Ultrahangos lízis a Western Blottinghoz

• A western blot egy analitikai eljárás specifikus fehérjék kimutatására szövethomogenizátum vagy sejtkivonat mintájában.
• A Western blot futtatásához vagy az enzimaktivitás méréséhez sok vizsgálatnak hozzá kell férnie a sejtben csapdába esett anyagokhoz (pl. fehérjék, DNS, szubcelluláris fragmensek).
• Sonication egy megbízható és könnyen kezelhető módszer szabályozott sejtzavar és lízis.

Ultrahangos cellazavarás

A fehérjék szövetekből és tenyésztett sejtekből történő kivonása az első lépés számos biológiai, biokémiai és analitikai technika (PAGE, Western blot készítés, ELISA, tömegspektrometria stb.) vagy fehérjetisztítás felé. A magas fehérjehozam eléréséhez a sejtanyagot és a szövetet hatékonyan meg kell zavarni / lizálni. Akár növényi sejt, akár állati szövet, szonikálás a módszer a sejt lizátum könnyű és gyors előkészítésére.

A szonikáció előnyei

• gyors & Hatékony
• Könnyű kezelhetőség
• magas fehérjehozam
• reprodukálható/ megismételhető
• precízen szabályozható
• Méretezhető

Immunprecipitációs protokoll a nyugati immunoblot számára

A. Reagensek

Az oldatok elkészítéséhez használjon tisztított vizet, például Milli-Q-t.

• 1X foszfátpufferes sóoldat (PBS)
• 1X sejtlízis puffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM β-glicerofoszfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Fontos: Közvetlenül használat előtt adjon hozzá 1 mM PMSF-et.
• 15 μl Protein A+15 μl A protein G elegendő az IP-hez, de ez függhet az elsődleges antitesttől és a minta mennyiségétől. Használhat előre kevert A/G agaróz fehérjét is (pl. A fehérje nyúl IgG lehúzáshoz és Protein G egér IgG lehúzáshoz)
• 3X SDS minta puffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25 ° C-on), 6 tömeg / V SDS, 30% glicerin, 150 mM DTT, 0,03 tömeg% brómfenol kék

B. Sejtlizátumok előállítása

• Gyűjtsük be a sejteket. A sejtek nem denaturáló körülmények között történő betakarításához távolítsa el a táptalajt és öblítse le a sejteket egyszer jéghideg PBS-sel.
• Távolítsuk el a PBS-t, adjunk 0,5 ml jéghideg 1X sejtlízis puffert minden lemezre (10 cm), és inkubáljuk a lemezeket jégen 5 percig.
• Kaparja le a sejteket a lemezekről, és tegye át mikrocentrifugacsövekbe. Tartsa jégen.
• Szonikáljon kétszer 10 másodpercig jéghideg immunprecipitációs pufferben (IP puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 és a proteáz inhibitor keverék). Az ultrahangos kezeléshez a VialMagassugárzó vagy egy szonda ultrahangos készülék, például a UP100H vagy UP200Ht a legmegfelelőbbek.
• Centrifugáljuk a lizátumokat 15 000 g-vel 10 percig 4 °C-on.
• Vigyük át a felülúszót egy új csőbe. (Szükség esetén a lizátum –80°C-on tárolható.)
• Adja hozzá az elsődleges ellenanyagot a felülúszóhoz. Az elsődleges ellenanyaggal rendelkező felülúszót 1 órán át 4°C-on, könnyű keverés mellett inkubáljuk. Az elsődleges antitestet általában 10x koncentráltabb mennyiségben adják hozzá, mint a nyugati blot esetében. (Kezdheti 1 μg / 100 μl-rel.)
• A felülúszót ezután egyenlő mennyiségű A-agaróz fehérje (Invitrogén) és fehérje G agaróz keverékével további 1 órán keresztül inkubáljuk.
• Mossuk át háromszor az agaróz pelleteket IP pufferrel. Ezután extraháljuk a kötött fehérjéket az SDS-PAGE töltőpufferrel 95 °C-on 5 percig tartó melegítéssel.

C. Immunprecipitáció

• Vegyünk 200 μl sejtlizátumot, és adjunk hozzá primer ellenanyagot. Inkubáljuk enyhe ringatással egy éjszakán át 4°C-on.
• Adjunk hozzá A vagy G agaróz fehérjét (20 μl 50%-os gyöngyszuszpenziót). Inkubáljuk gyengéd ringatással 1-3 órán át 4°C-on.
• Mikrocentrifugáljuk 30 másodpercig 4°C-on. Mossuk ki a pelletet ötször 500 μl 1X sejtlízis pufferrel. Mosás közben tartsa jégen.
• Szuszpendáljuk újra a pelletet 20 μl 3X SDS mintapufferrel. Örvény, majd mikrocentrifugálás 30 másodpercig.
• Melegítsük a mintát 95–100 °C-ra 2–5 percig, majd mikrocentrifugáljuk 1 percig 14 000 × g-on.
• Töltse fel a mintát (15–30 μl) SDS-PAGE gélre (12–15%).
• Elemezze a mintát Western blottinggal.

Western Blot elemzés a Sonicator UP50H-val

Az UP50H szonda típusú szonda típusú szondázó protokollt használtuk Kriebisch et al. (2011) tanulmányozásához:
Az összes fehérjét 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) vagy jármű. A sejteket 50 mM Tris HCl-t tartalmazó pufferrel lizáltuk, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) és 0,5% nátrium-deoxikolát (Merck). A sejt lizátumot ultrahangos ultrahangos 2 × 10 másodpercig az 1. ciklusban és az amplitúdó 80 a UP50H ultrahangos processzor (Hielscher, ultrahang technológia, Teltow, Németország). Ezután az anyagot 10 percig centrifugálták 14 000 fordulat / perc sebességgel, és a felülúszót Western blot készítésére használták. Huszonöt μg fehérjét forraltunk mintapufferben és redukálószerben (Invitrogen), majd SDS-PAGE-vel elválasztottuk 4–12% poliakrilamid gélekkel (Invitrogen), és nitrocellulóz membránba vittük (GE egészségügyi ellátás). A membránt 1 órán keresztül TBS-sel (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) blokkoltuk, amely 1% kazeint (Sigma-Aldrich) és 1% Tris-t (1 M) tartalmazott. Blokkolás után a membránt enyhe rázogatással egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk az elsődleges ellenanyaggal (nyúl anti-humán CBS 1/500, Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) laboratóriumában fejlesztették ki. Tormaperoxidázzal (HPR) konjugált másodlagos ellenanyaggal (Dako) végzett inkubálást szobahőmérsékleten 1 órán át végeztünk. Minden blotot fokozott kemilumineszcenciával (Perkin Elmer) fejlesztettek ki.
 

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni az ultrahangos sejtlízis és extrakció legjobb gyakorlatairól, a lizátum előkészítéséről és a folyamat javítására vonatkozó ajánlásokról!
 
Az alábbi táblázat jelzi laboratóriumi méretű ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását:

Irodalom / Hivatkozások