Biotechnológiailag módosított sejtek ultrahangos lízise az ipari termelésben

A biotechnológiailag módosított baktériumfajokat, például az E. coli-t, valamint a genetikailag módosított emlős- és növényi sejttípusokat széles körben használják a biotechnológiában molekulák expressziójára. E szintetizált biomolekulák felszabadításához megbízható sejtfeltárási technikára van szükség. A nagy teljesítményű ultrahangos kezelés az eredményes és megbízható sejtlízis bevált módszere – könnyen méretezhető nagy feldolgozási teljesítményre. A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos berendezéseket kínál az eredményes sejtlízishez, hogy nagy mennyiségű, kiváló minőségű biomolekulát állíthasson elő.

Molekulák kinyerése sejtgyárakból

A biomolekulák széles körének előállításához különféle módosított mikrobák és növényi sejtek használhatók mikrobiális sejtgyárként, többek között Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cianobaktériumok, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana és algák. Ezek a sejtgyárak fehérjéket, lipideket, biokémiai anyagokat, polimereket, bioüzemanyagokat és oleokémiai anyagokat állíthatnak elő, amelyeket élelmiszerként vagy ipari alkalmazások alapanyagaként használnak. A sejtgyárként használt sejteket zárt bioreaktorokban tenyésztik, ahol nagy hatékonyságot, specificitást és alacsony energiaigényt érhetnek el.
A célmolekulák biotechnológiailag módosított sejttenyészetekből történő izolálásához a sejteket fel kell tárni, hogy a sejten belüli anyagok felszabaduljanak. Az ultrahangos sejtfeltáró készülékek alkalmazása jól bevált, rendkívül megbízható és hatékony technika a sejtek szétesésének előidézésére és a vegyületek felszabadítására.

A mikrobiális sejtgyárak anyagcsere-mérnöki módszerekkel módosított sejtek, amelyeket különféle értékes vegyületek szintézisére használnak. Az ultrahangos sejtfeltárás hatékony és megbízható módszer az értékes vegyületek sejtek belsejéből történő felszabadítására.
tanulmány és ábra: ©Villaverde, 2010.

Az ultrahangos sejtfeltáró készülékek előnyei

Nem termikus, kíméletes, ugyanakkor rendkívül hatékony technológiaként az ultrahangos sejtfeltáró készülékeket laboratóriumokban és az iparban sejtek lízisére és kiváló minőségű kivonatok előállítására használják, például molekulák sejtgyárakból történő izolálásához.

Nagy intenzitású ultrahang a mikrobiális sejtgyárak hatékony feltárásához

Az ultrahangos sejtfeltáró készülékek működési mechanizmusa és hatásai:
Az ultrahangos sejtfeltárás az ultrahanghullámok erejét használja. Az ultrahangos homogenizátor / sejtfeltáró készülék titánötvözetből készült szondával (más néven szonotródával) van felszerelve, amely nagy, körülbelül 20 kHz frekvencián rezeg. Ez azt jelenti, hogy az ultrahangos szonda másodpercenként 20 000 rezgést csatol be az ultrahangosan kezelt folyadékba. A folyadékba becsatolt ultrahanghullámokat váltakozó nagy nyomású / kis nyomású ciklusok jellemzik. A kis nyomású ciklus során a folyadék kitágul, és parányi vákuumbuborékok keletkeznek. Ezek a nagyon kicsi buborékok több váltakozó nyomáscikluson át növekednek, amíg már nem képesek további energiát elnyelni. Ekkor a kavitációs buborékok hevesen összeomlanak, és helyileg rendkívüli energiasűrűségű környezetet hoznak létre. Ezt a jelenséget akusztikus kavitációnak nevezik, és helyileg nagyon magas hőmérsékletek, nagyon nagy nyomások és nyíróerők jellemzik. Ezek a nyírófeszültségek hatékonyan felszakítják a sejtfalakat, és fokozzák az anyagátadást a sejt belseje és a környező oldószer között. Tisztán mechanikai technikaként az ultrahanggal létrehozott nyíróerők alkalmazása széles körben elterjedt és ajánlott eljárás a baktériumsejtek feltárására, valamint a fehérjék izolálására. Egyszerű és gyors sejtfeltárási módszerként az ultrahangos kezelés ideális kis, közepes és nagy térfogatokból történő izoláláshoz. A Hielscher digitális ultrahangos készülékei áttekinthető beállítási menüvel rendelkeznek az ultrahangos kezelés pontos szabályozásához. Az ultrahangos kezelés minden adata automatikusan egy beépített SD-kártyán tárolódik, és egyszerűen hozzáférhető. Az ultrahangos sejtfeltárás során alkalmazható kifinomult hőelvezetési lehetőségek, például a külső hűtés, az impulzusüzemű ultrahangos kezelés stb. biztosítják az ideális folyamathőmérséklet fenntartását, és ezáltal a kinyert hőérzékeny vegyületek épségét.

A kutatások alátámasztják az ultrahangos sejtfeltárás és extrakció erősségeit

Chemat professzor és munkatársai (2017) tanulmányukban összefoglalják, hogy „az ultrahanggal segített extrakció környezetbarát és gazdaságilag életképes alternatívája az élelmiszerek és természetes termékek feldolgozására alkalmazott hagyományos technikáknak. Fő előnyei az extrakciós és feldolgozási idő, a felhasznált energia és oldószerek mennyisége, a műveleti egységek száma, valamint a CO₂ -kibocsátás csökkenése.”
Gabig-Ciminska és munkatársai (2014) tanulmányukban nagynyomású homogenizátort és ultrahangos sejtfeltáró készüléket használtak spórák lízisére a DNS felszabadítása érdekében. A két sejtfeltárási módszert összehasonlítva a kutatócsoport a spórák DNS-ének kinyerését célzó sejtlízissel kapcsolatban arra a következtetésre jutott, hogy „az elemzést nagynyomású homogenizálásból származó sejtlizátumok felhasználásával végeztük. Ezt követően felismertük, hogy az ultrahangos sejtfeltárás kiemelkedő előnyökkel jár e célra. Meglehetősen gyors, és kis mintatérfogatok esetén is alkalmazható.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Sejtgyárakból származó biomolekulák az élelmiszer-termeléshez

A mikrobiális sejtgyárak életképes és hatékony termelési módszert jelentenek, amely mikrobiális szervezeteket használ a rájuk jellemző és tőlük idegen metabolitok nagy hozamú előállítására, mikroorganizmusok, például baktériumok, élesztők, gombák stb. anyagcseréjének biotechnológiai módosításával. Nagy mennyiségben előállított enzimeket például olyan mikroorganizmusokkal termelnek, mint az Aspergillus oryzae, a gombák és a baktériumok. Ezeket a nagy mennyiségben előállított enzimeket élelmiszer- és italgyártásban, valamint a mezőgazdaságban, a bioenergia-termelésben és a háztartási tisztításban használják.
Bizonyos baktériumok, például az Acetobacter xylinum és a Gluconacetobacter xylinus, a fermentációs folyamat során cellulózt termelnek, amelynek nanoszálai alulról felfelé építkező folyamatban szintetizálódnak. A bakteriális cellulóz (más néven mikrobiális cellulóz) kémiailag egyenértékű a növényi cellulózzal, azonban nagy kristályossági fokkal és nagy tisztasággal rendelkezik (lignintől, hemicellulóztól, pektintől és más biogén összetevőktől mentes), továbbá cellulóz-nanoszálakból szőtt, háromdimenziós (3D) hálós szerkezete egyedülálló. (cf. Zhong, 2020) A növényi eredetű cellulózhoz képest a bakteriális cellulóz fenntarthatóbb, és az előállított cellulóz tiszta, így nem igényel összetett tisztítási lépéseket. Az ultrahangos kezelés és a NaOH-val vagy SDS-sel (nátrium-dodecil-szulfáttal) végzett oldószeres extrakció nagyon hatékony a bakteriális cellulóz baktériumsejtekből történő izolálására.

Sejtgyárakból származó biomolekulák a gyógyszer- és vakcinagyártáshoz

A sejtgyárakból származó egyik legjelentősebb gyógyszeripari termék a humán inzulin. Az inzulin biotechnológiai előállításához elsősorban E. coli-t és Saccharomyces cerevisiae-t használnak. Mivel a bioszintézissel előállított nanoméretű molekulák nagy biokompatibilitást mutatnak, a biológiai nanorészecskék, például a ferritin, számos biológiai gyártási alkalmazásban előnyösek. Ezenkívül az anyagcsere-mérnöki módszerekkel módosított mikrobákkal végzett termelés az elért hozamokat tekintve gyakran lényegesen eredményesebb. Például az artemizinsav, a rezveratrol és a likopin termelése tízszeresére–több százszorosára nőtt, és ipari léptékű előállításuk már megvalósult, vagy fejlesztés alatt áll. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Például az önszerveződő tulajdonságokkal rendelkező, fehérjealapú, nanoméretű biomolekulák, mint a ferritin és a vírusszerű részecskék, különösen érdekesek a vakcinafejlesztés szempontjából, mivel a kórokozók méretét és szerkezetét egyaránt utánozzák, és felületükre antigének kapcsolhatók az immunsejtekkel való kölcsönhatás elősegítésére. Az ilyen molekulákat úgynevezett sejtgyárakban (például módosított E. coli-törzsekben) expresszálják, amelyek egy meghatározott célmolekulát termelnek.

Az E. coli BL21 ultrahangos lízisének protokollja a ferritin felszabadításához

A ferritin olyan fehérje, amelynek elsődleges funkciója a vas tárolása. A ferritin ígéretes lehetőségeket mutat önszerveződő nanorészecskeként a vakcinákban, ahol vakcinahordozóként használják (például SARS-Cov-2 tüskefehérjékhez). Sun és munkatársai (2016) tudományos kutatása azt mutatja, hogy a rekombináns ferritin alacsony NaCl-koncentrációknál (≤50 mmol/L) oldható formában szabadítható fel Escherichia coli-ból. A ferritin E. coli BL21-ben történő expressziójához és felszabadításához sikeresen alkalmazták a következő protokollt. A rekombináns pET-28a/ferritin plazmidot transzformációval bevitték az E coli BL21 (DE3) törzsbe. A ferritint termelő E coli BL21 (DE3) sejteket 0,5% kanamicint tartalmazó LB tápközegben tenyésztették 37°C-on, majd 0,6 OD600 értéknél 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranoziddal indukálták 3 órán át, 37°C-on. A végső tenyészetet ezután 8000g mellett, 10 percig, 4°C-on végzett centrifugálással gyűjtötték be, és összegyűjtötték a pelletet. Ezután a pelletet LB tápközegben (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% élesztőkivonat)/lízispufferben (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6), illetve különböző koncentrációjú NaCl-oldatokban (0, 50, 100, 170 és 300 mmol/L) szuszpendálták újra. A baktériumsejtek líziséhez impulzusüzemű ultrahangos kezelést alkalmaztak: például az UP400St ultrahangos készülékkel 100% amplitúdón, 5 másodperc BE, 10 másodperc KI munkaciklussal, 40 cikluson át), majd 10 000g mellett, 15 percig, 4°C-on centrifugálták. A felülúszót és a csapadékot nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemezték. Minden nátrium-dodecil-szulfáttal festett gélt nagy felbontású szkennerrel digitalizáltak. A gélképeket a Magic Chemi 1D szoftverrel elemezték. Az optimális láthatóság érdekében a fehérjesávokat a paraméterek beállításával detektálták. A sávok adatait három technikai ismétlésből állították elő. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrahangos sejtfeltáró készülékek a sejtgyárak ipari líziséhez

Az ultrahangos lízis és extrakció megbízható és kényelmes módszer a metabolitok sejtgyárakból történő felszabadítására, ezáltal elősegítve a célmolekulák eredményes termelését. Az ultrahangos sejtfeltáró készülékek laboratóriumi mérettől ipari méretig elérhetők, és a folyamatok teljesen lineárisan méretezhetők.
A Hielscher Ultrasonics az Ön szakértő partnere a nagy teljesítményű ultrahangos sejtfeltáró készülékek területén, és hosszú ideje rendelkezik tapasztalattal az ultrahangos rendszerek asztali és ipari környezetben történő telepítésében.
A fejlett hardver és szoftver tekintetében a Hielscher Ultrasonics sejtfeltáró rendszerei teljesítik az optimális folyamatszabályozás, a könnyű kezelés és a felhasználóbarát működés minden követelményét. A Hielscher ultrahangos készülékek vásárlói és felhasználói értékelik azt az előnyt, hogy a Hielscher ultrahangos sejtfeltáró és extrakciós készülékei lehetővé teszik a folyamat pontos felügyeletét és szabályozását – digitális érintőkijelzőn és böngészős távvezérlésen keresztül. Az ultrahangos kezelés minden fontos adata (például nettó energia, összenergia, amplitúdó, időtartam, hőmérséklet, nyomás) automatikusan CSV-fájlként tárolódik egy beépített SD-kártyán. Ez segíti a reprodukálható és megismételhető eredmények elérését, valamint megkönnyíti a folyamat szabványosítását és a helyes gyártási gyakorlat (cGMP) követelményeinek teljesítését.
A Hielscher ultrahangos processzorokat természetesen teljes terhelés mellett végzett 24/7 üzemre tervezték, ezért megbízhatóan működtethetők ipari termelési környezetben. A nagy strapabírásnak és az alacsony karbantartási igénynek köszönhetően az ultrahangos berendezések állásideje valóban rövid. A CIP (helyben történő tisztítás) és SIP (helyben történő sterilizálás) funkciók minimálisra csökkentik a munkaigényes tisztítást, különösen azért, mert minden folyadékkal érintkező alkatrész sima fémfelületű (nincsenek rejtett nyílások vagy fúvókák).

Az alábbi táblázat tájékoztatást ad ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról: