehérjék összességét jelenti. A kifejezés a fehérjék és a genom elnevezésének összevonásából származik. A proteomika a proteom tanulmányozása.
Fehérje
A fehérjék nagy biomolekulák, úgynevezett makromolekulák – amelyek egy vagy több, aminosav-maradékokból álló hosszú láncból épülnek fel. A fehérjék minden növényi és állati eredetű élőlényben jelen vannak, és a legtöbb biológiai funkcióhoz nélkülözhetetlenek. Mivel a fehérjék sok biológiai információt tartalmaznak, analitikai célokra, például proteomikai kutatáshoz nyerik ki őket. A fehérjék legfontosabb funkciói közé tartozik az anyagcsere-reakciók katalízise, a DNS-replikáció, az ingerekre adott válasz és a molekulák egyik helyről a másikra történő szállítása. A fehérjék elsősorban aminosav-szekvenciájukban különböznek egymástól, amelyet génjeik nukleotidszekvenciája határoz meg, és amely általában a fehérje egy meghatározott háromdimenziós szerkezetté történő feltekeredését eredményezi; ez a szerkezet határozza meg az aktivitását. A fehérjék – a peptidek mellett – az élelmiszerek egyik kulcsfontosságú összetevői. Ezért a proteomika hatékony eszköz az élelmiszer-tudományban a folyamatok, az élelmiszer-biztonság és a táplálkozási értékelés optimalizálásához.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction az analitok elválasztására és előkoncentrálására szolgáló, analízis előtti eljárás. Ultrahangos kezeléssel kombinálva a felhőpont-extrakció intenzifikálható, így a folyamat hatékonyabbá, gyorsabbá és környezetbarátabbá válik. Ultrahangos kezeléssel a felhőpont-extrakció az analitok előkészítésének jelentősen hatékonyabb módszere. Olvasson többet az ultrahanggal támogatott felhőpont-extrakcióról!
Gélelektroforézis
A gélelektroforézis a makromolekulák, például a DNS, az RNS és a fehérjék, valamint fragmentumaik méret és töltés alapján történő elválasztásának és elemzésének fő módszere. A klinikai kémiában a fehérjék töltés és/vagy méret szerinti elválasztására használják (IEF agaróz, lényegében méretfüggetlen), a biokémiában, a molekuláris biológiában és a proteomikában pedig DNS- és RNS-fragmentumok vegyes populációjának hosszúság szerinti elválasztására, a DNS- és RNS-fragmentumok méretének becslésére vagy a fehérjék töltés szerinti elválasztására alkalmazzák.
Sejttenyészetek
A sejttenyésztés szabályozott növekedési folyamat, amelynek során sejteket tenyésztenek ellenőrzött körülmények között. A sejttenyésztés feltételei sejttípusonként eltérnek. Általában a sejttenyészet környezetét egy megfelelő edény (pl. Petri-csésze) alkotja olyan szubsztráttal vagy tápközeggel, amely biztosítja az alapvető tápanyagokat (aminosavakat, szénhidrátokat, vitaminokat, ásványi anyagokat), növekedési faktorokat, hormonokat és gázokat (CO2, O2), valamint szabályozza a fizikai-kémiai környezetet (pH-puffer, ozmotikus nyomás, hőmérséklet). A legtöbb sejtnek felületre vagy mesterséges szubsztrátra van szüksége, míg más sejttenyészetek a tápközegben szabadon lebegve is tenyészthetők (szuszpenziós tenyészet, sejtszuszpenzió).
Az állati sejtvonalak tömegtenyészeteit vírusvakcinák és más biotechnológiai úton előállított termékek ipari gyártásában használják. Az emberi őssejteket a sejtszám növelése és a sejtek különféle szomatikus sejttípusokká történő differenciálása érdekében tenyésztik transzplantációs célokra.
Szövetminták
A szövet kifejezés olyan sejtes köztes szerveződést ír le, amelyben a sejtanyag szerveződési szintje a sejtek és egy teljes szerv közé esik. A szövetben azonos eredetű, hasonló sejtek rendeződnek össze, amelyek együttesen egy meghatározott funkciót látnak el. Több szövet funkcionális csoportosulása révén alakulnak ki a szervek összetett struktúrái.
Szövetmintákat vesznek biológiai, szövettani/szövettani kórtani, parazitológiai, biokémiai és immunhisztokémiai kutatásokhoz, valamint szövettenyésztéshez és DNS-kivonáshoz. Megkülönböztethetők állati (alcsoport: emlősszövet) és növényi szövetek. Az állati szöveteket négy alapvető típusba sorolják: kötőszövet, izomszövet, idegszövet és hámszövet. A növényi szöveteket a következő három szövetrendszerbe osztják: bőrszövet, alapszövet és szállítószövet.
Szövetminták állati vagy növényi részekből, például csontból, izomból, levelekből stb. készíthetők.
Testfolyadékok
A vér, a szérum, a plazma, az agy-gerincvelői folyadék, a nyál és az ízületi folyadék olyan testfolyadékok, amelyek diagnosztikai szempontból releváns információk gazdag forrásai. Ezért fontos a testfolyadékminták gondos előkészítése az elemzéshez. Az első nehézség a testfolyadékokban jelen lévő összetevők széles dinamikus tartományával függ össze.
A fehérjekoncentráció meghatározása
A Bradford-vizsgálat, a Lowry-vizsgálat és a bicinkoninsavas (BCA) vizsgálat a fehérjekoncentráció meghatározására szolgáló elterjedt vizsgálatok. A szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) az egyik leggyakrabban használt fehérjestandard.
Lízispuffer
A lízispuffert a sejtanyagnak vagy szövetnek (szövettenyészet, növény, baktériumok, gombák stb.), valamint annak megfelelően kell kiválasztani, hogy a sejtek valamilyen struktúrában helyezkednek-e el, és milyen típusú ez a struktúra. A fehérjék, membránok és sejtszervecskék extrakciójához használt lízispufferek széles választékát egy vagy több detergenssel formulázzák. A detergenst általában próbálgatásos vizsgálatokkal vagy – ha rendelkezésre áll – egy meglévő fehérjeextrakciós protokoll alapján választják ki. A detergensnek kompatibilisnek kell lennie a kiindulási szövettel és a fehérjékkel. Általában az adott szövet / fehérje esetében hatásos legenyhébb detergenst választják, hogy a kivonat működőképessége a lehető legnagyobb mértékben megmaradjon. Ezenkívül membránok és sejtszervecskék extrakciója esetén az enyhe detergens megőrzi a membrán épségét. A lízispufferekben általánosan használt detergensek többnyire nemionosak vagy ikerionosak, például CHAPS, dezoxikolát, Triton™ X-100, NP40 és Tween 20.
Például az agy, a máj, a bél, a vese, a lép stb. szövetei egyszerűen pufferelhetők RIPA-val – azonban proteázgátlókat és DTT-t (pl. gélelektroforézishez) is kell hozzáadni.
Lízispuffer vázizomszövethez (jéghideg): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerin, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, proteáz- és foszfatázgátló koktéllal kiegészítve
Az elterjedt pufferek és pH-tartományuk táblázata. Ezeket a puffereket általában 20–50 mM koncentrációban használják.
| Puffer | pH-tartomány |
|---|---|
| Citromsav – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Nátrium-citrát – citromsav | 3,0 – 6,2 |
| Nátrium-acetát – ecetsav | 3,6 – 5,6 |
| Kakodilsav nátriumsója – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Nátrium-dihidrogén-foszfát – dinátrium-hidrogén-foszfát | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin-hidroklorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Nátrium-tetraborát – bórsav | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
A legtöbb puffer pH-ja hőmérsékletfüggő. Ez különösen igaz a Tris-pufferekre. A pKa 25°C-on 8,06, 0°C-on pedig 8,85 értékre változik.
(Egy puffer pH-ja és pKa-ja: a pH a hidrogénionok koncentrációját méri vizes oldatban. A pKa (= savi disszociációs állandó) ehhez kapcsolódó, de specifikusabb mérőszám, mivel segít előre jelezni, hogyan viselkedik egy molekula egy adott pH-értéken.)
TRIzol
A TRIzol olyan kémiai oldat, amelyet RNS/DNS/fehérje kivonására használnak a guanidinium-tiocianát–fenol–kloroform extrakció során. Az ultrahanggal támogatott TRIzol-extrakció alkalmazása ugyanabból a mintából nagy DNS-, RNS- és fehérjehozamot eredményez, és ezáltal felülmúlja a többi extrakciós módszert.
Szakirodalom/Hivatkozások
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.