C. elegans minták ultrahangos előkészítése

A C. elegans, egy fonálféreg, széles körben használt modellorganizmus a biológiában. A minta előkészítése az elemzés előtt lízist, fehérje- és lipidextrakciót, valamint RNS-fragmentációt igényel, amely megbízhatóan elvégezhető szonikálással. Az ultrahangos sejtzavarók megbízható, kifinomult és könnyen használható eszközök a C. elegans minták gyors előkészítéséhez.

C. elegans minták ultrahangos előkészítése

A C. elegans kerekféregek, amelyeket széles körben használnak a kutatólaboratóriumokban a genomika, a fejlődésbiológia és a betegségek vizsgálatára. A C. elegans genomjában számos génnek van funkcionális megfelelője az emberben. Ezáltal a fonálféreg rendkívül hasznos modell az emberi betegségek számára. A C. elegans széles körű használatának további előnyei a baktériumokat (pl. E. coli) tartalmazó lemezeken történő könnyű és olcsó termesztése, átlátszósága, kényelmes kezelése, valamint a férgek hosszabb ideig történő fagyasztásának és tárolásának lehetősége.
A fehérje- és lipidelemzés rendszeres eljárások a laboratóriumokban, és az ultrahangos minta előkészítése a bevált módszer a C. elegans fonálférgek lizálására minden fejlődési szakaszban (azaz embriók, L1-L4 lárvák, felnőttek). Mivel a C. elegans-t fehérjeexpressziós rendszerként is használják a célzott fehérjék túlexpresszálására, megbízható, reprodukálható lízisre és fehérjekivonási módszerre van szükség, amely magas fehérjehozamot eredményez. Az ultrahangos sejtbontási és extrakciós rendszerek szonda típusú homogenizátorként és többmintás ultrahangos készülékként kaphatók. A kényelmes mintaelőkészítéshez és mindenféle mintamérethez szükséges számokkal a Hielscher Ultrasonics ideális ultrahangos sejtrombolóval rendelkezik a laboratóriumi eljáráshoz.

Ultrahangos protokollok a C. Elegans megszakításához és líziséhez

A C. elegans ultrahangos homogenizálása és lízise, valamint az azt követő fehérje- és lipidextrakció különböző eljárásokkal végezhető különböző homogenizációs és lízispufferek stb. Alkalmazásával. Minden lízisprotokollban közös, hogy a mintákat folyamatosan jégen kell tartani a fehérje lebomlásának megakadályozása érdekében. Az alábbiakban bemutatunk néhány megbízható és gyors ultrahangos lízis és extrakciós protokollt kiváló minőségű fehérje- vagy lipidtartalmú C. elegans minták előállításához.

Az ultrahangos C. elegans Lysis előnyei

• Megbízható
• ismételhető
• precízenhőmérséklet-szabályozott
• megbízható folyamatirányítás
• gyengéd módszer
• könnyen alkalmazható
• Biztonságos

Ultrahangos fehérje extrakció C. elegans mintákból

A C. elegans férgek ultrahangos lízise és fehérje extrakciója különböző protokollokkal végezhető el. Az alábbiakban bemutatunk néhány megbízható és gyors lízis protokollt a reprodukálható fehérjekivonási eredményekhez.

A citoszolikus kivonat gyors előkészítése C. elegans férgekből szonikálással

A következő protokollal kevesebb, mint 30 perc alatt elkészítheti a C. elegans lizátumokat.
A C. elegans gyűjteménye
Válassza ki a kívánt C. elegans férgeket egy 1,5 ml-es cső foszfátpufferes sóoldatába (PBS), vagy mossa le egy 1,5 ml-es PBS-t tartalmazó lemezről. Centrifugáljuk 1 percig 2000 fordulat / perc sebességgel pelletté. A mintákat mindig jégen kell tartani.
Ezután kétszer mossa le a férgeket PBS-sel.
Ezután mossuk meg kétszer a férgeket ddH-val₂O.
Szuszpendáljuk újra a férgeket legalább 500 ul homogenizáló pufferben (HB). A féregminták most készen állnak az ultrahangos lízisre.
A jobb fehérjekivonat-minőség érdekében érdemes csökkenteni a bakteriális szennyeződést úgy, hogy a férgeket egyenként 5 percig PBS-ben és steril, ultratiszta vízben (ddH₂O) vagy szacharóz lebegtetése. Tartsa folyamatosan jégen a féregmintákat.

Ultrahangos C. elegans lízis protokoll

• Győződjön meg róla, hogy előkészíti az ultrahangos készüléket előre, hogy az ultrahangos homogenizátor használatra kész legyen (szonda szerelt, ultrahangos program előre beállítva).

Ha az ultrahangos készülék állványra van szerelve, helyezze a jégfürdőt a mintacsövekkel az ultrahangos szonda alá, és helyezze be az ultrahangos szondát az 1,5 ml-es csőbe.

• A C. elegans lízis UP200St vagy UP200Ht, az ultrahangos kezelést mikrotip (pl. 2 mm-es szonda S26d2; lásd a bal oldali képet) segítségével kell elvégezni 40% amplitúdóval 1 másodpercig, 30 másodperces szünetekkel. 5 szonikációs ciklus minden 1 másodpercig 30 másodperces szünetekkel ideális a C. elegans lízishez. Ha először végzi el a lízist, mikroszkóp segítségével ellenőrizheti a lízis előrehaladását a minta kis aliquot részeiben minden impulzus után.
• A lízis sikeresen befejeződik, ha a férgek megszakadnak. A túlzott szonikálás a magok törését eredményezi, és láthatóvá válik, amikor a minta viszkózus vagy habos. A minta lebomlásának megelőzése érdekében szükség esetén használjon több impulzust. Ne növelje az egyes ultrahangos impulzusciklusok idejét, hogy kiváló minőségű fehérjekivonatokat kapjon.
• Tiszta sejtlizátum az ultrahanggal lizált férgek centrifugálásával 14 000 fordulat / perc sebességgel 10 percig 4 ° C-on.
• Ezután tegyük át a felülúszót egy friss csőbe, és készüljünk fel az immunprecipitációra vagy más vizsgálatokra.

Megjegyzés a homogenizációs pufferhez: Készítse elő a homogenizációs puffert a fenti ultrahangos lízis protokollhoz az alábbiak szerint:

A C. elegans nagy áteresztőképességű lízise 96 lyukú lemezekben a UIP400MTP lemezes szonikátorral

C. elegans Lysis (felnőtt fonálférgek)
UIP400MTP 80% amplitúdó, 20 ciklus (minden ultrahangos ciklus: 30 mp BE, 30 másodperc KI)
Lízis puffer:

• 1. lehetőség) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• 2. lehetőség) koimmunprecipitáció (co-IP) esetén: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (teljes proteináz inhibitor koktél)

Nagy áteresztőképességű DNS-fragmentáció
C. elegans (felnőtt fonálférgek) DNS 200-300bp: UIP400MTP lemezes szonikátor – 80% amplitúdó, 30impulzus beállítása – 30 másodpercenként be, 30 másodpercenként ki

UIP400MTP Plate Sonicator a nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez egyenletesen szonikálja a mintákat több lyukú, mikrotiter lemezekben és 96-lyukú lemezekben

A C. elegans ultrahangos lízise kvantitatív affinitástisztítási vizsgálatokhoz

A C. elegans embriókat (∼2 millió ismétlésenként) frissen gyűjtötték be biológiai hármasban fiatal gravid hermafroditák fehérítésével és jégen ultrahanggal (ciklus: 0,5 s, amplitúdó: 40–45%, 5 ütés/ülés, 5 ülés, ülések közötti intervallum: 30 s; UP200S ultrahangos processzor mikro-tip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lízis pufferben (teljes térfogat: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerin, proteáz inhibitor keverék, 0,1% Nonidet P-40 helyettesítő). Ultrahangos kezelés után a Nonidet P-40 helyettesítőt hozzáadtuk 1% -ig, és a lizátumokat inkubáltuk fejjel a farok körül forgással 4 ° C-on 30 percig, majd centrifugálással 20 000 × g-on 20 percig 4 ° C-on. A kiürült lizátumot ezután a felső lipidréteg megzavarása nélkül szívtuk fel, és felére osztottuk vagy anti-GFP agaróz gyöngyökre vagy blokkolt kontroll gyöngyökre (40–50 μl). A 4 °C-on 60–90 percig tartó fej fölötti forgatás után a gyöngyöket egyszer átmostuk 0,1% Nonidet P-40 szubsztituálót tartalmazó lízispufferrel, majd kétszer átmostuk az I. pufferben (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vagy puffer II-ben (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vagy mindkettő. A GFP:MBK-2 lehúzások esetében két külön kísérletet végeztünk különböző mosási körülmények között. A fehérjéket szobahőmérsékleten 50 μl 6 m karbamid/2 M thiourea orbitális rázásával eluáltuk. Az MBK-1::GFP pull-down kísérletekhez a fehérjéket kétszer eluáltuk 50 μl 8 m guanidinium-klorid 90 °C-on történő rázásával, majd etanolos kicsapással. Az eluált fehérjemintákat ezután oldatban emésztettük.
(vö. Chen et al., 2016)

Ultrahangos féreg homogenizálás és lízis

A C.elegans lízishez és fehérjeextrakciós eljáráshoz mintánként 30 000 nemotódot gyűjtöttünk össze az adott szakaszból, és jéghideg S-bazálisban mostuk, centrifugálással 1500 fordulat / perc sebességgel 2 percig koncentráltuk, hatszor jéghideg S-bazálissal mossuk a maradék baktériumok eltávolítása érdekében, majd jégen tároljuk, amíg készen áll a használatra. A fehérje extrakcióhoz a gravid-felnőtt férgeket az utolsó S-bazális mosás után kompakt pelletet képeztek. A féregpelleteket ezután 1 ml jéghideg extrakciós pufferben [20 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteázgátlók (Sigma P2714)] szuszpendálták újra, és azonnal feldolgozták.
∼30 000 gravid-felnőtt férgeket (ami megfelel ∼100 mg nedves tömegnek) jégen ultrahangosítottuk szonda típusú ultrahangos készülékkel (pl. UP50H mikrotip MS2) 40% amplitúdóval 10 ciklusban 3 másodpercig, 30 másodpercig ki, 1 ml jéghideg extrakciós pufferben. (vö. Baskharan et al. 2012)

Ultrahangos lipid extrakció C. elegans-ból

A lipidomikában, a metabolomika egyik ágában, a biológiai rendszerek lipidkomplementjét jellemzik és elemzik. A C. elegans-t széles körben használják a lipidomikában a metabolikus lipidek kölcsönhatásának, valamint az egészségre és az élettartamra gyakorolt hatásának vizsgálatára.
Az ultrahangos lízist és extrakciót lipidek, például szfingolipidek felszabadítására használják C. elegans embriókból, lárvákból és felnőtt férgekből. Az ultrahangos kezelést féreghomogenizátumok előállítására, majd a lipidek mintából történő kivonására használják.
Protokoll ultrahangos lipid extrakcióhoz C. elegans
A C. elegans pelletet jégen olvasszuk fel, és 0,5 ml ultravízzel szuszpendáljuk újra. 
Szonikálja a C. elegans mintákat 1,5 ml-es kémcsövekben, miközben a mintákat folyamatosan jégen tartja.
Szonikálás elvégezhető szonda-ultrahang, mint például a UP200Ht, az ultrahangos mintaelőkészítő egység VialMagassugárzó (10 minta egyidejű ultrahangos kezelése) vagy a UIP400MTP (több lyukú lemezek, például 96-lyukú lemezek ultrahangos kezelésére). Az ultrahangos lízishez az UP200Ht használja az S26d2 mikrocsúcsot. Állítsa be előre az ultrahangos ciklus módot a digitális menüben. Állítsa be az amplitúdót 10% -ra és az ultrahangos ciklus üzemmódját 2 másodperces impulzusok 20 ciklusok, 30 másodperces szünettel. az egyes ultrahangos pulzációs kitörések között.
Vigyük át a felülúszókat csavaros kupakkal ellátott üvegcsövekbe. 
Végezzük el a folch-extrakciót úgy, hogy minden üvegcsőhöz 1 ml ultravizet adunk, majd 6 ml kloroform/metanol (arány = 2:1) keveréket adunk minden üvegcsőhöz.
Örvényezzen minden üvegcsövet 30 másodpercig 4-szer. 
Centrifugáljuk a csöveket 1,258 × g hőmérsékleten 15 percig (Eppendorf, 5810 R) a fázisszétválasztás további fokozása érdekében. 
Az alsó hidrofób frakciót üveg Pasteur-pipettával vigyük át egy tiszta üvegcsőbe. 
Szárítsuk meg az alsó hidrofób frakciót nitrogén áramlás alatt nitrogén bepárlóban. 
Felhasználásig tárolja a szárított pelletet -80 °C-os fagyasztóban.

Féreg lizátumok ultrahangos előkészítése

Féreglizátum: Az L4 stádiumú férgeket háromszor gyűjtöttük be és mostuk M9 pufferrel (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂BILI₄, 85,56 mM NaCl és 0,87 mM MgSO₄) az összes baktérium eltávolítása érdekében. Miután a lehető legnagyobb mértékben eltávolítottuk az M9 puffert, a férgeket újra szuszpendáltuk lízis pufferben: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM foszfát β-glicerin, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM nátrium-fluorid, 1 mM nátrium-ortovanadát, 5 mM nátrium-pirofoszfát, 0,2 mM fenil-metánszulfonil-fluorid és proteázgátló. A férgeket folyékony nitrogénben fagyasztották és 37 ° C-on háromszor felolvasztották, majd a férgeket szárazjégen ultrahanggal ultrahangos VialTweeter egységgel ultrahanggal kezelték 10 mintacső egyidejű előkészítéséhez. Az ultrahangos kezelést 50% amplitúdóval végeztük 10 ciklus 2 másodpercig. 30 másodperces szünet az ultrahangos kitörések között. Ezt követően a mintákat 12000-es percenkénti fordulatszámon, 4°C-on 15 percig centrifugálták. A felülúszót begyűjtöttük és -70 °C-on tároltuk. A fehérjék mennyiségi meghatározására aliquot részt használtunk Bradford-vizsgálattal.
Az összes glutation, GSH és GSSG meghatározása: A glutation mennyiségi meghatározásához a lizátumokat és a meghatározást ugyanazon a napon végeztük. A glükózzal táplált és kontroll L4 lárvákat háromszor gyűjtöttük be és mostuk M9 pufferrel. Miután a lehető legnagyobb mértékben eltávolítottuk az M9 puffert, a férgeket jéghideg metafoszforsavban (5 tömeg% / térfogatszázalék) szuszpendáltuk, majd a férgeket jégben ultrahanggal ultrahangos VialTweeterrel ultrahanggal 50% amplitúdóval tíz ultrahangos ciklusban 2 másodpercig, 30 másodperces szünettel az egyes ciklusok között. Ezután centrifugáljuk 12000 fordulat / perc sebességgel 4 ̊C-on 15 percig.
(vö. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Mintaelőkészítés immunprecipitáció és Western Blotting előtt

Röviden, az embrionális kivonatok esetében a C. elegans L1 lárvákat nagyüzemi folyékony S-közepes tenyészetekben tenyésztették felnőttkorig. Az embriókat standard fehérítő módszerrel gyűjtöttük össze, és lízispufferben szuszpendáltuk (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerin, 0,05% NP-40, 1 specifikációs adatok szerint ��� Protease Inhibitor Cocktail és 1 Phosphatase Inhibitor Cocktail I és II), gyorsan fagyasztva folyékony nitrogénben, és ultrahangos sejtbontással lizálva egy ultrahangos készülékkel mikrotip, például a UP200Ht S26d2-vel 10 impulzushoz 10 másodperc alatt 30% amplitúdóval. Ha nagyobb számú mintát kell készíteni, az ultrahangos VialMagassugárzó vagy a MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP kútlemezekhez ajánlott. Az ultrahangos kezelés után a kivonatokat előzetesen megtisztítottuk centrifugálással 30 000 g-on 20 percig 4 ° C-on. Az előtisztított kivonatot (300 μg összes fehérje) 40μg anti-CDC-25.1 affinitás-tisztított antitesttel inkubáltuk (ez a vizsgálat), amely keresztkötésben állt az A-agaróz fehérjével, vagy kontrollként hasonló mennyiségű nyúl immunglobulint (Ig)G keresztkötésben alkalmaztunk A-agaróz fehérjével 200 μl teljes térfogatú lízispufferben, amely 1% NP-40-et tartalmazott, amelynek bevonása csökkentette a fehérjék nem specifikus kötődését a mátrixhoz. A mintákat 1 órán át forgattuk 4 °C-on, a gyöngyöket háromszor átmostuk lízispufferrel, majd 30 μl glicin/HCl-lel és 200 mM NaCl-lal (pH 2,2) eluáltuk. Immunprecipitáció után az eluátumokat 30 μméteres SDS mintapufferben hígítottuk, 4 percig 95 ° C-ra melegítettük, és jellemzően az összes bemenet 3% -át és az eluátumok 30% -át az SDS-PAGE-re vittük fel, majd Western blot anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3specification ��� (1:500) vagy anti-specifikációk ���β-aktin (1:2000) antitestekkel. Ahol a kivonatokat nem vetették alá immunprecipitációnak, az ezekből a kivonatokból származó azonos mennyiségű összes fehérjét SDS mintapufferben szuszpendálták, 95 °C-ra melegítették, majd közvetlenül az SDS-PAGE-re vitték fel, és Western blot módszerrel elemezték. (vö. Segref et al. 2020)

Ultrahangos lízis precíz hőmérséklet-szabályozás alatt

A pontos és megbízható hőmérséklet-szabályozás döntő fontosságú a biológiai minták kezelésekor. A magas hőmérséklet termikusan indukált fehérjelebomlást indít el a mintákban.
Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az szonikálás hőt hoz létre. A minták hőmérséklete azonban jól szabályozható a VialTweeter használatakor. Különböző lehetőségeket kínálunk a minták hőmérsékletének felügyeletére és szabályozására, miközben előkészítjük őket a VialTweeter és a VialPress segítségével az elemzéshez.

1. A minta hőmérsékletének ellenőrzése: Az UP200St ultrahangos processzor, amely a VialTweeter-t hajtja, intelligens szoftverrel és dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel van felszerelve. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az UP200St-hez, és helyezze be a hőmérséklet-érzékelő csúcsát az egyik mintacsőbe. Digitális színes érintőképernyőn keresztül beállíthatja a UP200St menüjében egy meghatározott hőmérsékleti tartományt a minta szonikálásához. Az ultrahangos készülék automatikusan leáll, amikor eléri a maximális hőmérsékletet, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete a beállított hőmérséklet alacsonyabb értékére ∆. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megakadályozza a hő okozta degradációt.
2. A VialTweeter blokk előhűthető. Helyezze a VialTweeter blokkot (csak a szonotródát jelátalakító nélkül!) a hűtőszekrénybe vagy a fagyasztóba, hogy előhűtse a titánblokkot, és segít elhalasztani a minta hőmérsékletének emelkedését. Ha lehetséges, maga a minta is előhűthető.
3. Használjon szárazjeget lehűlni az ultrahangos kezelés során. Használjon szárazjéggel töltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweetert a szárazjégre, hogy a hő gyorsan eloszlasson.

Keresse meg az optimális ultrahangos cella-diszruptort a lízis alkalmazásához

A Hielscher Ultrasonics régóta tapasztalt gyártója nagy teljesítményű ultrahangos cellabontóknak és homogenizátoroknak laboratóriumok, asztali és ipari mérlegrendszerek számára. A baktériumsejtkultúra mérete, a kutatási vagy gyártási cél, valamint az óránként vagy naponta feldolgozandó sejt mennyisége alapvető tényezők ahhoz, hogy megtalálják a megfelelő ultrahangos sejtrombolót az Ön alkalmazásához.
A Hielscher Ultrasonics különböző megoldásokat kínál több minta (legfeljebb 10 injekciós üveg), valamint tömegminták (azaz mikrotiter lemezek / 96-lyukú lemezek) egyidejű ultrahangos kezelésére, a klasszikus szonda típusú laboratóriumi ultrasonicator különböző teljesítményszintekkel 50-400 watt a teljesen ipari ultrahangos processzorokhoz, akár 16 000 watt egységenként a kereskedelmi sejtek megszakításához és a fehérje extrakcióhoz nagy termelésben. Minden Hielscher ultrasonicators épül a 24/7/365 művelet teljes terhelés alatt. A robusztusság és a megbízhatóság ultrahangos készülékeink alapvető jellemzői.
Minden digitális ultrahangos homogenizátor intelligens szoftverrel, színes érintőképernyővel és automatikus adatprotokollal van felszerelve, amelyek az ultrahangos készüléket kényelmes munkaeszközzé teszik a laboratóriumi és termelési létesítményekben.
Tudassa velünk, hogy milyen sejtek, milyen térfogattal, milyen gyakorisággal és milyen céllal kell feldolgoznia biológiai mintáit. Javasoljuk Önnek a legmegfelelőbb ultrahangos cella-diszruptort a folyamat követelményeinek.

Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását a kompakt kézi homogenizátoroktól és a MultiSample ultrahangos készülékektől az ipari ultrahangos processzorokig kereskedelmi alkalmazásokhoz: