Ultrahangos lízis Western-blot

• A Western-blot egy analitikai eljárás kimutatására specifikus fehérjék egy mintában szövet-homogenizátumot, vagy sejtkivonatot.
• Futtatásához Western-blot vagy enzimaktivitásának mérése, számos vizsgálati hozzáférés szükséges anyagok (például fehérjék, DNS, szubcelluláris fragmentumok) befogtuk a sejtben.
• Az ultrahangos kezelés egy megbízható és könnyen kezelhető módszert mutatott sejtroncsolási és lízis.

Ultrahangos sejt szétzúzása

Fehérjeextrakció szövetekből és tenyésztett sejtek az első lépés számos biológiai, biokémiai és analitikai módszerek (PAGE, Western-blot, ELISA, tömegspektrometria, stb), vagy a fehérje tisztítását. Ahhoz, hogy a magas fehérje kitermelést, a sejtanyagot, és szöveti kell szüntethető meg hatékonyan / lizáljuk. Akár növényi sejt vagy állati szövetek, ultrahanggal az a módszer, hogy készítsen a sejtlizátumot egyszerű és gyors.

Előnyei ultrahangos kezelést

• Gyors & hatékony
• könnyű kezelhetőség
• magas fehérje hozam
• reprodukálható / ismételhető
• pontosan szabályozott
• skálázható

Immunoprecipitáció Protokoll Western immunblotolást

Reagensek

A készítmény a megoldások, használjon tisztított víz, mint a Milli-Q.

• 1X foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS)
• 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH = 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM β-glicerofoszfát, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptin
  Fontos: Adjunk hozzá 1 PMSF közvetlenül a felhasználás előtt.
• 15 ul protein A + 15 ul Protein-G elegendő IP, de függhet a primer antitest és a minta térfogata. Is használhatja előkevert protein A / G agaróz (például Protein A nyúl IgG húzza le, és Protein-G egér IgG húzza le)
• 3X SDS mintapuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH = 6,8, 25 ° C-on), 6 tömeg / térfogat% SDS, 30% glicerin, 150 mM DTT-t, 0,03 tömeg / térfogat% brómfenol-kék

B. A sejtlizátumok

• Összegyűjtöttük a sejteket. A sejtek begyűjtéséhez mellett nem denaturáló körülmények között, a táptalajt eltávolítjuk és öblítse sejteket egyszer jéghideg PBS-sel.
• PBS-t eltávolítsuk, és adjunk hozzá 0,5 ml jéghideg 1X sejtlízispufferben mindegyik lemezhez (10 cm), és inkubáljuk a lemezeket jégen 5 percig.
• A sejteket lekaparjuk ki a lemezeken, és átvisszük a mikrocentrifuga csövekbe. Tartsa jégen.
• Sonicate kétszer 10 másodpercig jéghideg immunprecipitációs pufferrel (IP pufferrel: 50 mM Tris-HCI [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA-t, 0,1% NP-40, és a proteáz inhibitor keverék). Az ultrahangos kezeléshez a VialTweeter vagy egy próba, ultraszonizálót, mint például a UP100H vagy Uf200 ः t a legalkalmasabbak.
• Centrifugáljuk a lizátumokat 15000 g-vel 10 percig 4 ° C-on.
• Töltsük át a felülúszót egy új csőbe. (Ha szükséges, lizátumot tárolható -80 ° C-on.)
• Adjuk hozzá a primer antitestet a felülúszót. A felülúszót a primer antitesttel inkubáljuk 1 órán át 4 ° C-on fényben keverés. Elsődleges antitest jellemzően olyan mennyiségben adagoljuk, 10x tömény, mint a Western-folt. (Lehet kezdeni 1 ng per 100 pl.)
• A felülúszót ezután tovább inkubáltuk az elegyet azonos mennyiségű Protein A-agaróz (Invitrogen) és Protein G agarózzal további 1 órán át.
• Mossuk ki a agaróz pellet háromszor IP pufferrel. Ezután, kivonat a megkötődött fehérjéket az SDS-PAGE mintapufferrel melegítve 95 ° C-on 5 percig.

C. Immunoprecipitáció

• Vegyünk 200 ul sejt-lizátum, és adjunk hozzá elsődleges antitesttel. Inkubáljuk, enyhe rázatás egy éjszakán át 4 ° C-on.
• Hozzáadása vagy protein-A vagy G agaróz gyöngyökkel (20 ul 50% -os gyöngy szuszpenzió). Inkubáljuk, enyhe rázatás 1-3 órán át 4 ° C-on.
• Mikrocentrifugában 30 másodpercig 4 ° C-on. Pellet mosása ötször 500 ul 1X sejtlízispufferben. Tartsa jégen közben mosás.
• Az üledéket újra szuszpendáljuk 20 ul 3X SDS-mintapufferben. Vortex, majd mikrocentrifugában 30 másodpercig.
• Melegítsük fel a mintát, hogy 95-100 ° C-on 2-5 percig, és mikrocentrifugában 1 percig 14000 x g.
• Töltsük be a mintát (15-30 ul) SDS-PAGE gélen (12-15%).
• Elemzése minta Western blot.

Western blot analízis ultraszonizáló UP50H

Következő eljárást alkalmazzuk a vizsgálatban a Kriebisch et al. (2011):
Az összes fehérje-t izoláltunk az MC3T3-E1 sejtek kezelt 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M), vagy a jármű. A sejteket lizáltuk puffer, amely 50 mM Tris-HCl, pH = 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM nátrium-klorid (Fisher Scientific); 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich), és 0,5% nátrium-dezoxikolát (Merck). A sejt-lizátumot ultrahanggal kezeljük 2 × 10 s 1. ciklusban és amplitúdó 80 a UP50H ultrahangos processzor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Németország). Ezután az anyagot 10 percig 14 000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk, és a felülúszót Western-blotoláshoz használtuk. Huszonöt μg fehérjét mintapufferben és redukálószerben (Invitrogen) főztek, majd SDP-PAGE-vel elválasztottuk 4-12% poliakrilamid gél (Invitrogen) alkalmazásával és nitrocellulóz membránra (GE-egészségügyre). A membránt 1% kazeint (Sigma-Aldrich) és 1% Tris (1 M) tartalmazó TBS-sel (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) blokkoltuk. Blokkolás után a membránt egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten inkubáljuk az elsődleges antitesttel (nyúl anti-humán CBS 1/500, amelyet R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA laboratóriumában fejlesztettek ki). Torma peroxidázzal (HPR) konjugált szekunder antitesttel (Dako) végzett inkubálást 1 órán át szobahőmérsékleten végeztünk. Mindegyik blotot fokozott kemilumineszcenciával (Perkin Elmer) fejlesztették ki.

Irodalom / Referenciák