Hielscher ultrahang technológia

Ultrahangos fehérje kivonása a szövetből és a sejtkultúrákból

  • Fehérje extrahálása lényeges minta előkészítése lépés proteomika.
  • Fehérjék kivonhatók a növényi és állati szövetek, élesztők és mikroorganizmusok.
  • Az ultrahangos kezelés egy megbízható, hatékony protein extrakciós módszer adja a magas fehérje mennyiségét rövid extrakciós idő.

 

Fehérje-kitermelés a szövetek és sejtek

Fehérjeextrakció szövetekből és tenyésztett sejtek lényeges minta-előkészítés olyan lépést, amely során végzett számos biokémiai és analitikai technikákkal, például ELISA, PAGE, Western blot, Tömegspektrometria, vagy fehérje tisztítási. Ultrahangos sejtroncsoláshoz, lízis és kitermelése egy pontosan vezérelhető technikát nagy kitermelésének biztosítására a fehérjék.

Fehérje extrahálása állati szövetből

Egész méretű szövetek (pl. Vese, szív, tüdő, izom stb.) Előkészítéséhez a szövetet apró darabokra kell apróra vágni tiszta eszközökkel, jégen, lehetőleg a lehető leggyorsabban meg kell akadályozni a proteázok lebomlását (pl. lizáló puffer, például RIPA vagy hipotóniás lízispuffer, amely proteáz- és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmaz). A lefejtés után a mintát folyékony nitrogénbe merítjük a befagyasztáshoz. A mintát későbbi felhasználáskor -80 ° C-on tárolhatjuk, vagy azonnal homogenizálhatjuk jégen. Közvetlenül az ultrahangos extrahálás előtt gyorsan jéghideg lízispuffer (proteáz inhibitorokkal DTT, leupeptin és aprotinin) gyorsan hozzáadódik a mintacsőbe (kb. 10 mg szövet kb. 600 μl puffer ajánlott). Kb. A mintacsövönként 20-60 mg szövetet ajánlunk.
Ultrahangos homogenizálás, lízis és a kivonás egy ultrahangos homogenizálóval, mint például a Uf200 ः t vagy UP200StElláttunk egy mikro-tip sonotrode. Az ultrahangos kezelés időtartama 60-90 sec. egy ultrahang ciklus üzemmód 15 mp. ultrahangos kezeléssel és a 10 mp. pihenő idő. A mintát úgy kell tartani, egész idő alatt jégen.
Miután ultrahangos homogenizálás / kitermelés, a lizátumot centrifugáljuk 27000 kb. 20 perc. Ezután a felülúszót összegyűjtjük, úgy, hogy a fehérje-koncentráció lehet meghatározni egy protein vizsgálattal, például Pierce fehérje vizsgálattal BCA.

Fehérje szonikáció fontos módszer a minta-előkészítés

Ultrahangos protein extrakció sejtekből UP200St

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


Fehérje extrahálása vérből szérumot

A szérum és a foszfátpuffer homogén keveréke esetében a mintát vortexezzük először ultrahangos sejtlízis előtt. Az ultrahangos lízishez a mintát ultrahangos laboratóriumi homogenizátorral, például a UP100H 8 ciklus 20% amplitúdójú, a ciklusban minden egyes 5 másodpercig, és 15 másodperc ki. Sonocation végezzük sonicationg a ciklusok és azáltal, hogy a mintát jégen úgy, hogy a túlmelegedés és termikus lebomlás a minta elkerülhető. Mivel a szérum nagy mennyiségben tartalmaz a nagy molekulatömegű fehérjék (mint például az albumin, α1-antitripszin, transzferrin, haptoglobulin, immunglobulin G és immunglobulin A), amelyek gátolják a szétválasztása alacsony molekulasúlyú fehérjék során IEF, akkor ajánlott, hogy lebontó őket a szérumból az a kimerülése oszlopot.

Fehérje extrahálása növényi szövetből

Friss, lágy növényi szövetek, például a moha stb, lehet könnyen megszakadhat egyszerűen helyezve a felaprított mintaanyaghoz lízispufferrel ultrahangos kezelés. Kemény, ligenous növényi szövetek, mint például a magvak, fenyő tűk stb, meg kell darálni száraz. Néhány kemény, fás növényi anyagok kell fagyasztani, és folyékony nitrogénben, mielőtt extraháljuk ultrahangos kezeléssel. A növényi sejttenyészet szuszpenziók, ultrahangos kezelést 30 és 150 másodperc egy lízispufferben többnyire elegendő. Szívósabb anyag, mint a tökmag igényel intenzívebb szonikáció az alábbiakban leírtak szerint.

Protokoll ultrahangos extrakcióval albumin tökmag

Ultrahangos szövet homogenizáló UP400St a S24d40 - fehérje kitermelése növényi és állati szövetek (Kattintson a képre!)Az ultrahangos fehérje kitermelése albumin finomra őrölt tökmag por, 10 g zsírtalanított tökmag por és 100 ml ionmentesített víz, mint oldószer keverékét egy 250 ml-es üveg főzőpohárban. A fehérje kitermelés áll két lépésben: Először is, a mintát ultrahanggal kezeljük egy próbával típusú ultraszonizáló UP400St (400W, 24kHz) rászerelt sonotrode S24d7. A főzőpohár helyezzük hideg vízfürdőbe során az ultrahangos homogenizálás. A beállítás a ultraszonizálót UP400St a beépíthető hőmérséklet-érzékelő biztosítja, hogy a minta hőmérséklete mindig 30 ° C alatt maradjon. A pontos hőmérséklet-szabályozás az ultrahangozás során elkerülhető az albumin denaturálása. Másodszor, az extrahálást 200 fordulat / perc fordulatszámmal és 30 ° C-os keverővel végeztük. Ezt követően a főzőpoharat egy termosztatikus rázógépbe visszük át. A globulint dialízissel távolítjuk el desztillált vízzel. A globulin eltávolítása után a fehérjeextraktum az albuminprofil meghatározására mintavételezhető, majd ezt követően pI = 3,0 értékre állítjuk be az albumin koagulációhoz 0,1 M HCI-t alkalmazva. A szilárd fázist 5000 g-os, 20 ° C-os centrifugálással elválasztottuk és ionmentesített vízben újra feloldottuk. Az albumin koagulációt kétszer hajtják végre, hogy növeljék az albumin koncentrátumban a fehérje arányát.

Ultrahangos alkalikus fehérjét extrakciós előállítására fehérje koncentrátumot rizskorpa azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelést eredményez magasabb fehérje hozam lényegesen rövidebb extrakciós időt – összehasonlítva a szokásos extrakciós módszerekkel.

Ultrahangos készülék VialTweeter fehérje kivonással szövetminták (Kattintson a képre!)

VialTweeter A közvetett ultrahanggal.

Előnyök

  • gyors
  • magas hozamok
  • nagyon hatékony
  • Pontos felett paraméterek
  • reprodukálható eredményeket
  • lineáris skálázhatóság

A minta előkészítése protokoll funkcionális iNOS enzim

Ahhoz, hogy teljesen működőképes iNOS enzim (például a kábítószer-szűrés), a következő protokoll javasolt: A sejtszuszpenziót kell jégre helyeztük, és ultrahanggal kezeljük egy UP100H A 10 um amplitúdó ciklus üzemmód 5 sec. ultrahangos kezeléssel és a 25 mp. pihenni jégen. Az eljárást meg kell ismételni kb. 3-szor. A pihenő idő között ultrahanggal ciklus csökkenti a hőmérséklet-emelkedés, és ezért csökkenti a kockázatot a denaturálási.

Ultrahangos Protein Szolubilizációs

Ultrahangos kezelés felgyorsítja a protein oldási folyamat, ami általában több órán át. Annak érdekében, hogy ne hevítsük túl a mintát, és megakadályozzák a fehérje degradációját, és módosításokat tartalmazó oldatokban karbamidot, az ultrahangos robban nem tarthat tovább, mint néhány másodperc.

Általános utasítások

Hőmérséklet-szabályozás: Ahhoz, hogy magas fehérje kitermelést nélkül hődenaturációs, extrakció során a hőmérséklet szabályozni kell. Hielscher a state-of-art ultrahangos homogenizers – is nevezik ultrahangos dezintegrátort vagy szonikátorberendezésben – pontosan szabályozható. Jönnek a dugaszolható hőmérséklet érzékelővel. A beállítási lehetőségek az ultrahangos homogenizáló, a maximális hőmérséklet állítható be. Ha ez a hőmérséklet max elérésekor a ultraszonizáló automatikusan leáll, amíg a minta lehűlt.
Puffer: Az üdülőt, egy alkalmas pufferben, és a megfelelő térfogatú puffert változik szövetről szövetre, és kell lennie rájöttek-ki próba-és hiba tesztelés.
Izolálási / tisztítási: Fehérjelizátumokat lehet feleslegben tartalmaznak biomolekulák, mint például DNS-t, vagy szénhidrátok, amely eltávolítható protein kicsapással (dezoxikolát-triklór-ecetsav) vagy puffer csere.

Chittapalo és Noomhorm (2009) számolt be, hogy a fehérje hozam növekedett segítségével ultrahangos kezelés, és hogy az ultrahangos szervhigításos és lízis eljárás javíthatja meglévő extrakciós folyamatok jelentősen – amely lehetővé teszi az új kereskedelmi kitermelési lehetőségeket.

Hang védelem Hielscher hangzás burkolat SPB-L és ultrahangos UP200St. (Kattints a kinagyításhoz!)

Ultrahangos szövet homogenizáló UP200St a fehérje hatékony extrakciós

Pontos szabályozása az ultrahangos kezelés (Kattintson a képre!)

Böngésző vezérlés pontos működését és ellenőrzését az ultrahangos eljárás

Ultrahangos berendezés Protein Extraction

Hielscher Ultrasonics kínálnak széles körű ultrahangos Homogénizálógépek felbomlása sejtek, szövetek, baktériumok, mikroorganizmusok, élesztő, és a spórákat.
Hielscher laboratóriumi ultrasonicators erőteljes és könnyen kezelhető. Beépített 24/7 működés, ezek célja a megbízható és hatékony laboratóriumi és asztali eszközök. Az összes eszköz, az energiatermelés és az amplitúdó pontosan szabályozható. A széles körű kiegészítők nyit további beállítási lehetőségek. A digitális eszközök, mint például VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, és UP400St Van egy beépített hőmérséklet-szabályozás és a beépített SD kártya automatikus adatrögzítés.
A közvetett, kereszt-szennyeződés mentes és egyidejű ultrahangos több minta kínálunk a VialTweeter vagy a Ultrahangos cuphorn.
Az alkalmazástól függően, anyag, és a minta térfogata, akkor javasoljuk, hogy a legmegfelelőbb beállítás a minta-prep. Lépjen velünk kapcsolatba még ma!

Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!

Kérjük, használja az alábbi űrlapot, ha szeretné, hogy további információt kérni ultrahangos homogenizáció. Mi lesz boldog, hogy Önnek egy ultrahangos rendszer megfelel a követelményeknek.









Kérjük, vegye figyelembe Adatvédelmi irányelvek.


Irodalom / References

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrahangos támogatott lúgos extrakcióval fehérje zsírtalanított rizskorpa és tulajdonságait a fehérje koncentrátumok. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André azaz például:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): hatékony kinyerésére a fehérjék több forrásból mintákat követően Trizol vagy Trizol LS RNS extrakció és a hosszú távú tárolás. BMC Genomics, 2013, 14, 181.


Tudni érdemes

proteomikai

Proteomikai a kutatási terület, amely azt vizsgálja, fehérjék és a proteomot. A fehérjék fullfil széles skálájával életfunkciók belül szervezetekre. A proteoma a teljes készlet által expresszált fehérjék egy genom, sejt, szövet vagy organizmus egy bizonyos időben. A proteomikai változik az idővel és a különböző követelmények, vagy hangsúlyozza, hogy a sejt vagy szervezet megy keresztül. Pontosabban, ez a készlet expresszált fehérjék egy adott típusú sejt vagy szervezet, egy adott időpontban, meghatározott feltételek mellett. A kifejezés a keverék a fehérjék és genom. Proteomikai a tanulmány a proteomot.

Fehérje

A fehérjék nagy biomolekulák, úgynevezett makromolekulák – amelyek egy vagy több hosszú aminosavmaradék-láncból állnak. A fehérjék minden növényi és állati eredetű szervezetben jelen vannak, és ezek döntő jelentőségűek a biológiai funkciók nagy részében. Mivel a fehérjék sok biológiai információt tartalmaznak, azokat analitikai célokra extrahálják, például proteomikai kutatásra. A fehérjék legfontosabb funkciója az anyagcsere-reakciók, a DNS-replikáció, az ingerre adott válasz és a molekulák egyik helyről a másikra való átvitelének katalizációja. A fehérjék elsősorban aminosavszekvenciájukban különböznek egymástól, amelyet génjeik nukleotidszekvenciája diktál, és amely általában fehérjeszé válik egy specifikus háromdimenziós szerkezetbe, amely meghatározza aktivitását. A fehérjék – mellett peptidek – egyik kulcseleme az élelmiszer. Ezért proteomikában egy hatékony eszköz az élelmiszer-tudomány a folyamatok optimalizálása, az élelmiszer-biztonsági és táplálkozási értékelésére.

gélelektroforézis

Gél-elektroforézis a fő módszer elválasztására és elemzésére makromolekulák, mint például a DNS, RNS és fehérjék, valamint ezek fragmensei, alapján méretük és töltésük. Ezt alkalmazzák a klinikai kémiai elválasztásához fehérjék töltés és / vagy a mérete (IEF agaróz, lényegében mérete független) és a biokémia, molekuláris biológia és proteomika elválasztására egy kevert populációja a DNS és RNS-fragmentumok hossza, hogy megbecsüljük a méret a DNS és RNS-fragmensek vagy elválasztásához fehérjék töltés.

Sejttenyészetek

Sejttenyészetet a vezérelt növekvő folyamat által amelyben a sejtek tenyésztése szabályozott körülmények között. A sejttenyésztés körülményei változhatnak minden egyes sejttípus esetében. Általában a környezet egy sejttenyészet áll egy megfelelő edénybe (például Petri-csésze) a szubsztrát vagy közeg, amely szolgáltatja az alapvető tápanyagok (aminosavak, szénhidrátok, vitaminok, ásványi anyagok), a növekedési faktorok, hormonok, és gázok (CO2The2), És szabályozza a fizikai-kémiai környezetben (pH-puffert, az ozmotikus nyomás, hőmérséklet). A legtöbb sejt kell egy felület vagy mesterséges szubsztráton, míg más sejttenyészetek lehet termeszteni szabadon lebeg a tápközegben (szuszpenziós tenyészetben, sejtszuszpenzió).
Mass tenyészetek állati sejtvonalak felhasználhatók az ipari termelés a virális vakcinák és egyéb biotechnológiai úton előállított készítmények. Emberi őssejtek tenyésztjük bővíteni a sejtek száma és differenciálódnak a sejtek különféle szomatikus sejttípusok átültetés céljából.

szövetminták

A kifejezés szövetet ismertet egy cellás közbenső, ahol a sejt anyag szervezeti szinten a sejtek közötti, valamint a teljes szerv. A szövetben, hasonló sejtek, az azonos származású, hogy együtt végezzen egy adott funkciót, összeszerelése. A funkcionális csoportosítása több szövetben, a összetett struktúrák a szervek vannak kialakítva.
A szövetet mintában a kutatás biológia, szövettan / kórszövettani, parazitológiai, biokémia, immunhisztokémia, valamint ápolása és a DNA kivonása. Ez lehet megkülönböztetni között állati (egysége: emlős szövet), és növényi szövetben. Az állati szövetek vannak csoportosítva négy alapvető típusú kötőszöveti, izom, ideg, és a hámszövet. Növényi szövet van felosztva, a következő három szöveti rendszerek: az epidermisz, a talaj szövetet, és a vaszkuláris szövet.
A szövetmintákat állíthatunk elő állati vagy növényi részek, például csont, izom, levelek, stb

Testnedvek

Vér, szérum, plazma, gerincvelői folyadék, nyál és szinoviális folyadékban testfolyadékok, ami lehetőséget teremt a kiváló forrása a diagnosztikailag releváns információt. Ezért, egy kifinomult előkészítése testfolyadék minták elemzés fontos. Az első nehézség van társítva a széles dinamikatartomány komponensek jelen testfolyadékokban.

Meghatározása fehérjekoncentráció

Bradford vizsgálati eljárás, Lowry vizsgálati eljárás és bicinchoninsav- (BCA) vizsgálattal közös vizsgálatokban, hogy meghatározzuk a fehérjék koncentrációja. Szarvasmarha szérum albumin (BSA) az egyik leggyakrabban használt protein szabvány.

lízispufferben

A lízis puffert kell választható megfelelően a sejtanyag vagy szövet (szövettenyészet, növényi, baktériumok, gombák, stb), és hogy a sejtek egy szerkezet és a szerkezet típusától. A széles lízis Pufferek a kivonási fehérjék, membránok, és organellumok anyagokkal formulázzák: egy vagy több detergens. A detergenst általában útján kiválasztott próba-és hiba vizsgálatok vagy – ha van – szerinti egy meglévő fehérje-extrakciós protokoll. A detergens kompatibilisnek kell lennie a szöveti forrás és a fehérjék. Általában, a legenyhébb mosószer, hogy működik egy adott szövet / fehérje, úgy választjuk meg, annak érdekében, hogy fenntartsák a maximális funkcionalitás a kivonat. Továbbá, abban az esetben az extrakciós membránok és az organellumok, egy enyhe detergenst tartja a membrán ép. Általánosan használt detergensek lízis puffereket többnyire nemionos vagy ikerionos, például CHAPS, dezoxikolát, Triton ™ X-100, NP-40 és Tween 20-at.
Például, szövetek, mint például agy, máj, bél, vese, lép stb lehet egyszerűen pufferolt RIPA – Azonban proteáz inhibitorok és DTT (például a gélelektroforézis) kell tartalmaznia.
A lízis puffer vázizom szövetek (jéghideg): 20 mM Tris (pH = 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCI 2, 1% Triton X-100, 10% (tömeg / térfogat) glicerin, 1 mM EDTA-t , 1 mM ditiotreitol kiegészített proteáz és foszfatáz inhibitor koktél
Táblázat közös pufferek és azok pH-tartományban. Általában ezek a pufferek általában használnak 20-50 mM koncentrációkban.

ütköző pH-tartományban
Citromsav – Naoh 2,2 – 6,5
nátrium-citrát – Citromsav 3,0 – 6,2
Nátrium-acetát – ecetsav 3,6 – 5,6
Cacodylic-nátriumsó – Hcl 5,0 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
Nátrium-dihidrogén-foszfát – dinátrium-hidrogén-foszfát 5,8 – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
Mops – Koh 6,6 – 7,8
Trietanolamin hidroklorid – Naoh 6,8 – 8,8
Trisz – Hcl 7,0 – 9,0
HEPESPUFFERT – Naoh 7,2 – 8,2
tricinben – Naoh 7,6 – 8,6
nátrium-tetra – bórsav 7,6 – 9,2
bicin – Naoh 7,7 – 8,9
Glicin – Naoh 8,6 – 10,6

A legtöbb pufferek mutatnak a pH-függése a hőmérséklettel. Ez különösen igaz a Tris puffert. A pKa változik 8,06 25 ° C 8,85 0 ° C-on.
(PH és pKa egy puffer: pH méri a hidrogénionok koncentrációját a vizes oldatban. PKa (= sav disszociációs állandó) egy rokon, de több, külön intézkedést, hogy segít megjósolni, hogy egy olyan molekula fog működni egy adott PH érték.)

TRIzol címere

TRIzol egy kémiai oldat extrahálására használt RNS / DNS / fehérje során a guanidin-tiocianát-fenol-kloroformos extrakcióval. A használata ultrahanggal támogatott TRIzol extrakciós eredményez magas DNS, RNS és fehérje hozama ugyanabból a mintából, és kiemelkedik ezáltal más extrakciós módszerekkel.