A biomérnöki baktériumfajokat, mint például az E. coli, valamint a genetikailag módosított emlős- és növényi sejttípusokat széles körben használják a biotechnológia területén a molekulák expresszésére. Ezeknek a szintetizált biomolekuláknak a felszabadításához megbízható sejtmegszakítási technikára van szükség. A nagy teljesítményű ultrahangos kezelés bevált módszer a hatékony és megbízható sejtlízisre – könnyen méretezhető nagy átviteli sebességre. A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos berendezéseket kínál a hatékony sejtlízishez annak érdekében, hogy nagy mennyiségű kiváló minőségű biomolekulát termeljen.

Molekulák kivonása a sejtgyárakból

A biomolekulák széles skálájának előállításához különböző mesterséges mikrobák és növényi sejtek használhatók mikrobiális sejtgyárként, beleértve az Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana és algák, többek között. Ezek a sejtgyárak fehérjéket, lipideket, biokémiai anyagokat, polimereket, bioüzemanyagokat és oleokémiai anyagokat termelhetnek, amelyeket élelmiszerként vagy nyersanyagként használnak ipari alkalmazásokhoz. A sejtgyárként használt sejtek zárt bioreaktorokban tenyésztik, ahol nagy hatékonyságot, specificitást és alacsony energiaigényt érhetnek el.
Ahhoz, hogy elkülönítsék a célmolekulákat a biomérnöki sejtkultúráktól, a sejteket meg kell szakítani, hogy az intracelluláris anyag felszabaduljon. Ultrahangos sejt diszruptorok jól megalapozott, mint rendkívül megbízható és hatékony technika a sejtek szétesése és összetett felszabadulását.

A mikrobiális sejtgyárak metabolikusan megtervezett sejtek, amelyeket különböző értékes vegyületek szintézisére használnak. Ultrahangos sejt zavar egy hatékony és megbízható módszer, hogy kiadja az értékes vegyületek a sejt belsejében.
tanulmány és grafika: ©Villaverde, 2010.

Az ultrahangos sejtrombolók előnyei

Nem termikus, enyhe, mégis rendkívül hatékony technológiaként ultrahangos diszruptorokat használnak a laboratóriumban és az iparban a sejtek dübúzására és kiváló minőségű kivonatok előállítására, például a molekulák sejtgyárakból való izolálására.

Teljesítmény-ultrahang a mikrobiális sejtgyárak hatékony megzavarásához

Az ultrahangos sejtrombolók mechanizmusa és hatásai:
Az ultrahangos sejtzavar az ultrahang hullámok erejét használta. Az ultrahangos homogenizáló / sejtromboló titánötvözetből készült szonda (más néven sonotrode) van felszerelve, amely kb. 20 kHz-es magas frekvencián oszcillál. Ez azt jelenti, hogy az ultrahangos szonda másodpercenként 20 000 rezgést párosít a szonikált folyadékba. A folyadékhoz kapcsolt ultrahanghullámokat váltakozó nagynyomású / alacsony nyomású ciklusok jellemzik. Alacsony nyomású ciklus során a folyadék kitágul, és apró vákuumbuborékok keletkeznek. Ezek a nagyon kis buborékok több váltakozó nyomáscikluson keresztül nőnek, amíg nem tudnak további energiát elnyelni. Ezen a ponton a kavitációs buborékok hevesen összeomlik, és helyileg rendkívüli energia-sűrű környezetet hoznak létre. Ezt a jelenséget akusztikus kavitációnak nevezik, és helyileg nagyon magas hőmérséklet, nagyon magas nyomás és nyíróerők jellemzik. Ezek a nyírási feszültségek hatékonyan megtörik a sejtfalakat, és növelik a tömegátvitelt a sejtbelső és a környező oldószer között. Tisztán mechanikai technikaként széles körben használják az ultrahanggal generált nyíró erőket, és az ajánlott eljárást a bakteriális sejtek megzavarására, valamint a fehérje izolációra. Egyszerű és gyors sejtmegszakítási módszerként a szonikálás ideális a kis, közepes és nagy térfogatok elkülönítésére. A Hielscher digitális ultrasonicators világos menüvel vannak felszerelve a pontos szonikálás vezérléséhez. Az összes szonikálási adat automatikusan tárolódik egy beépített SD-kártyán, és egyszerűen elérhető. Kifinomult lehetőségek hőelvezetés, mint például a külső hűtés, szonikálás puls módban, stb során ultrahangos szétesés folyamat biztosítja a fenntartása az ideális folyamat hőmérséklet és ezáltal az épség kivont hőérzékeny vegyületek.

A kutatás hangsúlyozza az ultrahangos sejtmegszakítás és extrakció erősségeit

Chemat et al. (2017) professzor tanulmányában folytatja, hogy "az ultrahanggal támogatott extrakció zöld és gazdaságilag életképes alternatívája az élelmiszerek és a természetes termékek hagyományos technikáinak. A fő előnyök a kitermelési és feldolgozási idő csökkenése, a felhasznált energia és oldószerek mennyisége, az egységműveletek és a CO₂ kibocsátásokat."
Gabig-Ciminska et al. (2014) nagynyomású homogenizátort és ultrahangos sejtdifertőtlenítőt használt a spórák lízisére irányuló tanulmányukban a DNS felszabadítása érdekében. A két sejtmegszakítási módszer összehasonlításával a kutatócsoport arra a következtetésre jut, hogy a spóra DNS sejtlízisével kapcsolatban "az elemzést a nagynyomású homogenizációból származó sejti lysates alkalmazásával végezték. Ezt követően rájöttünk, hogy az ultrahangos sejtmegszakadásnak kiemelkedő előnyei vannak erre a célra. Elég gyors, és kis mintamennyiségek esetén feldolgozható." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekulák az élelmiszer-termeléshez szolgáló sejtgyárakból

A mikrobiális sejtgyárak életképes és hatékony termelési módszerek mikrobiális organizmusok felhasználásával, hogy magas hozamú natív és nem natív metabolitokat hozzanak létre a mikrobiális mikroorganizmusok, például baktériumok, élesztők, gombák stb. metabolikus bio-tervezésével. Az ömlesztett enzimeket például auch aspergillus oryzae, gombák és baktériumok mikroorganizmusai segítségével állítják elő. Ezeket az ömlesztett enzimeket élelmiszer- és italgyártásra, valamint a mezőgazdaságra, a bioenergiára és a háztartási ellátásra használják.
Bizonyos baktériumok, mint például az Acetobacter xylinum és a Glükonacetobacter xylinus cellulózt termelnek az erjesztési folyamat során, ahol a nanoszálakat alulról felfelé szintetizálják. A bakteriális cellulóz (más néven mikrobiális cellulóz) kémiailag egyenértékű a növényi cellulózzal, de nagyfokú kristályossággal és nagy tisztaságú (lignintől, hemicellulóztól, pektintől és más biogén összetevőktől mentes), valamint a cellulóz nanoszálú szövésű háromdimenziós (3D) retikulált hálózat egyedülálló szerkezete. (vö. Zhong, 2020) A növényi eredetű cellulózhoz képest a bakteriális cellulóz fenntarthatóbb, és az előállított cellulóz tiszta, nem igényel komplex tisztítási lépéseket. Az ultrahangos kezelés és az oldószer extrakciója NaOH vagy SDS (nátrium-dodekil-szulfát) segítségével nagyon hatékony a bakteriális cellulóz izolálására a bakteriális sejtekből.

Biomolekulák a gyógyszer- és vakcinagyártáshoz szolgáló sejtgyárakból

A sejtgyárakból származó egyik legjelentősebb gyógyszerkészítmény a humán inzulin. A biomérnöki inzulin előállításához elsősorban E. coli-t és Saccharomyces cerevisiae-t alkalmaznak. Mivel a bioszintizált nanoméretű molekulák nagy biokompatibilitást kínálnak, a biológiai nanorészecskék, mint például a ferritin, számos biomanufaktúrás alkalmazás számára előnyösek. Ezenkívül az anyagcsere-tervezésű mikrobák termelése gyakran jelentősen hatékonyabb a kapott hozamokban. Például az artemisinic sav, a resveratrol és a likopin termelése tízszeresére, több százszorosára nőtt, és már létrejött vagy fejlesztés alatt áll az ipari méretű termelésre. (vö. Liu és mtsai.; Microb. Sejt tény. 2017)
Például az önszerveződő tulajdonságokkal rendelkező fehérjealapú nanoméretű biomolekulák, mint például a ferritin és a vírusszerű részecskék különösen érdekesek a vakcinafejlesztés szempontjából, mivel a kórokozók méretét és szerkezetét utánozzák, és képesek az antigének felszíni konjugációjára az immunsejtekkel való kölcsönhatás elősegítése érdekében. Az ilyen molekulákat úgynevezett sejtgyárakban (pl. mesterséges E. coli törzsekben) fejezik ki, amelyek egy bizonyos célmolekulát termelnek.

Protokoll ultrahangos lízis és az E. coli BL21 Ferritin Release

A ferritin egy fehérje, amelynek elsődleges funkciója a vas tárolása. A ferritin ígéretes képességeket mutat a vakcinákban lévő nanorészecskék önszerveződéseként, ahol vakcinaszállító járműként használják (pl. SARS-Cov-2 tüskés fehérjék). A Sun et tudományos kutatása. al. (2016) azt mutatja, hogy a rekombináns ferritin oldható formában szabadulhat fel az Escherichia coli-ból alacsony NaCl koncentrációban (≤50 mmol / l). A ferritin E. coli BL21-ben történő kifejezése és a ferrtin felszabadítása érdekében a következő protokollt alkalmazták sikeresen. A rekombináns pET-28a/ferritin plazmidot E coli BL21 (DE3) törzské alakították át. A ferritin E coli BL21 (DE3) sejteket LB növekedési közegben tenyésztették 0,5% kanamicinnel 37 °C-on, és 0,6-os OD600-on indukálták 0,4% izopropil-β-D-tiogalactopyranoside-val 3 órán keresztül 37 ° C-on. A végső tenyészetet centrifugálással 8000 g-on 10 percig 4 °C-on szüretelték, és a pelletet összegyűjtötték. Ezután a pelletet LB közegben (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% élesztőkivonat)/lízis pufferben (20 mmol/l Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) és a NaCl oldat különböző koncentrációiban (0, 50, 100, 170 és 300 mmol/l) újra felszuszukták. Bakteriális sejtlízis esetén szonikálást alkalmaztak impulzus üzemmódban: pl. ultrasonicator UP400St 100%-os amplitúdónál 5 másodperces menetciklussal, 10 másodperces kikapcsolással, 40 cikluson keresztül), majd 10 000 g-on 15 percig centrifugáljuk 4 °C-on. A felülúszót és a csapadékot nátrium-dodekil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) elemeztük. Minden nátrium-dodekil-szulfát-festett gélt nagy felbontású szkennerrel szkenneltek. A gél képeket Magic Chemi 1D szoftverrel elemezték. Az optimális tisztaság érdekében a fehérjesávokat a paraméterek beállításával észlelték. A sávok adatait technikai háromlábúakból hozták létre. (vö. Sun et al., 2016)

Ultrahangos sejtrombolók a sejtgyárak ipari líziséhez

Ultrahangos lízis és extrakció egy megbízható és kényelmes módszer, hogy felszabadítsa metabolitok sejtgyárak ezáltal segíti a hatékony termelés célmolekulák. Ultrahangos sejtrombolók állnak rendelkezésre a labortól az ipari méretig, és a folyamatok teljesen lineárisak lehetnek.
Hielscher Ultrasonics az Ön kompetens partnere a nagy teljesítményű ultrahangos diszruptorok és hosszú távú tapasztalattal rendelkezik a beültetés ultrahangos rendszerek pad-top és ipari beállításokat.
Amikor a kifinomult hardver és szoftver, Hielscher Ultrasonics sejt zavar rendszerek megfelelnek minden követelményt az optimális folyamatvezérlés, könnyű működés és a felhasználóbarátság. A Hielscher ultrasonicators ügyfelei és felhasználója értékelik azt az előnyt, hogy a Hielscher ultrahangos sejtrombolók és extraktorok lehetővé teszik a pontos folyamatfelügyeletet és ellenőrzést – digitális érintőképernyőn és böngésző távirányítón keresztül. Minden fontos szonikálási adat (pl. nettó energia, teljes energia, amplitúdó, időtartam, hőmérséklet, nyomás) automatikusan CSV fájlként tárolódik egy integrált SD-kártyán. Ez segít a reprodukálható és megismételhető eredmények elérésében, és megkönnyíti a folyamat szabványosítását, valamint a helyes gyártási gyakorlatok (cGMP) teljesítését.
Természetesen a Hielscher ultrahangos processzorok 24/7-es működésre épülnek teljes terhelés mellett, és ezért megbízhatóan működtethetők ipari termelési környezetben. A nagy robusztusság és az alacsony karbantartás miatt az ultrahangos berendezés állásideje nagyon alacsony. A CIP (clean-in-place) és a SIP (steril-in-place) minimális munkaigényes tisztítást tartalmaz, különösen azért, mert minden nedves alkatrész sima fémfelület (nincs rejtett nyílás vagy fúvóka).

Az alábbi táblázat az ultrahangos készülékek hozzávetőleges feldolgozási kapacitását jelzi: