Biomérnöki sejtek ultrahangos lízise az ipari termelésben

A biotechnológiai technológiában széles körben használják a biotechnológiában az olyan biotechnológiai baktériumfajokat, mint az E. coli, valamint a genetikailag módosított emlős- és növényi sejttípusokat a molekulák expresszálására. Ezeknek a szintetizált biomolekuláknak a felszabadításához megbízható sejtzavar-technikára van szükség. A nagy teljesítményű ultrahangos kezelés bevált módszer a hatékony és megbízható sejtlízishez – Könnyen méretezhető nagy átviteli sebességre. A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos berendezéseket kínál a hatékony sejtlízishez annak érdekében, hogy nagy mennyiségű, kiváló minőségű biomolekulákat állítson elő.

Molekulák kivonása sejtgyárakból

A biomolekulák széles skálájának előállításához különböző mesterséges mikrobák és növényi sejtek használhatók mikrobiális sejtgyárakként, többek között az Escherichia coli, a Bacillus subtilis, a Pseudomonas putida, a Streptomyces, a Corynebacterium glutamicum, a Lactococcus lacti, a Cyanobacteria, a Saccharomyces cerevisiae, a Pichia pastoris, a Yarrowia lipolytica, a Nicotiana benthamiana és az algák. Ezek a sejtgyárak fehérjéket, lipideket, biokémiai anyagokat, polimereket, bioüzemanyagokat és olajkémiai anyagokat állíthatnak elő, amelyeket élelmiszerként vagy ipari alkalmazások nyersanyagaként használnak. A sejtgyárként használt sejteket zárt bioreaktorokban tenyésztik, ahol nagy hatékonyságot, specifitást és alacsony energiaigényt érhetnek el.
Ahhoz, hogy a célmolekulákat izoláljuk a biomódosított sejtkultúrákból, a sejteket meg kell szakítani, hogy az intracelluláris anyag felszabaduljon. Az ultrahangos sejtrombolók jól megalapozottak, mint rendkívül megbízható és hatékony technika a sejtek szétesésére és a vegyület felszabadítására.

A mikrobiális sejtgyárak metabolikusan módosított sejtek, amelyeket különböző értékes vegyületek szintézisére használnak. Az ultrahangos sejtbontás hatékony és megbízható módszer az értékes vegyületek felszabadítására a sejt belsejéből.tanulmány és grafika: ©Villaverde, 2010.

Az ultrahangos cellazavarók előnyei

Nem termikus, enyhe, mégis rendkívül hatékony technológiaként ultrahangos diszruptorokat használnak a laboratóriumokban és az iparban a sejtek lizálására és kiváló minőségű kivonatok előállítására, például molekulák izolálására a sejtgyárakból.

Teljesítmény-ultrahang a mikrobiális sejtgyárak hatékony megzavarásához

Az ultrahangos sejtzavarok mechanizmusa és hatásai:
Ultrasonic cell disruption used the power of ultrasound waves. The ultrasonic homogenizer? cell disruptor is equipped with a probe (aka sonotrode) made from titanium alloy that oscillates at a high frequency of approx. 20 kHz. This means the ultrasonic probe couples 20,000 vibrations per second into the sonicated liquid. The ultrasound waves coupled into the liquid are characterized by alternating high-pressure? low-pressure cycles. During a low pressure cycle, the liquid expands and minute vacuum bubbles arise. These very small bubbles grow over several alternating pressure cycles until they cannot absorb any further energy. At this point, the cavitation bubbles implode violently and create locally an extraordinary energy-dense environment. This phenomenon is known as acoustic cavitation and is characterized by locally very high temperatures, very high pressures and shear forces. These shear stresses break efficiently cell walls and increase mass transfer between the cell interior and the surrounding solvent. As a purely mechanical technique, ultrasonically generated shear forces are widely used and the recommended procedure for bacterial cell disruption, as well as for protein isolation. As a simple and rapid cell disruption method, sonication is ideal for the isolation of small, medium and large sized volumes. Hielscher’s digital ultrasonicators are equipped with a clear menu of settings for precise sonication control. All sonication data are automatically stored on a built-in SD-card and are simply accessible. Sophisticated options of heat dissipation such as external cooling, sonication in puls mode etc. during the ultrasonic disintegration process ensure the maintenance of the ideal process temperature and thereby the intactness of extracted heat-sensitive compounds.

A kutatás hangsúlyozza az ultrahangos sejtek megszakításának és kivonásának erősségeit

Prof. Chemat et al. (2017) resumes in their study that “ultrasound-assisted extraction is a green and economically viable alternative to conventional techniques for food and natural products. The main benefits are decrease of extraction and processing time, the amount of energy and solvents used, unit operations, and CO₂ emissions.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) used a high-pressure homogenizer and an ultrasonic cell dsintegrator in their study for the lysis of spores in order to release DNA. Comparing both cell disruption methods, the research team concludes that regarding the cell lysis for spore DNA, “analysis has been done by employing cell lysates from the high pressure homogenization. Afterwards, we realized that an ultrasonic cell disruption has outstanding advantages for this purpose. It is rather fast and can be processed for small sample volumes.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Élelmiszer-előállító sejtgyárakból származó biomolekulák

A mikrobiális sejtgyárak életképes és hatékony termelési módszertant jelentenek, amely mikrobiális organizmusokat használ a natív és nem natív metabolitok magas hozamának előállítására a mikrobiális mikroorganizmusok, például baktériumok, élesztők, gombák stb. metabolikus biomérnökségével. Az ömlesztett enzimeket például mikroorganizmusok, például Aspergillus oryzae, gombák és baktériumok felhasználásával állítják elő. Ezeket az ömlesztett enzimeket élelmiszer- és italgyártásban, valamint a mezőgazdaságban, a bioenergiában és a háztartási ellátásban használják.
Bizonyos baktériumok, mint például az Acetobacter xylinum és a Gluconacetobacter xylinus cellulózt termelnek a fermentációs folyamat során, ahol a nanoszálakat alulról felfelé irányuló folyamatban szintetizálják. A bakteriális cellulóz (más néven mikrobiális cellulóz) kémiailag egyenértékű a növényi cellulózzal, de nagyfokú kristályossággal és nagy tisztasággal rendelkezik (lignintől, hemicellulóztól, pektintől és más biogén komponensektől mentes), valamint egyedülálló szerkezete a cellulóz nanoszálas szövésű háromdimenziós (3D) hálós hálózat. (vö. Zhong, 2020) A növényi eredetű cellulózhoz képest a bakteriális cellulóz fenntarthatóbb, és az előállított cellulóz tiszta, nem igényel bonyolult tisztítási lépéseket. Az ultrahangos kezelés és az oldószeres extrakció NaOH vagy SDS (nátrium-dodecil-szulfát) alkalmazásával nagyon hatékony a bakteriális cellulóz baktériumsejtekből történő izolálására.

Gyógyszeripari és vakcinagyártási sejtgyárakból származó biomolekulák

A sejtgyárakból származó egyik legjelentősebb gyógyszeripari termék a humán inzulin. A biomódosított inzulin előállításához elsősorban E. coli-t és Saccharomyces cerevisiae-t használnak. Mivel a bioszintetizált nanoméretű molekulák magas biokompatibilitást kínálnak, a biológiai nanorészecskék, mint például a ferritin, előnyösek számos biogyártási alkalmazásban. Ezenkívül a metabolikusan módosított mikrobák termelése gyakran jelentősen hatékonyabb a kapott hozamokban. Például az artemizinsav, a resveratrol és a likopin termelése tízszeresére, több százszorosára nőtt, és már megalapozott vagy fejlesztés alatt áll az ipari méretű termelésre. (vö. Liu et al.; Mikrob. Cell tény. 2017)
Például az önszerveződő tulajdonságokkal rendelkező fehérjealapú nanoméretű biomolekulák, mint például a ferritin és a vírusszerű részecskék különösen érdekesek a vakcinafejlesztés szempontjából, mivel utánozzák a kórokozók méretét és szerkezetét, és alkalmasak az antigének felületi konjugációjára az immunsejtekkel való kölcsönhatás elősegítése érdekében. Az ilyen molekulák úgynevezett sejtgyárakban expresszálódnak (pl. mesterséges E. coli törzsek), amelyek egy bizonyos célmolekulát termelnek.

Protokoll ultrahangos lízishez és E. coli BL21 ferritin felszabadulásához

A ferritin egy fehérje, amelynek elsődleges funkciója a vas tárolása. A ferritin ígéretes képességeket mutat önszerveződő nanorészecskékként a vakcinákban, ahol vakcinaszállító anyagként használják (pl. SARS-Cov-2 tüskefehérjék). Sun et tudományos kutatása. al. (2016) azt mutatja, hogy a rekombináns ferritin oldható formában szabadulhat fel az Escherichia coli-ból alacsony NaCl koncentrációban (≤50 mmol/l). A ferritin E. coli BL21-ben történő expresszálására és a ferrtin felszabadítására a következő protokollt sikeresen alkalmaztuk. A rekombináns pET-28a/ferritin plazmidot E coli BL21 (DE3) törzsgé alakítottuk át. A ferritin E coli BL21 (DE3) sejteket LB növekedési táptalajban 0,5% kanamicinnel tenyésztettük 37°C-on, majd 0,6-os OD600-on 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranoziddal indukáltuk 3 órán át 37°C-on. A végső tenyészetet ezután 8000 g-os centrifugálással 10 percig 4 °C-on gyűjtöttük be, és a pelletet összegyűjtöttük. Ezután a pelletet LB táptalajban (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% élesztőkivonat)/lízispufferben (20 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,6) és különböző koncentrációjú NaCl-oldatban (0, 50, 100, 170 és 300 mmol/l) szuszpendáltuk. A bakteriális sejtlízishez ultrahangos kezelést alkalmaztunk impulzus módban: pl. a Ultrahangos UP400St 100%-os amplitúdóval, 5 másodperces bekapcsolási, 10 másodperces kikapcsolási ciklussal, 40 cikluson keresztül), majd 10 000 g-vel centrifugálva 15 percig 4 °C-on. A felülúszót és a csapadékot nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemeztük. Az összes nátrium-dodecil-szulfáttal festett gélt nagy felbontású szkennerrel szkenneltük. A gélképeket a Magic Chemi 1D szoftver segítségével elemeztük. Az optimális tisztaság érdekében a fehérjesávokat a paraméterek beállításával detektáltuk. A sávokra vonatkozó adatok technikai hármasokból származnak. (vö. Sun et al., 2016)

Ultrahangos sejtrombolók a sejtgyárak ipari líziséhez

Az ultrahangos lízis és extrakció megbízható és kényelmes módszer a metabolitok felszabadítására a sejtgyárakból, ezáltal segítve a célmolekulák hatékony előállítását. Az ultrahangos sejtzavarók laboratóriumtól ipari méretig állnak rendelkezésre, és a folyamatok teljesen lineárisan méretezhetők.
A Hielscher Ultrasonics az Ön kompetens partnere a nagy teljesítményű ultrahangos zavaróknak, és hosszú távú tapasztalattal rendelkezik az ultrahangos rendszerek asztali és ipari környezetben történő beültetése területén.
Amikor a kifinomult hardverről és szoftverről van szó, a Hielscher Ultrasonics cellazavaró rendszerek megfelelnek az optimális folyamatszabályozás, az egyszerű kezelhetőség és a felhasználóbarátság minden követelményének. Az ügyfelek és a felhasználók a Hielscher ultrasonicators értékelik azt az előnyt, hogy a Hielscher ultrahangos cella-diszruptorok és elszívók lehetővé teszik a pontos folyamatfelügyeletet és -ellenőrzést – digitális érintőképernyőn és böngészős távirányítón keresztül. Minden fontos szonikációs adat (pl. nettó energia, teljes energia, amplitúdó, időtartam, hőmérséklet, nyomás) automatikusan tárolódik CSV fájlként egy integrált SD-kártyán. Ez segít reprodukálható és megismételhető eredmények elérésében, és megkönnyíti a folyamatok szabványosítását, valamint a helyes gyártási gyakorlat (cGMP) teljesítését.
Természetesen a Hielscher ultrahangos processzorok teljes terhelés alatt 24/7 működésre épülnek, és ezért megbízhatóan működtethetők ipari termelési környezetben. A nagy robusztusság és az alacsony karbantartás miatt az ultrahangos berendezés állásideje nagyon alacsony. A CIP (clean-in-place) és SIP (sterilize-in-place) funkciók minimalizálják a fáradságos tisztítást, különösen azért, mert minden nedves alkatrész sima fémfelület (nincsenek rejtett nyílások vagy fúvókák).

Az alábbi táblázat jelzi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását: