Ultrahangos lízis a Western Blottinghoz
- A western blot egy analitikai eljárás specifikus fehérjék kimutatására szövethomogenizátum vagy sejtkivonat mintájában.
- A Western blot futtatásához vagy az enzimaktivitás méréséhez sok vizsgálatnak hozzá kell férnie a sejtben csapdába esett anyagokhoz (pl. fehérjék, DNS, szubcelluláris fragmensek).
- Sonication egy megbízható és könnyen kezelhető módszer szabályozott sejtzavar és lízis.
Ultrahangos cellazavarás
A fehérjék szövetekből és tenyésztett sejtekből történő kivonása az első lépés számos biológiai, biokémiai és analitikai technika (PAGE, Western blot készítés, ELISA, tömegspektrometria stb.) vagy fehérjetisztítás felé. A magas fehérjehozam eléréséhez a sejtanyagot és a szövetet hatékonyan meg kell zavarni / lizálni. Akár növényi sejt, akár állati szövet, szonikálás a módszer a sejt lizátum könnyű és gyors előkészítésére.
A szonikáció előnyei
- gyors & Hatékony
- Könnyű kezelhetőség
- magas fehérjehozam
- reprodukálható/ megismételhető
- precízen szabályozható
- Méretezhető

VialTweeter szonikátor ultrahangos mintaelőkészítéshez, például sejtzavarokhoz és fehérjeizoláláshoz
Immunprecipitációs protokoll a nyugati immunoblot számára
A. Reagensek
Az oldatok elkészítéséhez használjon tisztított vizet, például Milli-Q-t.
- 1X foszfátpufferes sóoldat (PBS)
- 1X sejtlízis puffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM β-glicerofoszfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
Fontos: Közvetlenül használat előtt adjon hozzá 1 mM PMSF-et. - 15 μl Protein A+15 μl A protein G elegendő az IP-hez, de ez függhet az elsődleges antitesttől és a minta mennyiségétől. Használhat előre kevert A/G agaróz fehérjét is (pl. A fehérje nyúl IgG lehúzáshoz és Protein G egér IgG lehúzáshoz)
- 3X SDS minta puffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25 ° C-on), 6 tömeg / V SDS, 30% glicerin, 150 mM DTT, 0,03 tömeg% brómfenol kék
B. Sejtlizátumok előállítása
- Gyűjtsük be a sejteket. A sejtek nem denaturáló körülmények között történő betakarításához távolítsa el a táptalajt és öblítse le a sejteket egyszer jéghideg PBS-sel.
- Távolítsuk el a PBS-t, adjunk 0,5 ml jéghideg 1X sejtlízis puffert minden lemezre (10 cm), és inkubáljuk a lemezeket jégen 5 percig.
- Kaparja le a sejteket a lemezekről, és tegye át mikrocentrifugacsövekbe. Tartsa jégen.
- Szonikáljon kétszer 10 másodpercig jéghideg immunprecipitációs pufferben (IP puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 és a proteáz inhibitor keverék). Az ultrahangos kezeléshez a VialMagassugárzó vagy egy szonda ultrahangos készülék, például a UP100H vagy UP200Ht a legmegfelelőbbek.
- Centrifugáljuk a lizátumokat 15 000 g-vel 10 percig 4 °C-on.
- Vigyük át a felülúszót egy új csőbe. (Szükség esetén a lizátum –80°C-on tárolható.)
- Adja hozzá az elsődleges ellenanyagot a felülúszóhoz. Az elsődleges ellenanyaggal rendelkező felülúszót 1 órán át 4°C-on, könnyű keverés mellett inkubáljuk. Az elsődleges antitestet általában 10x koncentráltabb mennyiségben adják hozzá, mint a nyugati blot esetében. (Kezdheti 1 μg / 100 μl-rel.)
- A felülúszót ezután egyenlő mennyiségű A-agaróz fehérje (Invitrogén) és fehérje G agaróz keverékével további 1 órán keresztül inkubáljuk.
- Mossuk át háromszor az agaróz pelleteket IP pufferrel. Ezután extraháljuk a kötött fehérjéket az SDS-PAGE töltőpufferrel 95 °C-on 5 percig tartó melegítéssel.
C. Immunprecipitáció
- Vegyünk 200 μl sejtlizátumot, és adjunk hozzá primer ellenanyagot. Inkubáljuk enyhe ringatással egy éjszakán át 4°C-on.
- Adjunk hozzá A vagy G agaróz fehérjét (20 μl 50%-os gyöngyszuszpenziót). Inkubáljuk gyengéd ringatással 1-3 órán át 4°C-on.
- Mikrocentrifugáljuk 30 másodpercig 4°C-on. Mossuk ki a pelletet ötször 500 μl 1X sejtlízis pufferrel. Mosás közben tartsa jégen.
- Szuszpendáljuk újra a pelletet 20 μl 3X SDS mintapufferrel. Örvény, majd mikrocentrifugálás 30 másodpercig.
- Melegítsük a mintát 95–100 °C-ra 2–5 percig, majd mikrocentrifugáljuk 1 percig 14 000 × g-on.
- Töltse fel a mintát (15–30 μl) SDS-PAGE gélre (12–15%).
- Elemezze a mintát Western blottinggal.
Western Blot elemzés a Sonicator UP50H-val
Az UP50H szonda típusú szonda típusú szondázó protokollt használtuk Kriebisch et al. (2011) tanulmányozásához:
Az összes fehérjét 1,25(OH)2D3 (10−8 M) vagy jármű. A sejteket 50 mM Tris HCl-t tartalmazó pufferrel lizáltuk, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) és 0,5% nátrium-deoxikolát (Merck). A sejt lizátumot ultrahangos ultrahangos 2 × 10 másodpercig az 1. ciklusban és az amplitúdó 80 a UP50H ultrahangos processzor (Hielscher, ultrahang technológia, Teltow, Németország). Ezután az anyagot 10 percig centrifugálták 14 000 fordulat / perc sebességgel, és a felülúszót Western blot készítésére használták. Huszonöt μg fehérjét forraltunk mintapufferben és redukálószerben (Invitrogen), majd SDS-PAGE-vel elválasztottuk 4–12% poliakrilamid gélekkel (Invitrogen), és nitrocellulóz membránba vittük (GE egészségügyi ellátás). A membránt 1 órán keresztül TBS-sel (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) blokkoltuk, amely 1% kazeint (Sigma-Aldrich) és 1% Tris-t (1 M) tartalmazott. Blokkolás után a membránt enyhe rázogatással egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk az elsődleges ellenanyaggal (nyúl anti-humán CBS 1/500, Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) laboratóriumában fejlesztették ki. Tormaperoxidázzal (HPR) konjugált másodlagos ellenanyaggal (Dako) végzett inkubálást szobahőmérsékleten 1 órán át végeztünk. Minden blotot fokozott kemilumineszcenciával (Perkin Elmer) fejlesztettek ki.
Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni az ultrahangos sejtlízis és extrakció legjobb gyakorlatairól, a lizátum előkészítéséről és a folyamat javítására vonatkozó ajánlásokról!
Az alábbi táblázat jelzi laboratóriumi méretű ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását:
Ajánlott eszközök | Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség |
---|---|---|
UIP400MTP 96 lyukú lemezes szonikátor | Több lyukú / mikrotiter lemezek | n.a. |
Ultrahangos CupHorn | CupHorn injekciós üvegekhez vagy főzőpohárhoz | n.a. |
GDmini2 | ultrahangos mikro-flow reaktor | n.a. |
VialMagassugárzó | 0.5-től 1,5 ml-ig | n.a. |
UP100H | 1–500 ml | 10–200 ml/perc |
UP200Ht, UP200St | 10–1000 ml | 20–200 ml/perc |
UP400ST | 10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc |
Ultrahangos szitarázó | n.a. | n.a. |
Kapcsolat! / Kérdezzen tőlünk!

UIP400MTP lemezes szonikátor 96-lyukú lemezek nagy áteresztőképességű szonikálásához
A Western Blotingról
A blotok olyan analitikai eljárások, ahol a DNS, az RNS és a fehérjék átkerülnek egy hordozóra, hogy elválaszthatók legyenek.
A déli blotot a DNS, az északi foltot az RNS és a nyugati blotot a fehérjék kimutatására használják.
A nyugati blot fehérje immunoblot néven is ismert, mivel egy antitestet használnak az antigén specifikus kimutatására. A Western Blotting az egyik legfontosabb elemzési módszer a mintában lévő specifikus fehérjék kimutatására. A Western blotban a fehérjéket membránokra immobilizálják, hogy monoklonális vagy poliklonális antitestekkel kimutassák őket.
Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) a natív fehérjéket 3-D szerkezettel, a denaturált fehérjéket pedig a polipeptid hosszával választjuk el. A fehérjéket ezután egy membránra (jellemzően nitrocellulózra vagy PVDF-re) viszik át, ahol a célfehérjére specifikus antitestekkel festik őket. A gélelektroforézis lépése szerepel a western blot analízisben, hogy megoldja az antitestek keresztreaktivitásának kérdését.
Ezután az elválasztott fehérjéket mátrixra blottálják (többnyire nitrocellulóz vagy PVDF membránon), ahol antitestekkel festik őket. Az antitestek szondaként működnek, és specifikusan a célfehérjére szelektálódnak. A specifikus reakció helyének és intenzitásának elemzése feltárja a célfehérjék expressziós részleteit az adott mintában. A Western blotting képes kimutatni a célfehérjét, amely akár 1ng is lehet a gélelektroforézis nagy felbontása és az immunvizsgálat erős specifitása és nagy érzékenysége miatt. A Western blot módszert molekuláris biológiában, biokémiában, immungenetikában és más molekuláris kutatási területeken használják.
Egyéb kapcsolódó technikák közé tartozik a dot blot analízis, az immunhisztokémia és az immuncitokémia, ahol antitesteket használnak a fehérjék kimutatására a szövetekben és sejtekben immunfestéssel, valamint enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA).
Irodalom / Hivatkozások
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter szonikátor több injekciós üveg egyidejű mintaelőkészítéséhez