Ultrahangos fehérje extrakció szövetből és sejtkultúrákból
- A fehérjeextrakció a proteomika alapvető mintaelőkészítési lépése.
- A fehérjék növényi és állati szövetekből, élesztőkből és mikroorganizmusokból nyerhetők ki.
- Sonication egy megbízható, hatékony fehérje extrakciós módszer, amely magas fehérje hozamot biztosít rövid extrakciós idő alatt.
Fehérje kivonás szövetekből és sejtekből
A fehérjék szövetekből és tenyésztett sejtekből történő kivonása alapvető mintaelőkészítési lépés, amelyet számos biokémiai és analitikai technika, például ELISA, PAGE, Western blot , tömegspektrometria vagy fehérjetisztítás során végeznek. Az ultrahangos sejtzavar, a lízis és az extrakció pontosan szabályozható, nem termikus technika a fehérjék magas hozamának biztosítására.
Fehérje extrakció sejtekből a ultrahangos szonda UP200St
- Gyors
- magas hozamok
- Rendkívül hatékony
- A paraméterek pontos ellenőrzése
- reprodukálható eredmények
- lineáris méretezhetőség
Általános utasítások ultrahangos lízishez és fehérje extrakcióhoz
- Hőmérséklet-szabályozás: A termikus denaturáció nélküli magas fehérjehozam biztosítása érdekében az extrakció során a hőmérsékletet ellenőrizni kell. A Hielscher legmodernebb ultrahangos homogenizátorai – Más néven ultrahangos szétesés vagy ultrahang – pontosan szabályozhatók. Dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel vannak ellátva. Az ultrahangos homogenizátor beállítási lehetőségeiben beállítható a maximális hőmérséklet. Amikor eléri ezt a hőmérsékletet maximális, az ultrahangos készülék automatikusan leáll, amíg a minta lehűl.
- Puffer: A megfelelő puffer kiválasztása és a megfelelő puffertérfogat szövetenként változik, és próba-hiba teszteléssel kell kitalálni.
- Izolálás / tisztítás: A fehérje lizátumok felesleges biomolekulákat, például DNS-t vagy szénhidrátokat tartalmazhatnak, amelyek fehérje kicsapással (deoxikolát-triklór-ecetsav) vagy puffercserével eltávolíthatók.
Chittapalo és Noomhorm (2009) tanulmányukban arról számoltak be, hogy a fehérjehozam szonikálással nőtt, és hogy az ultrahangos szövethomogenizációs és lízis folyamat jelentősen javíthatja a meglévő extrakciós folyamatokat – új kereskedelmi kitermelési lehetőségek lehetővé tétele.
Ultrahangos CupHorn több minta egyidejű, nagy hatékonyságú mintaelőkészítésére azonos körülmények között fehérjeizolálás és DNS-fragmentáció céljából.
Fehérje kivonás állati szövetből
Teljes méretű szövetek (pl. vese, szív, tüdő, izom stb.) előkészítéséhez a szövetet tiszta szerszámokkal, lehetőleg jégen és a lehető leggyorsabban nagyon apró darabokra kell boncolni, hogy megakadályozzuk a proteázok (pl. lízispuffer, például RIPA vagy proteázt és foszfatázgátló koktélt tartalmazó hipotóniás lízispuffer) általi lebomlást. A boncolás után a mintát folyékony nitrogénbe merítik a pillanatnyi fagyasztás érdekében. A minta tárolható -80 ° C-on későbbi felhasználás céljából, vagy jégen tárolható azonnali homogenizálás céljából. Közvetlenül az ultrahangos extrakció előtt jéghideg lízis puffert (DTT, leupeptin és aprotinin proteázgátlókkal) gyorsan hozzáadunk a mintacsőhöz (~ 10 mg szövetenként kb. ~ 600 μL puffer ajánlott). Mintacsövenként kb. 20-60 mg szövet ajánlott.
Az ultrahangos homogenizálást, lízist és extrakciót ultrahangos homogenizátorral, például a UP100H vagy UP200Ht, mikro-csúcs sonotrode-val felszerelve. Az ultrahangos időtartam 60-90 mp. ultrahangos ciklus üzemmódban 15 másodperc. szonikálás és 10 másodperc. nyugalmi idő. A mintát folyamatosan jégben kell tartani.
Ultrahangos homogenizálás / extrakció után a lizátumot centrifugáljuk 27 000 g-on kb. 20 perc. Ezután összegyűjtik a felülúszót, hogy a fehérjekoncentrációt fehérjevizsgálattal, például BCA Pierce-fehérjevizsgálattal lehessen meghatározni.
Fehérje extrakció vérszérumból
A szérum és a foszfátpuffer homogén keverékéhez a mintát először az ultrahangos sejtlízis előtt örvényezzük. Az ultrahangos lízishez a mintát ultrahangos laboratóriumi homogenizátorral, például a UP100H 8 ciklusban 20% -os amplitúdóval, minden 5 másodperces ciklusban be és 15 másodpercig. A fehérje extrakciót ciklusokban (pulzálási mód) ultrahangos kezeléssel végezzük, és a mintát jégre helyezzük, hogy elkerüljük a minta túlmelegedését és termikus lebomlását. Mivel a szérum nagy mennyiségű nagy molekulatömegű fehérjét tartalmaz (például albumint, α1-antitripszint, transzferrint, haptoglobulint, immunglobulin G-t és immunglobulin A-t), amelyek zavarják az alacsony molekulatömegű fehérjék elválasztását az IEF során, ajánlatos azokat a szérumból kimeríteni egy kimerülő oszlop segítségével.
Fehérje extrakció növényi szövetből
Friss, lágy növényi szövet, pl. moha stb., Könnyen megzavarható, ha egyszerűen az apróra vágott mintaanyagot lízis pufferbe helyezzük szonikáláshoz. A kemény, ligenás növényi szöveteket, például magokat, fenyőtűket stb. szárazon kell őrölni. Néhány kemény, fás növényi anyagot le kell fagyasztani és folyékony nitrogénben őrölni, mielőtt ultrahangos kezeléssel extrahálnánk. Növényi sejtkultúra szuszpenziók esetében többnyire elegendő az ultrahangos kezelés 30 és 150 másodperc között lízispufferben. A keményebb anyag, például a tökmag intenzívebb szonikálást igényel az alábbiakban leírtak szerint.
Protokoll az albumin ultrahangos extrakciójához tökmagból
Az albumin finomra őrölt tökmagporból történő ultrahangos fehérjekivonásához oldószerként 10 g zsírtalanított tökmagport és 100 ml ionmentes vizet adunk hozzá egy 250 ml-es üvegpohárba. A fehérje extrakció két lépésből áll: Először is, a mintát ultrahanggal kezeljük szonda típusú ultrahangos készülék UP400St (400W, 24kHz) felszerelt sonotrode S24d7. Az ultrahangos homogenizálás során az üvegpoharat hideg vízfürdőbe helyezzük. A dugaszolható hőmérséklet-érzékelő és az ultrahangos készülék hőmérséklet-szabályozási beállításai UP400St biztosítják, hogy a minta hőmérséklete mindig 30 ° C alatt maradjon. Az ultrahangos kezelés során a pontos hőmérséklet-szabályozással elkerülhető az albumin denaturációja. Másodszor, az extrakciót keverővel végeztük 200 fordulat / perc sebességgel és 30 ° C-on. Ezután a főzőpoharat termosztatikus rázógépbe helyezik. A globulint desztillált vízzel végzett dialízissel távolítják el. A globulin eltávolítása után a fehérjekivonatból mintát lehet venni az albuminprofil meghatározása céljából, majd az albumin koagulációhoz 0,1 M HCl felhasználásával pI = 3,0 értékre állíthatjuk be. A szilárd fázist 5000 g-os 20 °C-os centrifugálással választják szét, majd ionmentes vízben oldják fel. Az albumin koagulációt kétszer végezzük, hogy növeljük a fehérje arányát az albumin koncentrátumban.
Ultrahangos lúgos fehérje extrakció előállításához fehérjekoncentrátum rizskorpa azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelés magasabb fehérjehozamot eredményez lényegesen rövidebb extrakciós idő alatt – a hagyományos extrakciós módszerekhez képest.
Mintaelőkészítési protokoll funkcionális iNOS enzimhez
A teljesen működőképes iNOS enzim előállításához (pl. gyógyszerszűréshez) a következő protokoll ajánlott: A sejtszuszpenziót jégre kell helyezni, és ultrahanggal kell kezelni UP100H 10μm amplitúdóval ciklus üzemmódban 5 másodperces szonikálás és 25 másodperc. nyugalmi jégen. Az eljárást kb. 3-szor meg kell ismételni. Az szonikációs ciklusok közötti pihenőidő csökkenti a hőmérséklet-emelkedést, és ezáltal csökkenti a denaturáció kockázatát.
ultrahangos fehérje oldódás
A szonikálás felgyorsíthatja a fehérje oldódási folyamatát, amely általában több órát igényel. Annak érdekében, hogy ne melegítsük túl a mintát, és megakadályozzuk a fehérje lebomlását és a karbamidot tartalmazó oldatok módosítását, az ultrahangos kitörések nem tarthatnak tovább néhány másodpercnél.
Ultrahangos UP200Ht 2 mm-es mikrotip S26d2 kis minták ultrahangos kezelésére.
Ultrahangos berendezés fehérje extrakcióhoz
A Hielscher Ultrasonics ultrahangos homogenizátorok széles választékát kínálja a sejtek, szövetek, baktériumok, mikroorganizmusok, élesztő és spórák szétesésére.
A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékek erősek és könnyen kezelhetők. 24/7 működésre készültek, robusztus és hatékony laboratóriumi és asztali eszközökként tervezték őket. Minden eszköz esetében pontosan szabályozható az energiakibocsátás és az amplitúdó. A tartozékok széles választéka további beállítási lehetőségeket nyit meg. A digitális ultrahangos készülékek, mint például a VialTweeter, UP200Ht, UP200St, és UP400St beépített hőmérséklet-szabályozással és beépített SD-kártyával rendelkeznek az automatikus adatrögzítéshez.
Több minta közvetett, keresztszennyeződés-mentes és egyidejű szonikálásához kínáljuk a VialTweeter vagy az ultrahangos CupHorn.
Az alábbi táblázat áttekintést nyújt ultrahangos készülékeinkről a minta előkészítéséhez, a sejtek megszakításához és az extrakcióhoz. Kattintson az eszköz típusára, hogy további információkat kapjon az egyes ultrahangos homogenizátorokról. Jól képzett és sokéves tapasztalattal rendelkező technikai személyzetünk örömmel segít kiválasztani a legmegfelelőbb ultrahangos készüléket a minta előkészítéséhez!
| Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség | Ajánlott eszközök |
|---|---|---|
| legfeljebb 10 injekciós üveg vagy tubus | n.a. | VialMagassugárzó |
| Multiwell / mikrotiter lemezek | n.a. | UIP400MTP |
| több cső / edény | n.a. | Cuphorn |
| 1–500 ml | 10–200 ml/perc | UP100H |
| 10–1000 ml | 20–200 ml/perc | UP200Ht, UP200St |
| 10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc | UP400ST |
Az alkalmazástól, az anyagtól és a minta mennyiségétől függően a mintaelőkészítéshez legmegfelelőbb beállítást javasoljuk. Vegye fel velünk a kapcsolatot még ma!
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!
A Hielscher digitális ultrahangos készülékek böngésző távirányítóval és automatikus adatprotokollal rendelkeznek egy integrált SD-kártyán.
VialMagassugárzó közvetett szonikáláshoz.
Tények, amelyeket érdemes tudni
Proteomika
A proteomika az a kutatási terület, amely a fehérjéket és a proteomot vizsgálja. A fehérjék számos létfontosságú funkciót látnak el az organizmusokban. A proteom a fehérjék teljes halmaza, amelyet egy genom, sejt, szövet vagy szervezet fejez ki egy bizonyos időpontban. A proteom változik az idő és a különböző követelmények vagy stresszek függvényében, amelyeken egy sejt vagy szervezet keresztülmegy. Pontosabban, ez az expresszált fehérjék halmaza egy adott típusú sejtben vagy szervezetben, egy adott időpontban, meghatározott körülmények között. A kifejezés fehérjék és genom keveréke. A proteomika a proteom tanulmányozása.
fehérje
A fehérjék nagy biomolekulák, úgynevezett makromolekulák – amelyek aminosavmaradékok egy vagy több hosszú láncából állnak. A fehérjék minden növényi és állati eredetű szervezetben jelen vannak, és kulcsfontosságúak a legtöbb biológiai funkcióhoz. Mivel a fehérjék sok biológiai információt tartalmaznak, analitikai célokra, például proteomikai kutatásokhoz nyerik ki őket. A fehérjék legfontosabb funkciói közé tartozik az anyagcsere-reakciók katalízise, a DNS-replikáció, az ingerekre adott válasz és a molekulák egyik helyről a másikra történő szállítása. A fehérjék elsősorban az aminosavak szekvenciájában különböznek egymástól, amelyet génjeik nukleotidszekvenciája diktál, és amely általában azt eredményezi, hogy a fehérje egy specifikus háromdimenziós szerkezetbe hajtódik, amely meghatározza annak aktivitását. A fehérjék – a peptidek mellett – Az élelmiszer egyik legfontosabb összetevője. Ezért a proteomika hatékony eszköz az élelmiszertudományban a folyamatok, az élelmiszerbiztonság és a tápértékbecslés optimalizálására.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction az analitek elkülönítésére és prekoncetrálására szolgáló preanalitikai eljárás. Az ultrahangos kezeléssel kombinálva a felhőpont kivonása fokozható, így a folyamat hatékonyabb, gyorsabb, és környezetbarátabb. Az ultrahangos kezelés, felhőpont extrakció lényegesen hatékonyabb módszer az analit előkészítése. További információ ultrahanggal segített felhőpont kivonás!Gél elektroforézis
A gélelektroforézis a makromolekulák, például a DNS, az RNS és a fehérjék, valamint fragmenseik elválasztásának és elemzésének fő módszere, méretük és töltésük alapján. A klinikai kémiában a fehérjék töltés és/vagy méret szerinti szétválasztására használják (IEF agaróz, lényegében méretfüggetlen), a biokémiában pedig a molekuláris biológiában és a proteomikában a DNS- és RNS-fragmensek kevert populációjának hossz szerinti elkülönítésére, a DNS- és RNS-fragmensek méretének becslésére vagy a fehérjék töltéssel történő szétválasztására.
sejtkultúrák
A sejtkultúra az a kontrollált növekedési folyamat, amelynek során a sejteket ellenőrzött körülmények között tenyésztik. A sejtkultúra körülményei sejttípusonként eltérőek. Általában a sejtkultúra környezete egy megfelelő edényből (pl. Petri-csésze) áll, amelynek szubsztrátja vagy táptalaja biztosítja az esszenciális tápanyagokat (aminosavak, szénhidrátok, vitaminok, ásványi anyagok), növekedési faktorokat, hormonokat és gázokat (CO2, O2), és szabályozza a fizio-kémiai környezetet (pH-puffer, ozmotikus nyomás, hőmérséklet). A legtöbb sejtnek felületre vagy mesterséges szubsztrátumra van szüksége, míg más sejtkultúrák szabadon lebeghetnek a táptalajban (szuszpenziós tenyészet, sejtszuszpenzió).
Az állati sejtvonalak tömegkultúráit vírusvakcinák és más biotechnológiai eredetű termékek ipari előállítására használják. Az emberi őssejteket tenyésztik, hogy bővítsék a sejtek számát, és a sejteket különböző szomatikus sejttípusokká differenciálják transzplantációs célokra.
Szövetminták
A szövet kifejezés olyan sejtközi terméket ír le, ahol a sejtanyag szervezeti szinten van a sejtek és a teljes szerv között. A szövetben hasonló sejteket állítanak össze, amelyek ugyanolyan eredetűek, amelyek együttesen egy adott funkciót látnak el. Több szövet funkcionális csoportosításával kialakulnak a szervek összetett szerkezetei.
A szövetmintákat biológiai, szövettani / hisztopatológiai, parazitológiai, biokémiai, immunhisztokémiai kutatásokhoz, valamint a DNS tenyésztéséhez és kivonásához mintavételezzük. Megkülönböztethető állati (alosztály: emlős szövet) és növényi szövet között. Az állati szöveteket a kötőszövet, az izom, az ideg és az epiteliális szövet négy alapvető típusába csoportosítják. A növényi szövet a következő három szövetrendszerre oszlik: az epidermisz, az őrölt szövet és az érszövet.
Szövetmintákat állati vagy növényi részekből, pl. csontból, izomból, levelekből stb. lehet készíteni.
Testnedvek
A vér, a szérum, a plazma, a cerebrospinális folyadék, a nyál és az ízületi folyadék testnedvek, amelyek nagyszerű diagnosztikai információforrást kínálnak. Ezért fontos a testfolyadékminták kifinomult előkészítése az elemzéshez. Az első nehézség a testfolyadékokban jelen lévő összetevők széles dinamikatartományához kapcsolódik.
A fehérjekoncentráció meghatározása
A Bradford-vizsgálat, a Lowry-vizsgálat és a bicinchoninsav-vizsgálat (BCA) gyakori vizsgálatok a fehérjék koncentrációjának meghatározására. A szarvasmarha szérumalbumin (BSA) az egyik leggyakrabban használt fehérjestandard.
lízis puffer
A lízispuffert a sejtanyagnak vagy szövetnek (szövetkultúra, növény, baktériumok, gombák stb.) és annak megfelelően kell kiválasztani, hogy a sejtek szerkezetben vannak-e, valamint a szerkezet típusa szerint. A fehérjék, membránok és organellák kivonására szolgáló lízispufferek széles skáláját egy vagy több mosószerrel állítják elő. A mosószert általában próba-hiba tesztekkel választják ki, vagy – ha rendelkezésre áll – egy meglévő fehérjekivonási protokoll szerint. A mosószernek kompatibilisnek kell lennie a szöveti forrással és a fehérjékkel. Általában a legenyhébb mosószert választják, amely egy adott szövetre / fehérjére működik, hogy fenntartsák a kivonat maximális funkcionalitását. Továbbá, membránok és organellák extrakciója esetén az enyhe mosószer sértetlenül tartja a membránt. A lízispufferekben gyakran használt mosószerek többnyire nem ionosak vagy zwitterionosak, pl. CHAPS, deoxikolát, Triton™ X-100, NP40 és Tween 20.
Például az olyan szövetek, mint az agy, a máj, a bél, a vese, a lép stb. egyszerűen pufferelhetők RIPA-val – azonban proteázgátlókat és DTT-t (pl. gélelektroforézishez) is be kell vonni.
Lízispuffer a vázizomszövethez (jéghideg): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10 % (w/v) glicerin, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol proteáz és foszfatáz inhibitor koktéllal kiegészítve
A közös pufferek táblázata és pH-tartományuk. Általában ezeket a puffereket általában 20-50 mM koncentrációban használják.
| puffer | pH-tartomány |
|---|---|
| Citromsav – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Nátrium-citrát – Citromsav | 3.0 – 6.2 |
| Nátrium-acetát – ecetsav | 3.6 – 5.6 |
| Kakodilsav-nátriumsó – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Nátrium-dihidrogén-foszfát – dinátrium-hidrogén-foszfát | 5.8 – 8.0 |
| Imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanol-amin-hidroklorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Trisz – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| tricin – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Nátrium-tetraborát – bórsav | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
A legtöbb puffer pH-függőséget mutat a hőmérséklettel. Ez különösen igaz a Tris pufferekre. A pKa 25°C-on 8,06-ról 0°C-on 8,85-re változik.
(A puffer pH-ja és pKa-ja: A pH a hidrogénionok koncentrációját méri vizes oldatban. pKa (= savas disszociációs állandó) egy kapcsolódó, de specifikusabb mérőszám, mivel segít megjósolni, hogy egy molekula hogyan fog működni egy adott pH-értéken.)
TRIzol
A TRIzol egy kémiai oldat, amelyet RNS/DNS/fehérje kivonására használnak a guanidinium-tiocianát-fenol-kloroform extrakció során. Az ultrahanggal segített TRIzol extrakció alkalmazása magas DNS-, RNS- és fehérjehozamot eredményez ugyanabból a mintából, és ezáltal más extrakciós módszereket is kimutat.
Irodalom/Hivatkozások
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.