Ultrahangos lízis Western-blot vizsgálathoz

• A Western-blot olyan analitikai eljárás, amely szövethomogenizátum- vagy sejtkivonatmintában található specifikus fehérjék kimutatására szolgál.
• A Western-blot elvégzéséhez vagy az enzimaktivitás méréséhez számos vizsgálat megköveteli a sejtbe zárt anyagokhoz (pl. fehérjékhez, DNS-hez, szubcelluláris fragmentumokhoz) való hozzáférést.
• Az ultrahangos kezelés megbízható és könnyen alkalmazható módszer a szabályozott sejtfeltáráshoz és lízishez.

Ultrahangos sejtfeltárás

A fehérjék kivonása szövetekből és tenyésztett sejtekből számos biológiai, biokémiai és analitikai technika (PAGE, Western-blot, ELISA, tömegspektrometria stb.), illetve a fehérjetisztítás első lépése. A nagy fehérjehozam eléréséhez a sejtanyagot és a szövetet hatékonyan fel kell tárni, illetve lizálni kell. Akár növényi sejtről, akár állati szövetről van szó, az ultrahangos kezelés az a módszer, amellyel egyszerűen és gyorsan elkészítheti sejtlizátumát.

Az ultrahangos kezelés előnyei

• gyors és hatékony
• egyszerű kezelés
• nagy fehérjehozam
• reprodukálható/ megismételhető
• pontosan szabályozható
• méretezhető

Immunprecipitációs protokoll Western-immunblot vizsgálathoz

A. Reagensek

Az oldatok elkészítéséhez használjon tisztított vizet, például Milli-Q vizet.

• 1X foszfátpufferelt sóoldat (PBS)
• 1X sejtlízispuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM β-glicerofoszfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Fontos: Közvetlenül a felhasználás előtt adjon hozzá 1 mM PMSF-et.
• 15 μl protein A+15 μl protein G elegendő az IP-hez, de ez az elsődleges antitesttől és a minta térfogatától függhet. Előre összekevert protein A/ G agarózt is használhat (pl. protein A-t a nyúl-IgG, protein G-t pedig az egér-IgG affinitásalapú kinyeréséhez)
• 3X SDS-mintapuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25°C-on), 6% w/v SDS, 30% glicerin, 150 mM DTT, 0,03% w/v brómfenolkék

B. Sejtlizátumok előkészítése

• Gyűjtse be a sejteket. A sejtek nem denaturáló körülmények közötti begyűjtéséhez távolítsa el a tápközeget, és öblítse le a sejteket egyszer jéghideg PBS-sel.
• Távolítsa el a PBS-t, adjon minden lemezhez (10 cm) 0,5 ml jéghideg 1X sejtlízispuffert, majd inkubálja a lemezeket jégen 5 percig.
• Kaparja le a sejteket a lemezekről, és helyezze át őket mikrocentrifuga-csövekbe. Tartsa jégen.
• Végezzen kétszer 10 másodperces ultrahangos kezelést jéghideg immunprecipitációs pufferben (IP-puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 és a proteázgátló-keverék). Az ultrahangos kezeléshez a VialTweeter vagy egy szondás ultrahangos készülék, például az UP100H vagy az UP200Ht , a legalkalmasabb.
• Centrifugálja a lizátumokat 15 000 g mellett 10 percig 4°C-on.
• Helyezze át a felülúszót egy új csőbe. (Szükség esetén a lizátum –80°C-on tárolható.)
• Adja az elsődleges antitestet a felülúszóhoz. Az elsődleges antitestet tartalmazó felülúszót 1 h időtartamig inkubáljuk 4°C-on, enyhe keverés mellett. Az elsődleges antitestet általában a Western-blot vizsgálathoz használtnál 10x nagyobb koncentrációban adjuk hozzá. (Kiindulásként 100μL-enként 1μg-ot használhat.)
• Ezután a felülúszót azonos mennyiségű protein A-agaróz (Invitrogen) és protein G-agaróz keverékével további 1 h időtartamig inkubáljuk.
• Mossa át az agarózüledékeket háromszor IP-pufferrel. Ezután vonja ki a kötött fehérjéket SDS-PAGE felviteli pufferrel, 95°C-on 5 percig melegítve.

C. Immunprecipitáció

• Vegyen 200 μl sejtlizátumot, és adjon hozzá elsődleges antitestet. Inkubálja enyhe billentő rázatás mellett egy éjszakán át 4°C-on.
• Adjon hozzá protein A- vagy protein G-agarózgyöngyöket (20 μl-t az 50%-os gyöngyszuszpenzióból). Inkubálja enyhe billentő rázatás mellett 1–3 órán át 4°C-on.
• Centrifugálja mikrocentrifugában 30 másodpercig 4°C-on. Mossa át az üledéket ötször 500 µl 1X sejtlízispufferrel. A mosások során tartsa jégen.
• Szuszpendálja újra az üledéket 20 μl 3X SDS-mintapufferben. Keverje vortexkeverővel, majd centrifugálja mikrocentrifugában 30 másodpercig.
• Melegítse a mintát 95–100°C-ra 2–5 percig, majd centrifugálja mikrocentrifugában 1 percig 14 000 X g mellett.
• Vigye fel a mintát (15–30 μl) SDS-PAGE gélre (12–15%).
• Elemezze a mintát Western-blot vizsgálattal.

Western-blot elemzés az UP50H ultrahangos készülékkel

Kriebisch és munkatársai (2011) tanulmányában az alábbi, UP50H szondás ultrahangos készüléket alkalmazó protokollt használták:
Az összfehérjét olyan MC3T3-E1 sejtekből izolálták, amelyeket 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) vegyülettel vagy vivőanyaggal kezeltek. A sejteket olyan pufferrel lizálták, amely 50 mM Tris HCl-t, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl-t (Fisher Scientific); 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630-at (Sigma-Aldrich) és 0,5% nátrium-dezoxikolátot (Merck) tartalmazott. A sejtlizátumot 2 × 10 s időtartamú ultrahangos kezelésnek vetették alá, 1-es ciklusbeállítás és 80-as amplitúdó mellett, a következő készülékkel: UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Németország). Ezt követően az anyagot 10 min időtartamig centrifugálták 14 000 rpm mellett, és a felülúszót használták a Western-blot vizsgálathoz. Huszonöt μg fehérjét forraltak mintapufferben és redukálószerben (Invitrogen), majd SDS-PAGE módszerrel, 4–12%-os poliakrilamid géleken (Invitrogen) elválasztották, és nitrocellulóz membránra (GE health care) vitték át. A membránt 1 h időtartamig blokkolták 1% kazeint (Sigma-Aldrich) és 1% Tris-t (1 M) tartalmazó TBS-sel (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl). A blokkolás után a membránt enyhe keverés mellett egy éjszakán át 4°C-on inkubálták az elsődleges antitesttel (nyúlban termelt, humán CBS elleni antitest, 1/500, R. Banerjee professzor laboratóriumában kifejlesztve, Ann Arbor, MI, USA). A tormaperoxidázzal (HPR) konjugált másodlagos antitesttel (Dako) végzett inkubálás 1 h időtartamig, szobahőmérsékleten történt. Minden blotot fokozott kemilumineszcenciával (Perkin Elmer) hívtak elő.
 

Kattintson ide, és olvasson bővebben az ultrahangos sejtlízis és extrakció bevált gyakorlatairól, a lizátumok előkészítéséről és a folyamat javítására vonatkozó ajánlásokról!
 
Az alábbi táblázat tájékoztatást nyújt laboratóriumi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról:

Szakirodalom / Hivatkozások

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.