C. Elegans minták ultrahangos előkészítése

A C. elegans fonálféreg a biológiában széles körben használt modellszervezet. Az elemzés előtti minta-előkészítéshez lízisre, fehérje- és lipidextrakcióra, valamint RNS-fragmentálásra van szükség, amelyek ultrahangos kezeléssel megbízhatóan elvégezhetők. Az ultrahangos sejtfeltárók megbízható, korszerű és könnyen használható készülékek a C. elegans minták gyors előkészítéséhez.

C. elegans minták ultrahangos előkészítése

A C. elegans fonálférgeket kutatólaboratóriumokban széles körben használják genomikai, fejlődésbiológiai és betegségekkel kapcsolatos vizsgálatokhoz. A C. elegans genomjának számos génje rendelkezik funkcionális megfelelővel az emberben. Ezáltal ez a fonálféreg rendkívül hasznos modell az emberi betegségek vizsgálatához. A C. elegans széles körű használatának további előnyei közé tartozik a baktériumokat (pl. E. coli) tartalmazó lemezeken történő egyszerű és olcsó tenyésztése, átlátszósága, kényelmes kezelhetősége, valamint az, hogy a férgek lefagyaszthatók és hosszabb ideig tárolhatók.
A fehérje- és lipidelemzés rendszeresen végzett laboratóriumi eljárás, és az ultrahangos minta-előkészítés bevett módszer a C. elegans fonálférgek lizálására minden fejlődési stádiumban (azaz embriók, L1-L4 lárvák, kifejlett egyedek esetében). Mivel a C. elegans fehérjeexpressziós rendszerként is használatos célfehérjék túltermeltetésére, megbízható, reprodukálható, nagy fehérjehozamot biztosító lízis- és fehérjeextrakciós módszerre van szükség. Az ultrahangos sejtfeltáró és extrakciós rendszerek szondás homogenizátorokként és többmintás ultrahangos kezelőkészülékekként is elérhetők. A kényelmes minta-előkészítéshez, bármilyen mintamérethez és mintaszámhoz a Hielscher Ultrasonics ideális ultrahangos sejtfeltárót kínál az Ön laboratóriumi eljárásához.

Ultrahangos protokollok a C. Elegans feltárásához és líziséhez

A C. elegans ultrahangos homogenizálása és lízise, valamint az ezt követő fehérje- és lipidextrakció különféle eljárásokkal, eltérő homogenizáló és lízispufferekkel stb. végezhető. Minden lízisprotokoll közös jellemzője, hogy a mintákat folyamatosan jégen kell tartani a fehérjék lebomlásának megelőzése érdekében. Az alábbiakban néhány megbízható és gyors ultrahangos lízis- és extrakciós protokollt mutatunk be kiváló minőségű, fehérjét vagy lipidet tartalmazó C. elegans minták előkészítéséhez.

A C. elegans ultrahangos lízisének előnyei

• megbízható
• reprodukálható
• pontosan szabályozott hőmérséklet
• megbízható folyamatszabályozás
• kíméletes módszer
• könnyen alkalmazható
• biztonságos

Ultrahangos fehérjeextrakció C. elegans mintákból

A C. elegans férgek ultrahangos lízise és fehérjeextrakciója különféle protokollokkal végezhető. Az alábbiakban néhány megbízható és gyors lízisprotokollt mutatunk be a fehérjeextrakció reprodukálható eredményeihez.

Citoszolikus kivonat gyors készítése C. elegans férgekből ultrahangos kezeléssel

A következő protokollal kevesebb mint 30 perc alatt készíthet C. elegans lizátumokat.
A C. elegans begyűjtése
Helyezze a kívánt C. elegans férgeket foszfáttal pufferelt sóoldatot (PBS) tartalmazó 1,5ml-es csőbe, vagy mossa le őket egy lemezről 1,5ml PBS-sel. Centrifugálja 1min időtartamig 2000rpm fordulatszámon, hogy üledéket kapjon. A mintákat mindvégig tartsa jégen.
Ezután mossa át a férgeket kétszer PBS-sel.
Ezt követően mossa át a férgeket kétszer ddH₂O-val.
Szuszpendálja újra a férgeket legalább 500ul homogenizáló pufferben (HB). A féregminták ekkor készen állnak az ultrahangos lízisre.
A jobb minőségű fehérjekivonat érdekében érdemes lehet csökkenteni a bakteriális szennyeződést a férgek egyenként 5min időtartamú átmosásával PBS-ben és steril, ultratiszta vízben (ddH₂O), vagy szacharózos flotálást végezni. A féregmintákat folyamatosan tartsa jégen.

A C. elegans ultrahangos lízisének protokollja

• Előzetesen készítse elő az ultrahangos kezelőkészüléket, hogy az ultrahangos homogenizátor használatra kész legyen (felszerelt szonda, előre beállított ultrahangos kezelési program). 

Ha az ultrahangos kezelőkészülék állványra van szerelve, helyezze a mintacsöveket tartalmazó jégfürdőt az ultrahangos szonda alá, és vezesse be az ultrahangos szondát az 1,5ml-es csőbe.

• A C. elegans UP200St vagy UP200Ht készülékkel végzett líziséhez az ultrahangos kezelést mikroheggyel (pl. 2mm-es S26d2 szonda; lásd a bal oldali képet), 40% amplitúdón, 1sec időtartamig, a kezelések között 30sec szünetekkel kell végezni. A C. elegans líziséhez 5, egyenként 1 másodperces ultrahangos kezelési ciklus ideális, 30sec szünetekkel. Ha először végzi a lízist, minden impulzus után mikroszkóppal ellenőrizheti a lízis előrehaladását a minta kis alikvotjaiban.
• A lízis akkor fejeződött be sikeresen, amikor a férgek feltáródtak. A túlzott ultrahangos kezelés a sejtmagok szétesését okozza, ami a minta viszkózussá válásából vagy habzásából válik láthatóvá. A minta károsodásának megelőzése érdekében szükség esetén alkalmazzon több impulzust. A kiváló minőségű fehérjekivonatok előállítása érdekében ne növelje az egyes ultrahangos impulzusciklusok időtartamát.
• Tisztítsa meg a sejtlizátumot az ultrahangosan lizált férgek 14 000rpm fordulatszámon, 10min időtartamig, 4ºC-on végzett centrifugálásával.
• Ezután vigye át a felülúszót egy új csőbe, és készítse elő immunprecipitációhoz vagy más vizsgálatokhoz.

Megjegyzés a homogenizáló pufferhez: A fenti ultrahangos lízisprotokollhoz a következőképpen készítse el a homogenizáló puffert:

A C. elegans nagy mintaáteresztő képességű lízise 96 lyukú lemezeken a UIP400MTP lemezkezelő ultrahangos készülékkel

C. elegans lízis (kifejlett fonálférgek)
UIP400MTP 80% amplitúdó, 20 ciklus (minden ultrahangos kezelési ciklus: 30 sec BE, 30 sec KI)
Lízispuffer:

• 1. lehetőség) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• 2. lehetőség) koimmunprecipitációhoz (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteinázgátló koktél)

Nagy mintaáteresztő képességű DNS-fragmentálás
C. elegans (kifejlett fonálférgek) DNS 200–300bp: UIP400MTP lemezkezelő ultrahangos készülék – állítson be 80% amplitúdót, 30 impulzust – mindegyiknél 30sec bekapcsolva, 30sec kikapcsolva

A nagy mintaáteresztő képességű minta-előkészítésre szolgáló UIP400MTP lemezkezelő ultrahangos készülék egyenletesen kezeli ultrahanggal a többlyukú, mikrotiter- és 96 lyukú lemezeken lévő mintákat

A C. elegans ultrahangos lízise kvantitatív affinitástisztítási vizsgálatokhoz

A C. elegans embriókat (ismétlésenként ∼2 millió) három biológiai ismétlésben, fiatal, petéket hordozó hermafroditák hipokloritos kezelésével frissen gyűjtötték be, majd jégen ultrahangos kezelésnek vetették alá (ciklus: 0,5 s, amplitúdó: 40–45%, 5 impulzus/kezeléssorozat, 5 kezeléssorozat, a kezeléssorozatok közötti időköz: 30 s; UP200S ultrahangos processzor S26d2 mikroheggyel (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lízispufferben (teljes térfogat: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerin, proteázgátló keverék, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Az ultrahangos kezelés után Nonidet P-40 Substitute anyagot adtak hozzá 1%-ig, és a lizátumokat vég-over-vég forgatással inkubálták 4°C-on 30 min időtartamig, majd 20 000 × g mellett 20 min időtartamig centrifugálták 4°C-on. A tisztított lizátumot ezután leszívták a felső lipidréteg megzavarása nélkül, és két egyenlő részre osztva anti-GFP agarózgyöngyökhöz, illetve blokkolt kontrollgyöngyökhöz adták (40–50 μl). A 4°C-on 60–90 min időtartamig végzett vég-over-vég forgatás után a gyöngyöket egyszer átmosták 0,1% Nonidet P-40 Substitute anyagot tartalmazó lízispufferrel, majd kétszer átmosták az I. pufferrel (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vagy a II. pufferrel (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), vagy mindkettővel. A GFP:MBK-2 pull-down vizsgálatokhoz két külön kísérletet végeztek eltérő mosási körülmények alkalmazásával. A fehérjéket orbitális rázással eluálták 50 μl 6 m karbamid/2 M tiokarbamid oldatban, szobahőmérsékleten. Az MBK-1::GFP pull-down kísérletekhez a fehérjéket kétszer eluálták rázással 50μl 8 m guanidinium-kloridban, 90°C-on, majd etanolos kicsapást végeztek. Az eluált fehérjemintákat ezután oldatban emésztették.
(vö. Chen et al., 2016)

Férgek ultrahangos homogenizálása és lízise

A C.elegans líziséhez és fehérjeextrakciójához mintánként 30 000, a megfelelő stádiumban lévő fonálférget gyűjtöttek be, jéghideg S-basal közegben átmosták őket, 1500 rpm fordulatszámon 2 min időtartamig végzett centrifugálással koncentrálták, hatszor átmosták jéghideg S-basal közeggel a visszamaradt baktériumok eltávolítására, majd felhasználásig jégen tárolták őket. A fehérjeextrakcióhoz az utolsó S-basal mosás után hagyták, hogy a petéket hordozó, kifejlett férgek tömör üledéket képezzenek. A féregüledéket ezután 1 ml jéghideg extrakciós pufferben [20 mM kálium-foszfát, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteázgátlók (Sigma P2714)] újraszuszpendálták, és azonnal feldolgozták.
∼30 000 petéket hordozó, kifejlett férget (∼100 mg nedves tömegnek megfelelő mennyiség) jégen ultrahangos kezelésnek vetettek alá szondás ultrahangos kezelőkészülékkel (pl. UP50H MS2 mikroheggyel), 40% amplitúdón, 10 ciklusban, 3 sec bekapcsolt és 30 sec kikapcsolt időtartammal, 1 ml jéghideg extrakciós pufferben. (vö. Baskharan et al. 2012)

Ultrahangos lipidextrakció C. elegans férgekből

A lipidomikában, a metabolomika egyik ágában, a biológiai rendszerek teljes lipidállományát jellemzik és elemzik. A C. elegans széles körben használatos a lipidomikában az anyagcserében részt vevő lipidek kölcsönhatásainak, valamint az egészségre és az élettartamra gyakorolt hatásainak vizsgálatára.
Ultrahangos lízist és extrakciót alkalmaznak lipidek, például szfingolipidek felszabadítására C. elegans embriókból, lárvákból és kifejlett férgekből. Az ultrahangos kezelést féreghomogenátumok készítésére, majd a lipidek mintából történő extrakciójára használják.
A C. elegans ultrahangos lipidextrakciójának protokollja
Olvassza fel a C. elegans üledéket jégen, és szuszpendálja újra 0,5 ml ultrawater hozzáadásával. 
Kezelje ultrahanggal a C. elegans mintákat 1,5mL-es kémcsövekben, miközben a mintákat folyamatosan jégen tartja.
Az ultrahangos kezeléshez használható szondás ultrahangos kezelőkészülék, például az UP200Ht, vagy ultrahangos minta-előkészítő egység, például a VialTweeter (10 minta egyidejű ultrahangos kezeléséhez), illetve a UIP400MTP (többlyukú lemezek, például 96 lyukú lemezek ultrahangos kezeléséhez).
Az UP200Ht készülékkel végzett ultrahangos lízishez használja az S26d2 mikrohegyet. Állítsa be előre az ultrahangos ciklusüzemmódot a digitális menüben. Állítson be 10% amplitúdót, az ultrahangos kezelési ciklusüzemmódot pedig 20 ciklusra, 2 sec impulzusokkal és az egyes ultrahangos impulzusok között 30 sec. szünettel.
Vigye át a felülúszókat csavaros kupakkal ellátott üvegcsövekbe. 
Végezzen Folch-extrakciót úgy, hogy minden üvegcsőbe 1 ml ultrawater anyagot ad, majd minden üvegcsőbe 6 ml kloroform/metanol keveréket (arány = 2:1) ad.
Minden üvegcsövet kezeljen vortexkeverővel 4 alkalommal, alkalmanként 30 sec időtartamig. 
Centrifugálja a csöveket 1 258 x g mellett 15 min időtartamig (Eppendorf, 5810 R) a fázisszétválás további elősegítésére. 
Üveg Pasteur-pipettával vigye át az alsó hidrofób frakciót egy tiszta üvegcsőbe. 
Szárítsa meg az alsó hidrofób frakciót nitrogénáramban, nitrogénes bepárlóban. 
A megszárított üledéket felhasználásig -80 °C hőmérsékletű fagyasztóban tárolja. 


Féreglizátumok ultrahangos előállítása

Féreglizátum: Az L4 stádiumú férgeket begyűjtötték, és háromszor átmosták M9 pufferrel (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl és 0,87 mM MgSO₄) az összes baktérium eltávolítása érdekében. Az M9 puffer lehető legnagyobb részének eltávolítása után a férgeket lízispufferben szuszpendálták újra: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glicerofoszfát, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM nátrium-fluorid, 1 mM nátrium-ortovanadát, 5 mM nátrium-pirofoszfát, 0,2 mM fenilmetánszulfonil-fluorid és proteázgátló. A férgeket háromszor folyékony nitrogénben lefagyasztották és 37°C-on felolvasztották, majd szárazjégen ultrahangos kezelésnek vetették alá egy ultrahangos VialTweeter egységgel, amely 10 mintacső egyidejű előkészítésére szolgál. Az ultrahangos kezelést 50% amplitúdón, 10, egyenként 2 sec. időtartamú ciklusban végezték, az ultrahangos impulzusok között 30 sec szünettel. Ezt követően a mintákat 12 000 rpm fordulatszámon, 4°C-on, 15 min időtartamig centrifugálták. A felülúszót összegyűjtötték, és -70°C-on tárolták. Egy alikvotot a fehérjemennyiség Bradford-módszerrel történő meghatározására használtak.
Az összes glutation, a GSH és a GSSG meghatározása: A glutation mennyiségi meghatározásához a lizátumokat és a meghatározást ugyanazon a napon készítették, illetve végezték el. A glükózzal táplált és a kontroll L4 lárvákat begyűjtötték, és háromszor átmosták M9 pufferrel. Az M9 puffer lehető legnagyobb részének eltávolítása után a férgeket jéghideg metafoszforsavban (5% w/v) szuszpendálták újra, majd jégen ultrahangos VialTweeter készülékkel kezelték őket 50% amplitúdón, tíz, egyenként 2 sec. időtartamú ultrahangos kezelési ciklusban, minden ciklus között 30 sec. szünettel. Ezt követően 12 000 rpm fordulatszámon, 4 ̊C-on, 15 min időtartamig centrifugálták őket.
(vö. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans minták előkészítése immunprecipitáció és Western-blot előtt

Röviden: az embrionális kivonatokhoz C. elegans L1 lárvákat nagyméretű, folyékony S-tápközeges tenyészetekben neveltek kifejlett egyedekké. Az embriókat a standard hipokloritos módszerrel gyűjtötték be, lízispufferben szuszpendálták (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerin, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteázgátló koktél és 1􏰅 foszfatázgátló koktél I és II), gyorsan lefagyasztották folyékony nitrogénben, majd ultrahangos sejtfeltárással lizálták mikroheggyel ellátott ultrahangos kezelőkészülékkel, például az UP200Ht készülékkel, S26d2 mikroheggyel, 10 s alatt 10 impulzust alkalmazva, 30% amplitúdón. Ha nagyobb számú mintát kell előkészíteni, az ultrahangos VialTweeter vagy a többlyukú lemezekhez való többmintás UIP400MTP ultrahangos kezelőkészülék ajánlott. Az ultrahangos kezelés után a kivonatokat 30 000g mellett, 20 min időtartamig, 4°C-on végzett centrifugálással előtisztították. Az előtisztított kivonatot (300µg összfehérje) 40µ􏰂g, affinitástisztított, protein A-agarózhoz keresztkötött anti-CDC-25.1 antitesttel (ez a vizsgálat) inkubálták, vagy kontrollként hasonló mennyiségű, protein A-agarózhoz keresztkötött nyúl immunglobulin (Ig)G-t használtak, összesen 200µl, 1% NP-40-et tartalmazó lízispufferben; az NP-40 hozzáadása csökkentette a fehérjék nem specifikus kötődését a mátrixhoz. A mintákat 1 h időtartamig forgatták 4°C-on, a gyöngyöket háromszor átmosták lízispufferrel, majd 30µl glicin/HCl és 200 mM NaCl segítségével eluálták, pH 2,2 mellett. Az immunprecipitáció után az eluátumokat 30µ􏰂l SDS-mintapufferben hígították, 4 min időtartamig 95°C-ra melegítették, majd rendszerint a teljes mennyiség 3%-át kiindulási mintaként, az eluátumok 30%-át pedig eluátummintaként vitték fel SDS-PAGE-re. Ezt Western-blot követte anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) vagy anti-􏰁β-actin (1:2000) antitestekkel. Ha a kivonatokat nem vetették alá immunprecipitációnak, az ezekből a kivonatokból származó azonos mennyiségű összfehérjét SDS-mintapufferben újraszuszpendálták, 95°C-ra melegítették, majd közvetlenül SDS-PAGE-re vitték fel, és Western-blottal elemezték. (vö. Segref et al. 2020)

Ultrahangos lízis pontos hőmérséklet-szabályozás mellett

A pontos és megbízható hőmérséklet-szabályozás döntő fontosságú a biológiai minták kezelésekor. A magas hőmérséklet hő által kiváltott fehérjebomlást indít el a mintákban.
Mint minden mechanikai minta-előkészítési technika, az ultrahangos kezelés is hőt termel. A VialTweeter használatával azonban a minták hőmérséklete jól szabályozható. Különféle lehetőségeket mutatunk be a minták hőmérsékletének figyelésére és szabályozására, miközben a VialTweeter és a VialPress segítségével előkészíti őket az elemzéshez.

1. A mintahőmérséklet figyelése: A VialTweeter meghajtására szolgáló UP200St ultrahangos processzor intelligens szoftverrel és csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel rendelkezik. Csatlakoztassa a hőmérséklet-érzékelőt az UP200St készülékhez, és helyezze a hőmérséklet-érzékelő végét az egyik mintacsőbe. A digitális, színes érintőkijelzőn az UP200St menüjében meghatározott hőmérséklet-tartományt állíthat be a minta ultrahangos kezeléséhez. Az ultrahangos kezelőkészülék automatikusan leáll a maximális hőmérséklet elérésekor, és szünetel, amíg a minta hőmérséklete a beállított ∆ hőmérséklet-tartomány alsó értékére nem csökken. Ezután az ultrahangos kezelés automatikusan újraindul. Ez az intelligens funkció megelőzi a hő által kiváltott lebomlást.
2. A VialTweeter blokk előhűthető. Helyezze a VialTweeter blokkot (csak a szonotródát, az átalakító nélkül!) hűtőszekrénybe vagy fagyasztóba; a titánblokk előhűtése segít késleltetni a minta hőmérsékletének emelkedését. Ha lehetséges, maga a minta is előhűthető.
3. Az ultrahangos kezelés közbeni hűtéshez használjon szárazjeget. Használjon szárazjéggel megtöltött sekély tálcát, és helyezze a VialTweeter egységet a szárazjégre, hogy a hő gyorsan elvezetődhessen.

Találja meg az optimális ultrahangos sejtfeltárót lízisalkalmazásához

A Hielscher Ultrasonics nagy tapasztalattal rendelkező gyártó, amely nagy teljesítményű ultrahangos sejtfeltárókat és homogenizátorokat készít laboratóriumi, asztali és ipari léptékű rendszerekhez. A bakteriális sejttenyészet mérete, a kutatási vagy termelési cél, valamint az óránként vagy naponta feldolgozandó sejtek térfogata alapvető tényezők az alkalmazásnak megfelelő ultrahangos sejtfeltáró kiválasztásában.
A Hielscher Ultrasonics különféle megoldásokat kínál több minta egyidejű ultrahangos kezelésére (akár 10 mintacső), valamint tömeges mintakezelésre (azaz mikrotiterlemezek / 96 lyukú lemezek), a klasszikus, szondás laboratóriumi ultrahangos kezelőkészülékektől, 50–400 watt közötti különböző teljesítményszintekkel, egészen a készülékenként akár 16 000watt teljesítményű, teljesen ipari ultrahangos processzorokig, üzemi sejtfeltáráshoz és nagyüzemi fehérjeextrakcióhoz. Minden Hielscher ultrahangos kezelőkészüléket teljes terhelés melletti 24/7/365 üzemre terveztek. Ultrahangos készülékeink alapvető jellemzői a robusztusság és a megbízhatóság.
Minden digitális ultrahangos homogenizátor intelligens szoftverrel, színes érintőkijelzővel és automatikus adatnaplózással rendelkezik, amelyek kényelmes munkaeszközzé teszik az ultrahangos készüléket a laboratóriumokban és a termelőlétesítményekben.
Tudassa velünk, milyen típusú sejteket, milyen térfogatban, milyen gyakran és milyen céllal kell feldolgoznia a biológiai mintákban. A folyamat követelményeinek leginkább megfelelő ultrahangos sejtfeltárót fogjuk ajánlani Önnek.

Az alábbi táblázat tájékoztatást nyújt ultrahangos rendszereink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról, a kompakt kézi homogenizátoroktól és többmintás ultrahangos kezelőkészülékektől az üzemi alkalmazásokhoz készült ipari ultrahangos processzorokig: